EfficacitÄ virucide d un däsinfectant pour usage sur les surfaces environnementales inanimäes
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- Anne-Marie Généreux
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1 EfficacitÄ virucide d un däsinfectant pour usage sur les surfaces environnementales inanimäes Virus : Virus de la grippe A (H1N1) DÄsignation du Produit : Sanosil S010 ATS Labs, Eagan MN 55121, USA Mai 2009 Sanosil Ltd. Eichtalstrasse 49 CH-8634 Hombrechtikon Suisse Tél.: Fax: info@sanosil.com Des T 261/en Ç Sanosil 2009 Mai 2009
2 RAPPORT D ETUDE FINAL TITRE DE L ETUDE EfficacitÅ virucide d un dåsinfectant pour usage sur les surfaces environnementales inanimåes Virus : Virus de la grippe A (H1N1) DESIGNATION DU PRODUIT Sanosil S010 Lot Z0905B8 et Lot Z2012B7 EXIGENCES RELATIVES AUX DONNEES U.S. EPA 40 CFR Part 158, "Data Requirements for Registration" Directives pour l Åvaluation des pesticides - Subdivision G, 91-2(f) AUTEUR Karen M. Ramm, B.A. Directeur d Etude DATE DE FIN DE L ETUDE 27 mai 2009 LABORATOIRE EXECUTANT ATS Labs 1285 Corporate Center Drive, Suite 110 Eagan, MN PROMOTEUR Sanosil International, LLC 100 Dean Drive Newark, DE REPRESENTANT DU PROMOTEUR Lewis & Harrison, LLC 122 C Street, NW, Suite 740 Washington, DC NUMERO DU PROJET A07680 Page 1 / 23
3 Projet N A07680 Sanosil International, LLC Protocole N : LEH SFLU Page 7 / 23 INFORMATIONS GENERALES SUR L ETUDE RAPPORT D ETUDE Titre de l Åtude : Projet NÇ : Protocole NÇ : Promoteur : ReprÅsentant du promoteur : Centre d essais : EfficacitÅ virucide d un dåsinfectant pour usage sur les surfaces environnementales inanimåes A07680 LEH SFLU Sanosil International, LLC 100 Dean Drive Newark, DE Lewis & Harrison, LLC 122 C Street, NW, Suite 740 Washington, DC ATS Labs 1285 Corporate Center Drive, Suite 110 Eagan, MN IDENTITE DE LA SUBSTANCE A L ESSAI Nom de la substance É l essai : Lot(s) : Sanosil S010 Lot 20905B8 et Lot Z2012B7 CaractÅrisation de la substance É l essai La caractårisation de la substance Ç l essai (teneur, stabilitå, solubilitå, conservation, etc.) est de la responsabilitå du promoteur. DATES DE L ETUDE Date de råception de l Åchantillon : 27 janvier 2009 Date de dåbut de l Åtude : 1 er mai 2009 Date de dåbut des tests : 9 mai 2009 Date de fin des tests : 15 mai 2009 Date de fin de l Åtude : 27 mai 2009 OBJECTIF Cette Åtude avait pour but d Åvaluer l efficacitå virucide d une substance expårimentale contre le virus de la grippe A (H1N1) selon des critéres et måthodes d essai validås par l Agence de Protection de l Environnement des Etats-Unis (U.S. EPA), pour l enregistrement d un produit comme virucide.
