Marie-Christine MAZERON

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1 Place des tests virologiques et immunologiques dans la surveillance des infections à CMV des receveurs de greffe d organe et de cellules souches hématopoïétiques Marie-Christine MAZERON

2 Cytomégalovirus pathogène majeur en transplantation d organe Stimulation allogénique TNFα, anti-l, fièvre Infection active Immunodépression virémie, infection tissulaire Effet direct Maladie à CMV Effets indirects MHC, cytokines Syndrome CMV localisation Atteinte du greffon rejet EBV-PTLD Infection opportuniste Athérosclérose bronchiolite obliterans

3 Cytomégalovirus pathogène majeur en transplantation de CSH Effet direct Effets directs Syndrome CMV Maladie à CMV précoce ou tardive : pneumonie Effets indirects MHC, cytokines Molécules d adhésion Infections opportunistes Association à la GVH

4 Infection à CMV après allogreffe et ses conséquences Charge virale initiale et augmentation de la charge virale Emery et al (2000) Lancet 355: Contrôle immunitaire

5 Prévention de l infection à CMV chez les receveurs d allogreffe Deux stratégies Prophylaxie Administration d un traitement antiviral après la greffe pour prévenir la survenue d une infection active à CMV Réservée aux receveurs d organe solide D+/R- R+ (D+ ou D-) à risque particulièrement élevé absence de consensus pour une surveillance virologique Traitement anticipé (préemptif) Administration d un traitement antiviral en présence d une infection active à CMV pour prévenir la survenue d une maladie à CMV (syndrome CMV ou atteinte viscérale)

6 Recommandations internationales Transplantation d organe (Kotton, Transplantation, 2010,89: ) Traitement anticipé International Consensus Guidelines 2010 Prélèvements hebdomadaires après greffe pendant 3 mois (rein, foie, pancréas, cœur) Suivi virologique possible par antigénémie pp65 Suivi virologique par PCR en temps réel recommandé Plasma ou sang total et résultats exprimés en nombres de copies par ml de plasma ou de sang total Seuil d intervention à établir localement Considérer l augmentation de la charge virale entre deux prélèvements ( 0,5 log 10 et 0,7 log 10 pour les valeurs proches du seuil de la technique)

7 Recommandations internationales Transplantation d organe (Kotton, Transplantation, 2010,89: ) Surveillance du traitement mesure de la charge virale 1 à 2 fois par semaine Durée du traitement Jusqu à obtenir une ou 2 mesures de CV indétectable Seuil d indétectabilité? Jamais inférieure à 2 semaines

8 Recommandations internationales Greffe de cellules souches hématopoïétiques ECIL Surveillance virologique au moins hebdomadaire au cours des 100 premiers jours après la greffe Surveillance prolongée en cas de GVH, greffe de sang de cordon, immunodépression intense, première infection au cours des 100 premiers jours Méthodes quantitatives : PCR, antigénémie, ARN messagers tardifs Interprétation en fonction des données virologiques et cliniques Seuil d intervention : dépend de la méthode utilisée et du compartiment sanguin analysé (seuil plus bas si plasma)

9 Méthodes virologiques de surveillance de l infection à CMV Mesure de l antigénémie pp65 Quantification des génomes viraux dans le sang circulant par PCR quantitative par PCR en temps réel

10 Enquête 2009 sur les pratiques des laboratoires français CNR cytomégalovirus Réponses obtenues de 36 laboratoires

11 Dissémination hématogène Bentz et al, J Virol 2006

12 DISSEMINATION SANGUINE Compartiment à explorer Monocytes site de latence (ADN viral) Lymphocytes - Couche leucocytaire Polynucléaires Virus infectieux Antigène pp65 ADN viral Sang total Plasma ADN viral lyse des PN cellules endothéliales Plasma

13 Choix du compartiment Corrélation entre antigénémie pp65 et QPCR à partir du sang total (WB), du plasma ou des PBL ADNémie plus précoce que l antigénémie (2 semaines) QPCR WB plus sensible que QPCR plasma Correspondance entre niveau d antigénémie pp65 et CV mesurée en QPCR WB (Deback et al, J Clin Virol, 2007, 40,173) et CV mesurée en QPCR plasma avant la mise sous traitement (Gimeno et al, J Clin Microbiol, 2008,46,3311)

14 Correspondance entre niveau d agpp65 et charge virale mesurée par QPCR Allice T et al (2006) J Med Virol, 78:

15 Suivi par PCR en temps réel et antigénémie pp65 de l infection à CMV chez des receveurs de CSH Beckmann et al, J Med Virol, 2011, 83:2143

