Approches de transfection et Outils de transgénèse en génomique fonctionnelle chez les mammifères. F. Rassendren

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1 Approches de transfection et Outils de transgénèse en génomique fonctionnelle chez les mammifères F. Rassendren

2 La transfection (ou transfert de gènes) = Introduction d'adn "étranger" dans une cellule eucaryote Intérêt pour l'étude de : Expression des gènes et régulation Mécanismes de la transcription : séquences régulatrices en cis (promoteurs etc ); maturation et stabilité des ARNm Mécanismes et séquences impliquées dans régulation Localisation et adressage des protéines Fonction des produits de gènes (gain ou perte de fonction) Analyse de régions ADN non-codantes d'intérêt pour la cellule..

3 La transfection Peut être : Homologue ou hétérologue Transitoire ou stable Episomique ou intégrative Inductible ou non Méthodes :

4 Technique de transfection la plus utilisée = électroporation Volts pendant < 1ms Mortalité immédiate > 50 % Par ex. pour transfection intégrative (sélection) : 10 µg d'adn de vecteur nécessaires (versus µg en épisomique) Efficacité de transformation : Sélection obligatoire (pression AB) +++ Mortalité secondaire +++ à Long (mais moins que la souris!?)

5 A. Transfection transitoire Flag tag Forcément vecteur épisomique GFP Surtout utilisée pour étude séquences régulatrices Gène rapporteur ( ou gène d'intérêt "taggé") Étude de l'expression pdt h (car "dilution" du plasmide) Pas de sélection Vecteur assez simple : clonage du gène et des séquences régulatrices permettant son expression (PCR sur ADN génomique, ou ADNc, ou restriction) Trouver le bon rapporteur! (mesure par techniques svt biochimiques) CAT, GUS (glucuronidase), beta-galactosidase, luciférase, GFP Pb : efficacité très variable et pas de sélection contrôler l'efficacité de la transfection (par ex. par transfection avec un 2ème gène exprimé de façon constitutive)

6 Construction des vecteurs ; séquences régulatrices Génome 5 : contient région promotrice et site épissage 3 : contient éléments et site de polyadénylation Gène A AAA AG AAA AG DHFR-TS Gène C AAA Vecteurs 5 3' AAA AG CAT AAA AG Plasmide Longueurs minimales des régions 5' et 3 chez Leishmania= pb

7 Étude des mécanismes de la transcription, maturation ARNm... Etude de la régulation de l'expression génique Etude de l'adressage des protéines?

8 B. Transfection stable = transfert d ADN transmissible à la "descendance" soit épisomique (plasmide auto-réplicatif) soit intégrative (insertion dans le génome par recombinaison homologue +++) Aspects techniques généraux : Clonage du gène d'intérêt Construction du vecteur de transfection (séquences régulatrices 5' et 3' et séquences recombinantes si intégration) Vérifications +++ : PCR et séquençages assez long!! 1 vecteur spécifique pour chaque expérimentation

9 B.1. Transfection stable épisomique OK chez Leishmania mais pas chez Trypanosoma Marqueur de sélection +++ de ç eucaryote (en + du gène inséré) Stabilité des plasmides dépend de la pression AB + Amplification possible du plasmide en pression AB (?) Insérer séquences régulatrices (5 et 3 ) pour chacun des gènes? Quels marqueurs de sélection? Résistance à des antibiotiques (qui marchent!) : - neo R - hyg R - phleo R - puro R

10 Vecteur plasmidique pour expression épisomique "Cassette de clonage" Séquence d intérêt 5 insert 3 Gène de 3 sélection dans ç eucaryote : HYG R PUR R BLA R NEO R 5 sites de clonage (polylinker ou non) ori Amp R Gène de sélection dans bactérie - Construction du vecteur par étapes successives : clonage du gène R, 5', 3, tag (amorces PCR t sites --> digestion --> purification --> ligation) - Clonage du gène d intérêt = «cassette de clonage» - Insertion dans le vecteur (contenant éventuellement un tag en plus) - transformation de E. coli --> minipreps --> digestion pour linéariser --> transfection