4 RESUME DES RESULTATS Substance É l essai : Sanosil S010, Lot Z0905B8 et Lot Z Dilution : PrÑt Ç l emploi (PAE) Virus : Virus de la grippe A (H1 N1), ATCC VR-333, souche A/Swine/lowa/15/30 Temps d exposition : Dix minutes TempÅrature d exposition : TempÅrature ambiante (20,0ÖC) Charge organique : SÅrum fœtal de bovin 1 % RÅsultat d efficacitå : Deux lots de Sanosil S010 råpondaient aux critéres d essai spåcifiås dans le protocole d Åtude. Les råsultats indiquent une inactivation totale du virus de la grippe A (H1N1) dans les conditions d essai requises par l U.S. EPA pour les revendications d activitå virucide. SYSTEME EXPERIMENTAL 1 Virus La souche A/Swine/lowa/15/30 de virus de la grippe A (H1N1) utilisåe pour cette Åtude provient de l American Type Culture Collection, Manassas, VA (ATCC VR-333). La solution-mére de virus a ÅtÅ pråparåe en recueillant le surnageant de culture des cellules infectåes. Les cellules ont ÅtÅ lysåes et les dåbris cellulaires ÅliminÅs par centrifugation Ç environ 2000 t/min pendant 5 minutes Ç environ 4ÖC. Le surnageant a ÅtÅ råparti en aliquotes et la solution-mére de virus, Ç haut titre, a ÅtÅ conservåe Ç une tempårature infårieure ou Ågale Ç -70ÖC jusqu au jour d utilisation. Ce jour-lç, une aliquote de solution-mére de virus (Lot SF-14, ATS Labs) a ÅtÅ prålevåe, dåcongelåe et maintenue au råfrigårateur jusqu au moment du dosage. Les cultures de solution-mére de virus contenaient 1% de sårum fœtal de bovin comme charge organique. Le virus testå a dåmontrå les effets cytopathiques (ECP) typiques des virus grippaux sur les cellules de rein de singe RhÅsus (RMK). 2. Cultures cellulaires d essai Les cellules RMK proviennent de ViroMed Laboratories, Inc., Division de Culture Cellulaire. Les cultures ont ÅtÅ maintenues et utilisåes Ç la densitå appropriåe dans le matåriel pour culture tissulaire du laboratoire, Ç 36-38ÖC, sous atmosphére humidifiåe Ç 5-7 % de CO Milieu d essai Le milieu d essai utiliså dans cette Åtude Åtait le Milieu Essentiel Minimum (MEM) supplåmentå avec 1 % de sårum fœtal bovin (FBS) inactivå par chauffage, 10 ág/ml de gentamicine, 100 U/ml de pånicilline et 2,54 ág/ml d amphotåricine B.
5 Le tableau suivant råpertorie les groupes d essai et tåmoins, les dilutions teståes et le nombre de cultures utilisåes. Pour une explication plus dåtaillåe, voir le texte du rapport. METHODES NOMBRE DE DILUTIONS ET DE CULTURES POUR L ETUDE D EFFICACITÑ VIRUCIDE Groupe d essai ou tåmoin Dilutions teståes (log 10 ) Cultures par dilution Nbre total de cultures TÅmoin cellulaire N/A 4 4/groupe TÅmoin virus dåshydratå (Groupe A) Echantillon du lot nö1 + virus (Groupe B) Echantillon du lot nö2 + virus (Groupe B) CytotoxicitÅ du lot nö1 (Groupe C) CytotoxicitÅ du lot nö2 (Groupe C) Niveau non virucide lot nö1 (Groupe D) Niveau non virucide lot nö2 (Groupe D) 1. PrÅparation de la substance Ç l essai Deux lots de Sanosil S010 (Lot Z0905B8 et Lot Z2012B7) ont ÅtÅ utilisås purs, tels qu envoyås par le promoteur. A l emploi, la substance Ç l essai Åtait en solution comme dåterminå par observation visuelle. 2 PrÅparation des films de virus Les films de virus ont ÅtÅ pråparås en Åtalant uniformåment 0,2 ml d inoculum viral sur le fond de trois boâtes de PÅtri en verre, ståriles, de 100 x 15 mm. Les films de virus ont ÅtÅ såchås Ç l air libre Ç 20,0ÖC dans des conditions d humiditå relative de 50 %, jusqu Ç ce qu ils soient visiblement secs (20 minutes). 3. Filtration sur gel Sephadex Afin de råduire le niveau de cytotoxicitå du målange virus-substance Ç l essai avant le dosage du virus et/ou de råduire l activitå virucide de la substance Ç l essai, le virus a ÅtÅ såparå de la substance Ç l essai par filtration sur gel Sephadex. Des colonnes de Sephadex LH ont ÅtÅ ÅquilibrÅes avec une solution physiologique tamponnåe au phosphate (tampon PBS) contenant 1 % d albumine et centrifugåes pendant trois minutes pour vider le volume mort. Les colonnes Åtaient alors prñtes Ç l usage.