16 Seuils d intervention (antigénémie pp65) Transplantation d organe 100 nyx/ leucocytes D+/R+et D-/R+ 2nyx/ leucocytes D+/R- Greffe de CSH 1ou 2 ny/ leucocytes (Gimeno et al,gerna et al)

17 Seuils d intervention (PCR en temps réel) Transplantation d organe 1000 à 5000 copies/ml plasma 1000 à copies/ml sang total Greffe de CSH 100 à copies/ml plasma 1000 à copies/ml sang total Absence d harmonisation compartiment exploré région amplifiée et modalités techniques standards de calibration

18 Standard international WHO 2010 => candidat standard proposé préparation de virus entier souche Merlin tampon 10mM Tris-HCL et 0,5% albumine humaine présenté congelé et lyophilisé titre : 5x10 6 Unités Internationales après reconstitution dans 1ml d eau sans nucléases destiné à permettre l expression des résultats en UI et la validation des trousses dans le cadre de l accréditation Commandes limitées à 5 par an et par institution Facteurs de conversion pour la trousse Abbott RealTime CMV Abbott RealTime CMV copies en UI : copies/ml x 1.56 = UI/ml Abbott RealTime CMV log 10 copies en log 10 UI : log 10 copies/ml = log 10 UI/ml

19 Dynamique de la réplication virale Demi-vie : 2 jours Augmentation de la charge virale chez 18 receveurs de greffe de moelle Emery et al, J Exp Med, 1999,190:

20 Augmentation de la charge virale et maladie à CMV Augmentation de la CV au stade initial de l infection active 127 patients transplantés : rein (31), CSH (49), foie (47) Emery et al (2000) Lancet 355:

21 Cinétique de réplication Rythme d augmentation de la CV en l absence de traitement CV 3 fois CV de base en 6 jours chez des RCSH => différencie les épisodes initiaux ne nécessitant pas de tt de ceux qui nécessitent un tt sens : 76,4%, spec : 89,4%, VPP : 86,6%; VPN : 80,9% dynamique de réplication ne permet pas de préjuger de la réponse au traitement Munoz-Cobo et al, Biol Blood Marrow Transplant, 2011

22 Boeck and Ljungman, Blood, 2009,113:5711

23 Survenue des récurrences Etude Victor, 2009

24 Stratégie mixte Prophylaxie suivie de surveillance virologique dans le but de prévenir la survenue de la maladie retardée à CMV (17 à 37 % des R-/D+ après 3 mois de prophylaxie) Etude rétrospective chez 71 receveurs d organe solide Lisboa et al Transplantation 2011,82:1063 prophylaxie 3 à 6 mois surveillance 8 semaines Surveillance Après la surveillance ADNémie >500 cp/ml pl 35 jours (11-53) maladie Echec de cette stratégie 7 : S avec ADN+ 64 jours (9-180) après l arrêt 8 : S avant TT période de surveillance trop courte seuil d intervention trop haut (25000 cp/ml), doublement de la population virale très court (1,1 jour)

25 Surveillance du traitement Suspicion de résistance signes cliniques qui persistent ou s aggravent CV reste stable ou augmente à la fin du traitement Charge virale à interpréter avec prudence augmentation possible de l ag pp65 sous GCV en début de traitement augmentation transitoire de la CV à l arrêt du traitement pendant 5 à 7 jours si augmentation rapide de la CV avant traitement

26 Réponse immunitaire Réponse humorale anticorps neutralisants dirigés contre les glycoprotéines gb et gh le complexe gh/gl/pul131/pul130/pul128 Complexe impliqué dans l entrée du virus dans les cellules endothéliales et épithéliales Exprimé par les isolats cliniques et non les souches de laboratoire Rôle des anticorps neutralisants : à explorer Ryckman B J et al. J. Virol. 2008;82:60-70

27 Réponse cellulaire Réponse immunitaire Importance capitale dans le contrôle de l infection à CMV Rôle clé à la fois des lymphocytes T CD4+ et CD8+ receveurs de greffe d organe (D-/R+, BenMarzouk-Hidalgo et al, Transplant, 2011, 91:927) receveurs de CSH (Moins-Teisserenc et al, J Infect Dis, 2008,198:818; Tormo et al, Bone marrow Transplant, 2010,45:543) Réactivité dirigée contre un très grand nombre de protéines virales particulièrement impliquées IE-1, IE-2 et pp65 et aussi de nombreuses autres (70 environ) Importance du nombre de lymphocytes impliqués dans la réponse de leur fonctionnalité

