Département de Génétique Moléculaire Appliquée Année Universitaire TD N 1

Transcription

1 TD N 1 Exercice 01 : La figure présente un exemple particulièrement clair de séquençage didésoxy. Essayer de le lire. La séquence lue de bas en haut sur le gel correspond à un ARNm. Pouvez-vous déterminer la phase ouverte de lecture dans cette séquence?

2 Exercice 02 : Au cours de l exploration d une famille atteinte dhypercalcémie hypocalciurique familiale, des mutations inactivatrices du récepteur sensible au calcium, (responsables d une augumentation du niveau de calcémie à partir duquel la sécrétion de PTH et la réabsorption du calcium par le tube rénal sont inhibées) ont été mises en évidence par le technique de séquençage de sanger chez un sujet atteint de la maladie. a) En comparant les gels de séquence ci-contre d un sujet normal et d un patient atteint, dites ou est située la mutation? b) De quel type est-elle?

3 TD N 2

4 TD N 3 Exercice 01 : Vous disposez d un brin d ADN à séquencer (matrice), d une amorce, d ADN polymérase, des quatre 2 -désoxyribonucléotides (dxtp) et d un jeu des différents 2,3 -didésoxyribonucléotides (ddxtp). L amorce est radiomarquée par du phosphore radioactif 32P. L ADN matriciel à séquencer ACGTAATCGC---- comporte, à son extrémité 3, une séquence supplémentaire (représentée ici par un segment de droite en pointillé) sur laquelle l amorce va s hybrider, créant ainsi le site d initiation de l ADN polymérase. 1-Résumez brièvement le principe de la méthode en indiquant le rôle du didésoxyribonucléotide. 2- Compléter le tableau en indiquant la composition des différents milieux réactionnels et, pour chaque milieu, le type et la taille des fragments néosynthétisés. 3- Sur le gel ci-dessous, représenter la taille des fragments néosynthétisés dans chaque milieu réactionnel (utiliser l échelle de taille représentée à gauche du schéma) 4- Reporter, à droite, la séquence du brin synthétisé puis la séquence recherchée, en indiquant le sens de lecture des séquences établies.

5 Exercice 02 : Un petit fragment d ADN a été séquencé selon la méthode d interruption des chaînes. Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des fragments obtenus est déterminée par une chromatographie. Le séquenceur automatique pourvu d une source laser ou infra-rouge qui excite les fluorochromes portés par les ddntp, détecte la fluorescence sortant des colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d'adn et leur taille précise. Le résultat est présenté sous forme de courbes présentant la fluorescence détectée, et l'interprétation qui en faite en terme de nucléotidesdonner la séquence de l ADN (la flèche sur le dessin indique le sens de migration).

6 TD N 4 Exercice : Le séquençage direct automatique des 2 brins de l exon 18 et 1 du gène Rb du rétinoblastome a été réalisé par la méthode de sanger en utilisant des didésoxyribonucléotides marqués par des fluorophormes différents. Des extraits de l électrophorégramme et des séquences sont obtenu et représentés respectivement sur le document N 1 et 3. Question : 1-En vous aidant de la séquence de l exon18 et 1 (document n 2 et 4), identifier, nommez et indiquer la position de la mutation en cause. Les amorces servant à l amplification sont notées SSR93 et SSR94 pour l exon 18 et SSR1, SSR2 pour l exon 2.

7 Document n 1 : Séquençage de l exon 18 du gène Rb électrophorégramme. Séquence de référence : Séquence du malade : Document n 2 : Séquence de l exon 18 SSR93 SSR gtacctggga aaattatgct tactaatgtg gttttaattt catcatgttt catataggat tcacctttat ttgatcttat taaacaatca aaggaccgag aaggaccaac tgatcacctt gaatctgctt gtcctcttaa tcttcctctc cagaataatc acactgcagc agatatgtaa gcaaaatata tgttatgttg accattcaaa ctgcaaatag attttaagca taagtgcaat gtaacattct ataaagaaac tgtagggaat agaattttga ataagaatag tttctgtttt taagaaatta gtaataaaag gtacatgacc caaataaagt catataaaag agtacagagt