6 4. Traitement des films de virus par la substance Ç l essai (GROUPE B, TABLEAU 1) Pour chaque lot de substance Ç l essai, un film de virus dåshydratå a ÅtÅ individuellement exposå Ç une aliquote de 2,00 ml de la dilution de substance Ç l essai, pendant 10 minutes Ç tempårature ambiante (20,0ÖC). Les films de virus ont ÅtÅ entiérement recouverts de substance Ç l essai. AprÉs le temps d exposition, les plaques ont ÅtÅ grattåes une Ç une avec un grattoir Ç cellules pour remettre en suspension le contenu et le målange virus-substance Ç l essai a ÅtÅ immådiatement chromatographiå sur colonne de Sephadex en utilisant le piston de la seringue pour dåtoxiquer le målange. Le filtrat (dilution 10-1 ) a ensuite ÅtÅ titrå aprés dilutions en sårie (au 1/10 Éme ) en mesurant l infectivitå et/ou la cytotoxicitå. 5. Traitement du film tåmoin de virus (GROUPE A, TABLEAU 1) Un film de virus a ÅtÅ pråparå comme dåcrit pråcådemment (paragraphe 2). Le film tåmoin a ÅtÅ exposå Ç une aliquote de 2,00 ml de milieu d essai pendant le mñme temps d exposition et Ç la mñme tempårature d exposition que les films d essai exposås Ç la substance d essai (dix minutes Ç 20,0ÖC). AprÉs exposition, le tåmoin viral a ÅtÅ grattå avec un grattoir Ç cellules et le målange viral a ÅtÅ immådiatement chromatographiå sur colonne de Sephadex, de la mñme maniére que pour le virus d essai (paragraphe 4). Le filtrat (dilution10-1 ) a ensuite ÅtÅ titrå aprés dilutions en sårie (10 en 10) en mesurant l infectivitå. 6. TÅmoin de cytotoxicitå (GROUPE C, TABLEAU 2) Une aliquote de 2,00 ml de la dilution utilisåe de chaque lot de la substance Ç l essai a ÅtÅ filtråe sur colonne de Sephadex et le filtrat a ÅtÅ diluå en sårie dans le milieu et inoculå dans des cultures de cellules RMK. La cytotoxicitå des cellules RMK en culture a ÅtÅ notåe en mñme temps que celle des cultures de virus-substance Ç l essai et des cultures tåmoins. 7. DÅtermination du seuil non virucide de la substance Ç l essai (GROUPE D, TABLEAU 3) Chaque dilution de substance Ç l essai filtråe sur Sephadex (tåmoin de cytotoxicitå) a ÅtÅ målangåe avec une aliquote de solution-mére de virus Ç faible titre, et les målanges obtenus ont fait l objet d un test d infectivitå et/ou de cytotoxicitå afin de dåterminer la (les) dilution(s) de substance Ç l essai conservant une activitå virucide, le cas ÅchÅant. Les dilutions qui pråsentaient une activitå virucide n ont pas ÅtÅ prises en compte pour dåterminer la råduction de l infectivitå par la substance Ç l essai. 8. Mesures de l infectivitå La lignåe cellulaire RMK, qui pråsente un ECP en pråsence du virus de la grippe A (H1N1), a ÅtÅ utilisåe comme lignåe cellulaire indicatrice dans les tests d infectivitå. Les cellules en boâtes de culture multipuits ont ÅtÅ inoculåes, en quatre exemplaires, avec 0,1 ml des dilutions pråparåes Ç partir de tous les groupes d essai et tåmoins. Les cultures de cellules indicatrices non infectåes (tåmoins cellulaires) ont ÅtÅ inoculåes avec le milieu d essai seul. Les cultures ont ÅtÅ incubåes Ç 36-38ÖC sous atmosphére humidifiåe Ç 5-7 % de CO 2, dans du matåriel de laboratoire stårile Ç usage unique. Les cultures ont ÅtÅ ÅvaluÅes påriodiquement pendant six jours pour vårifier l absence ou la pråsence d un ECP, la cytotoxicitå et la viabilitå 9. MÅthodes statistiques : Sans objet. CHANGEMENTS DU PROTOCOLE Amendements au protocole : Aucun amendement n a ÅtÅ requis pendant cette Åtude. Ecarts au protocole : Aucun Åcart au protocole n a ÅtÅ observå pendant cette Åtude.
7 ANALYSE DES DONNEES Calcul des titres Les titres viraux et de cytotoxicitå sont exprimås en -log 10 de la mi-titration pour l infectivitå (TCID 50 ) ou la cytotoxicitå (TCD 50 ), respectivement, calculåes par la måthode de Spearman-Karber. Somme dupourcentage de mortalitå É chaque dilution -Log de la 1Öre dilution inoculåe Calcul de la råduction logarithmique des titres 0.5 x(logarithme de la dilution) TCID 50 du virus dåshydratå tåmoin TCID 50 de la substance Ç l essai = RÅduction logarithmique CRITERES D ACCEPTATION Les conditions suivantes Åtaient fixåes pour que les tests soient valides : 1) qu au moins 4 log 10 d infectivitå soient råcupårås avec le film tåmoin de virus dåshydratå; 2) que lorsqu une cytotoxicitå est visible, une råduction d au moins 3 log du titre soit dåmontråe au-delç du seuil cytotoxique ; 3) que les tåmoins cellulaires soient någatifs au plan de l infectivitå. Nota : Pour Ñtre considårå comme efficace, un produit doit entraâner l inactivation totale du virus Ç toutes les dilutions. CONSERVATION Conservation des dossiers Toutes les donnåes brutes originales extraites exclusivement de cette Åtude seront archivåes chez ATS Labs, 1285 Corporate Center Drive, Suite 110, Eagan, MN Ces donnåes originales sont notamment (liste non exhaustive) : 1. Toutes les donnåes brutes manuscrites pour la substance Ç l essai et les tåmoins, y compris, mais pas seulement, les cahiers de laboratoire, les fiches de donnåes et les calculs. 2. Toutes les notifications d amendement/d Åcart au protocole. 3. Toutes les donnåes mesuråes utilisåes pour formuler le rapport final. 4. Les måmorandums, spåcifications et autre correspondance spåcifique de l Åtude concernant l interpråtation et l Åvaluation des donnåes, autres que les documents figurant dans le rapport d Åtude final. 5. Le protocole original, signå. 6. Une copie certifiåe conforme du rapport d Åtude final. 7. Les Åcarts aux POS spåcifiques de l Åtude constatås pendant l Åtude. Conservation de la substance É l essai La substance Ç l essai sera ÅliminÅe au terme de l Åtude, selon le protocole validå par le promoteur. Il est de la responsabilitå du promoteur de conserver un Åchantillon du produit Ç l essai.