11 Expression d une protéine native Expression d une protéine mutée Expression d une protéine couplée GFP N-terminal ou C-terminal Cassette de clonage Gène d intérêt 5 3 Gène d intérêt muté 5 3 ou tronqué 5 3 Gène d intérêt 5 GFP 3 Gène d intérêt 5 GFP 3 Objectif Sur-expression simple Exploration domaines fonctionnels (perte de fonction) Localisation subcellulaire directe Expression d une protéine couplée à un autre tag Gène d intérêt 5 TAG 3 Selon le tag : - Localisation indirecte (cmyc) - Purification (Hisx6) - Co-IP

12 Outils de transgénèse en génomique fonctionnelle chez les mammifères Utilisation des outils de génétique moléculaires pour manipuler le patrimoine génétique d organismes vivants. étudier les mécanismes de régulation de l expression génique; manipuler l expression de gènes; analyser la fonction de gènes;

13 PRINCIPES DE BASE Manipulation de l expression d un gène et passage du transgène à la descendance intégration aléatoire (surexpression) intégration ciblée (inactivation, mutation) nouvelles approches (Zinc Finger Nucleases) Trois acteurs principaux: l espèce le promoteur le gène La nature de la question posée détermine le choix des ces acteurs

14 Choix du modèle animal Au sens large, la transgénèse est possible dans différentes espèces animales C. Elegans, Drosophile, Zebra fish, Xénope sont surtout utilisés pour étudier le développement, mais elles ont des limitations évidentes. Avantages: développement rapide, outils génétiques puissants. Désavantages: pas/peu de technique d inactivation, modèles peu transposables à l homme. Les modèles mammifères (souris, rat et autres mammifères) Avantages: avantage des modèles mammifères; inactivation génique Désavantages: techniquement plus difficile d accès, moins d outils génétiques, développement plus lent, coûts. le choix de l espèce dépend donc: 1/ de la nature de la question posée; 2/ des avantages et des inconvénients de chaque modèle expérimental.

15 Transgénèse «simple» Addition d un gène surnuméraire au sein du patrimoine génétique Transmission à la descendance. Couple promoteur / gène Gène: rapporteur (LacZ, GFP ), Trans-activateur, gène sauvage, muté, dominant négatif, shrna Promoteur: fort, ubiquitaire (CMV), tissu / cellule spécifique, inductible

16 Etapes de la transgénèse chez la souris

17 Applications 1- Etude des promoteurs: Utilisation d un gène rapporteur (Lac Z, GFP...) pour: - étudier les séquences régulatrices d un gène, - déterminer les séquences nécessaires à la spécificité tissulaire promoteur ATG rapporteur SV40 pcamkii-lac Z pprp-lac Z

18 2- Génomique fonctionnelle: surexpression d un gène pour en étudier sa fonction promoteur ATG transgène SV40 promoteur ubiquitaire: viral (type CMV) ou autres, engendrent de nombreux problèmes promoteur à spécificité tissulaire: expression limité spatialement et parfois temporellement exemple du promoteur CamKII exprimé uniquement dans le cerveau antérieur et après P14 gène: ADNc, peut-être identique à l ARNm endogène, Modifié: mutations (dominant négatif), ajout d étiquettes, fusion GFP Autres types de séquence : shrna, mirna Malgré ces raffinements, l expression du transgène est contrôlée - ni temporellement - ni spatialement

19 Contrôle temporel: système transactivateur Exemple : le système d induction à la tétracycline Tet off Contrôle temporel de l expression du transgène basé sur une modification du système de régulation transcriptionnelle de la résistance à la tétracycline d E. Coli. (fusion TetR-VP16) Dans ce système, quand la tétracycline se lie à la protéine régulatrice (tetr) celle -ci peut alors reconnaître ses séquences opératrice (teto) et activer la transcription. Il est donc possible d activer l expression d un transgène par adition de tétracycline. Tet on Deux lignées transgèniques sont nécessaires : - l une exprimant la protéine rtta sous le contrôle d un promoteur; - l autre exprimant le transgène sous le contrôle des séquences régulatrices teto. l expression du transgène est contrôlée temporellement par l adition de tétracycline dans l alimentation. Cette approche permet aussi d induire et d inhiber l expression du transgène à volonté.