8 Document n 3 : Séquençage de l exon 1 du gène Rb électrophorégramme. Séquence de référence : Séquence du malade : Document n 4 : Séquence de l exon 1 SSR1 SSR gtccggtttt tctcagggga cgttgaaatt atttttgtaa cgggagtcgg gagaggacgg 1981 ggcgtgcccc gacgtgcgcg cgcgtcgtcc tccccggcgc tcctccacag ctcgctggct 2041 cccgccgcgg aaaggcgtca tgccgcccaa aaccccccga aaaacggccg ccaccgccgc 2101 cgctgccgcc gcggaacccc cggcaccgcc gccgccgccc cctcctgagg aggacccaga 2161 gcaggacagc ggcccggagg acctgcctct cgtcaggtga gcgagcagag ccgccgtcgc 2221 ctcacgcggg aagggcgccc cgggtgtgcg tagggcgggc gcaaggcggc tcggcgggga

9 TD N 5 Exercice 01 : Pour déterminer la séquence d ADN sur laquelle se fixe un répresseur (R+) d un opéron, des chercheurs ont employé la technique d empreintes. Pour cela, ils ont utilisé des fragments d ADN clonés puis purifiés. Ces derniers ont été marqués en 5, traités à la DNase I, après préincubation rapide en présence et en absence du répresseur (R+) ou (R-). 1- Quels sont les enzymes de marquage et le nucléotide utilisé pour cette expérience? 2- Quelle est l utilité de la DNaseI dans cette expérience? Précisez son mode d action. 3- Est-ce que tous les fragments générés par cette enzyme seront présents sur l autoradiogramme? 4- Quelles sont les précautions à adopter pour assurer une reproductibilité de cette technique? 5- Commenter ces autoradiogramme. 6- Comment dénomme t-on la région sur laquelle se fixe le répresseur? 7- Quel genre de banque doit-on utiliser pour identifier une telle région?

10 Exercice 02 : A et B sont deux gènes appartenant respectivement à des cellules d E.Coli et des cellules de hamster en culture. Pour étudier grossièrement leur structure, on dispose de deux sondes radioactives d ADNc des ARNm A ou ARNm B codés par les gènes Aou B. L étude a constitué d incuber les fragments de restriction monobrins de chacun de ces génomes avec leurs sondes respectives marquées au P 32. Cette incubation était suivie d un traitement de la préparation par la nucléase S1. La préparation était analysée par électrophorèse dans des conditions dénaturantes. L autoradiogramme du gel après électrophorèse est présenté à la figure cidessous. 1- Interprétez les données de la figure ci-dessus. 2- Vos conclusions peuvent-elles être généralisées à tous les gènes eucaryotes et procaryotes? 3- Sachant que l ADNc de l ARNm A fait 7Kb, estimez la taille du gène A.

11 TD N 6 Exercice 01 : Une expérience d empreinte à la DNaseI (footprinting) a été réalisée avec l ARN polymérase et la protéine LacI, individuellement ou en compétition, sur la région chromosomique d E.Coli située entre les gènes Laci et LacZ. Pour cette expérience, la région d ADN située en amant du gène spécifiant la B-galactosidase d E.Coli a été marquée radioactivement, incubée en présence de protéine (selon les indications) puis soumisse à la digestion par la DNaseI Analysez cette expérience et concluez.

12 Exercice 02 : On cherche à étudier la structure d une séquence d ADNg de 6,1Kb. Pour cela on dispose de sa carte de restriction. 2Kb 3,1Kb 3,9Kb 5,6Kb 6,1Kb Région I Région II Région III Région IV Région V Ce dernier est incubé avec un ARNm (hétéroduplexe ADN/ARNm) afin d analyser l ARNm par rapport à l ADNg (SI Mapping). Les résultats des autoradiogrammes sont les suivants : Heteroduplex ADN/ARN 1Kb 0,9Kb 0,8Kb 0,7Kb 0,5Kb 0,3Kb L analyse en microscopie électronique de l hybridation de l ADNg avec l ARNm a permis de déterminer qu il existe 3 exons et 2 introns. A l aide de ces informations déterminer la taille des introns et des exons.

13 TD N 7