28 Suivi immunologique Réponse immunitaire T spécifique peut-elle aider à la prise en charge des receveurs d allogreffe? Monitoring des réponses cellulaires T spécifiques du CMV => reconnaître les patients à haut risque de maladie à CMV => guider la prophylaxie et les traitements anticipés

29 Méthodes de suivi immunologique Tetramers : peptides spécifiques, HLA spécifique Population explorée : LCD8+ Marquage cellulaire et détection de cytokines intra-cellulaires par cytométrie de flux après stimulation par peptides ou lysats antigéniques Elispot Cytokines détectées : IL2, INFγ Populations réactives CD8+ et CD4+ individualisées Mesure de la production d INFγ après stimulation par peptides ou lysats Populations explorées : LCD8+ et LCD4+ sans distinction QuantiFERON -CMV (Cellestis) Population explorée : L CD8+ Production d INFγ mesurée en UI par un test ELISA

30 Méthodes de suivi immunologique Gerna et al, New Microbiologica, 2011, 34:229

31 Méthodes immunologiques Diversité des méthodes méthodes «maison» ou commercialisées populations cellulaires explorées : CD8, CD8 et CD4, CD8 + CD4 antigènes viraux : peptides pp65 ou/et IE-1, lysats viraux, cellules présentatrices d antigènes expression des résultats : UI d INFγ produit par les cellules stimulées par les antigènes viraux, nombre de cellules produisant des cytokines (INFγ, IL2,TNF )/ml ou µl Seuils assurant le contrôle immunitaire de l infection à déterminer

32 Cell Mediated Immunity to Predict Cytomegalovirus Disease in High Risk Solid Organ Transplant Recipients 108 receveurs de greffe (D-/R+, D+/R-, D+/R+) QuantiFERON Kumar et al, American Journal of Transplantation, 2009, 9:

33 Cell Mediated Immunity to Predict Cytomegalovirus Disease in High Risk Solid Organ Transplant Recipients >0,1 UI/ml INFγ <0,1 UI/ml INFγ Kumar et al, American Journal of Transplantation, 9:

34 Receveurs de CSH Réduction de la durée du traitement en fonction de la réponse immunitaire Etude pilote (Remigia et al, transplantation, 2011,92:e17) 14 patients (D-/R+ et D+/R+) et 14 épisodes de réactivation CV suivie par PCR plasmatique Réponse immunitaire suivie par détection des L CD8+ producteurs d INFγ traitement anticipé si CV> seuil 500 copies/ml interruption si CV<100 copies/ml et CMV INFγ CD8+ > 1 cellule/µl Stratégie appliquée à 6 épisodes les patients ont reçu un traitement pendant 6 à 13 jours au lieu de 20 à 75 jours Suivi des récurrences la réponse immunitaire ne protège pas si corticoïdes pour GVH

35 Receveurs de CSH Conclusion de l Etude pilote (Remigia et al, transplantation, 2011,92:e17) Stratégie de réduction de la durée du traitement pourrait concerner 25 % des patients ne s applique pas aux patients sous corticothérapie nécessite d être évaluée dans un essai randomisé mesurant bénéfice clinique (nombre de jours de traitement épargnés) efficacité virologique (durée des épisodes de virémie, survenue des récurrences) sécurité clinique (maladie à CMV)

36 Receveurs de CSH Stratégie d intervention thérapeutique après 3 mois post greffe (Avestisyan et al, Bone Marrow Transplant,2007,40:865) absence de traitement antiviral des réactivations après trois mois si immunité CD4 et CD8 suffisante (Elispot et marquage intra-cellulaire) Résultats : sauf - si corticothérapie pour GVH 17 patients, 19 épisodes - signes cliniques évocateurs de maladie à CMV - décision du clinicien 16 épisodes traités selon la stratégie => absence de traitement pour 5 épisodes rôle du statut du donneur

37 Conclusion Mesure de la charge virale Méthodes actuelles permettent de définir les seuils d intervention antigénémie pp65, PCR en temps réel sur le plasma, le sang total ou les PBL Sensibilité des tests => précocité de la détection de l infection => mesure de la dynamique de réplication Délai de résultat => compatible avec l introduction du traitement avant l apparition de la maladie Standardisation des techniques => reproductibilité inter-essai indispensable pour assurer le suivi de la CV => comparaison des différentes techniques

38 Conclusion Suivi immunologique Importance de la réponse immunitaire cellulaire spécifique confirmée par de nombreux travaux Intérêt d un suivi immunologique chez les receveurs d allogreffe Nécessité de disposer de méthodes standardisées de mener de larges études randomisées => mise en place du traitement antiviral => décider de l administration de CTL CMV

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