20 Le système Gal4-LBD dérivé de la levure très utilisé chez la Drosophile et C. Elegans Forme inductible: Fusion ace LBD du récepteur estrogène Induction par le Tamoxifène

21 Exemple de transgénèse inductible à spécificité tissulaire souris CamKII-rtTA/LacZ souris CamKII-rtTA/calcineurine lignée 1 lignée 2 lignée 1 X lignée 2

22 CamKII-rtTA-LacZ CamKII-rtTA-calcineurine

23 Analyse fonctionnelle la surexpression régulée de calcineurine dans l hippocampe induit une modification réversible de la LTP

24 Limitations de la transgénèse «simple» Problèmes liés à l insertion du transgène: insertion aléatoire, hot spot d intégration, instabilité du transgène; Inactivation aléatoire d un gène par insertion; Effet des séquences génomiques environnantes; Problèmes liés à la spécificité du promoteur.

25 Transgénèse par YAC, BAC, PAC Principe de base identique: insertion aléatoire de séquences génomiques exogènes Utilisation de YAC, de BAC ou de PAC (Yeast / Bacterial / P1, Artificial Chromosome) Vecteurs pouvant contenant des fragment génomique de grande taille (>200kb) Avantages: - permet le transfer de large séquence génomiques (analyse de promoteurs) GFP-mapping ( - un gène entier peut être inséré (splice variant), expression dirigée par le promoteur «endogène» - Pathology mapping; - point d insertion plus stable; - peu d interférence par les séquences génomiques avoisinantes; Désavantages: - séquences génomiques longues, plus difficile à manipuler, peuvent recombiner; - Problèmes de la spécificité d expression toujours présent;

26 Transgénèse par BAC : technologie accessible P2X7-eGFP hippocampal granule cells

27 CIBLAGE OU INACTIVATION GENIQUE Technique différente beaucoup plus lourde principalement limitée à la souris. Le but est d inactiver ou de modifier les deux allèles d un gène pour en étudier la fonction. Le principe repose sur la recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires. Pour cela il faut : connaître, au moins partiellement la structure du gène, créer un vecteur de ciblage le transférer dans les cellules ES, sélectionner les cellules ayant subit une recombinaison homologue, injecter ces cellules dans un blastocyte, ré-implanter les blastocytes dans une mère porteuse, sélectionner les animaux hétérozygotes passant dans la lignée germinale, croiser les animaux hétérozygotes pour obtenir des homozygotes,

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30 LIMITATIONS L inactivation peut entraîner une mortalité précoce ou des altérations développementales qui empêchent d en étudier les conséquences chez l animal adulte. La présence de la cassette de sélection peut induire des altérations transcriptionnelles (allèles hypomorphes, ou nulles). Nécessité d une inactivation ciblée spatialement ou inductible, ou les deux.

31 Ciblage génétique conditionnel: système Cre/LoxP et Flp/Frt Cre recombinase du bactériophage P1 Flp (flipase) intégrase de S. Cervisiae Enzymes qui catalysent la recombinaison homologue entre deux sites loxp (Cre) ou Frt (Flp), spécifiques. Site LoxP

32 Application en transgénèse Deux lignées Tg : 1: Tissu Specific Promoter/cre 2: Universal Promoter/STOP/reporter Avantage: la lignée UP-STOP-reporter Peut être croisée avec différentes lignées cre

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34 APPLICATION AU CIBLABE GENETIQUE Au niveau des cellules ES: sélection des cellules ES ayant subit la recombinaison homologue, transfection transitoire de ces cellules par la recombinase Cre excision de la cassette délétion de la cassette de sélection introduction d une modification (knock-in) 1-2: délétion de la cassette Neo/ knock-in 2-3: knock-out 1-3: knock-out, délétion de la cassette

35 Ciblage génétique conditionnel Nécessite deux lignées: une lignée ayant subit le ciblage génétique dans les cellules ES avec insertion de sites lox; une lignée transgènique exprimant la recombinase Cre sous le contrôle d un promoteur à spécificité tissulaire. Le croisement de ces deux lignées permet d inactiver le gène de l animal uniquement dans les régions où la recombinase est exprimée. Les sites loxp et Frt peuvent être combinés permettant un niveau de raffinement supplémentaire Design de la stratégie

36 Inactivation de la sous-unité NR1dans l aire CA1 hybridation in situ

37 Locus ROSA26 Petit locus (9Kb) situé sur le Ch. 6 de la souris Promoteur actif dans tous les tissus Code pour un ARN anti sense d une messager potentiel Pas de fonction associée au locus Très haute fréquence de recombinaison de ce locus (20%) Permet l insertion de copie unique de transgène par recombinaison homologue

38 - Expression d un transgène en copie unique dans un locus connu - Control spatial de l expression du transgène en combinaison avec une lignée Cre Permet - de tester la spécificité tissulaire d un promoteur; - d exprimer des transgènes d intérêt générale (gène killer, protéine fluorescente )

39 Expression ciblé d un gène killer Insertion d une cassette LoxP-GFP-LoxP-DTA dans le locus Rosa 26 Croisement avce une lignée Nkx2.5-Cre/+ (knock-in cre dans séquence exonique de Nkx2.5) Ablation spécifique Des cellules embryonnaires cardiaques

40 Stratégie d expression aléatoire

41 Transfert de gènes: utilisation de particules virales Différents types de vecteur viraux : surtout développés dans le cadre de la thérapie génique Adénovirus Retrovirus Adéno-associated virus (AAV) Autres Chaque type de virus présente des avantages et des inconvénients

42 Exemple des lentivirus - rétrovirus à enveloppe (virus à ARN), ex. HIV, SIV, FIV - infecte les cellules post mitotiques, ex. neurones - intégration du génome viral dans les chromosomes

43 Transduction in-vivo de lentivirus chez la souris vecteur CMV R/U5 gag PGK LacZ gene RRE-LTR3 Ψ - injection intra-ventriculaire vhc" LV" AV Th" I! ventricule Cortex J! Striatum K! Cerebellum Permet l expression localisée de transgène. Par exemple: Lentivirus cre injecté dans des souris avec des souris Rosa26 floxées. -" Crozet, Lin, Mettling, Gilles, Corbeau, Lehman & Perrier (2004) J. Cell. Science, 117, "

44 Application à la transgénèse

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46 Nature Reviews Genetics 2:743 (2001)

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48 Outils Emergent : ZFN et TALEN Edition du génome avec des Zinc Finger Nucleases Avantages: fonctionne dans toutes les espèces, rapidité. ZFN: DNA-binding proteins derivés de facteurs de transcription couplé au domaine nucléase de l enzyme de restricyion FockI. Le domaine nuclease doit dimeriser pour couper l AND, donc deux ZFN sont requis pour cibler un site unique Même principe pour TALEN (transcription activator-like effector nuclease): TALEs couplés au domaine nuclease de FokI. Dans les deux cas les protéines reconnaissent des séquences nucléotidiques spécifiques en fonction de leur séquence primaire. On crée une protéine ZFN ou TALE spécifique pour chaque séquence. Carroll D; Ann. Rev Biochem 2014, in press

49 Genome Editing avec ZFN et TALEN approches encore en développement. Problèmes de spécificité dans la reconnaissance des séquences Problèmes d introduction des nucléases dans les cellules Nombreuses applications potentielles (thérapie génique).