8 REFERENCES 1. Annual Book of ASTM Standards 2000, Section 11 Water and Environmental Technology Volume Biological Effects and Environmental Fate: Biotechnology; Pesticides, E U.S. Environmental Protection Agency Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision G: Product Performance, 91-2(f), November U.S. Environmental Protection Agency, Registration Division, Office of Pesticide Programs, DIS/TSS-7, November 12, Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. Schmidt, N.J. and Emmons, R.W. editors. Sixth edition, p Blackwell, J.H., and J.H.S. Chen Effects of various germicidal chemicals on HEP-2 cell culture and Herpes simplex virus. J. AOAC 53:
9 RESULTATS DE L ETUDE Les Tableaux 1 Ç 3 pråsentent les råsultats des tests effectuås avec deux lots de Sanosil S010 (Lots Z0905B8 et Z2012B7), prñts Ç l emploi, exposås au virus de la grippe A (H1N1) en pråsence de 1 % de sårum fœtal bovin Ç tempårature ambiante (20,0ÖC) pendant dix minutes. Tous les tåmoins cellulaires Åtaient någatifs pour l infectivitå du virus d essai. Le titre du virus dåshydratå tåmoin Åtait de 4,75 log 10. AprÉs exposition, on a notå une absence d infectivitå du virus d essai dans le målange virus-substance Ç l essai, quels que soient le lot et la dilution testås. Absence de cytotoxicitå de la substance Ç l essai, quels que soient le lot et la dilution testås ( 0,5 log 10 ). Le conträle de neutralisation (niveau non virucide de la substance Ç l essai) montre que la substance Ç l essai est neutralisåe Ç un titre infårieur ou Ågal Ç 0,5 log 10 pour les deux lots. Compte tenu des råsultats de cytotoxicitå et du conträle de neutralisation, la råduction du titre viral Åtait supårieure ou Ågale Ç 4,25 log 10 pour les deux lots. CONCLUSION DE L ETUDE Dans les conditions de cette Åtude et en pråsence de 1 % de sårum fœtal bovin, le produit Sanosil S010 (Lots Z0905B8 et Z2012B7), prát É l emploi, entraàne une inactivation totale du virus de la grippe A (H1N1) aprös dix minutes d exposition É tempårature ambiante (20,0ÇC), råpondant ainsi aux exigences de l U.S. EPA pour l homologation comme virucide. Selon le Directeur d Etude, aucune circonstance n a entachå la qualitå ou l intågritå des donnåes. L usage du nom, du logo ou de toute autre repråsentation d ATS Labs est interdit sans l autorisation Åcrite d ATS Labs. Par ailleurs, ATS Labs ne peut átre citå ou ÅvoquÅ dans un quelconque document promotionnel, communiquå de presse, publicitå ou matåriel similaire (que ce soit sous forme Åcrite, orale ou Ålectronique) sans l autorisation Åcrite expresse d ATS Labs.
10 TABLEAU 1 : RÅsultats pour le virus et le tåmoin Effets de Sanosil S010 (Lots Z0905B8 et Z2012B7) aprös dix minutes d exposition au virus dåshydratå de la grippe A (H1N1) sur une surface inanimåe Dilution TÅmoin cellulaire TÅmoin Virus dåshydratå (GROUPE A) 000+ Virus de la grippe A (H1N1) + Lot Z0905B8 (GROUPE B) Virus de la grippe A (H1N1) + Lot Z2012B7 (GROUPE B) TCID 50 /0,1 ml 10 4, ,5 10 0,5 Dilution TÅmoin cellulaire TABLEAU 2: RÅsultats pour les tåmoins de cytotoxicitå CytotoxicitÅ de Sanosil S010 sur les cultures de cellules de rein de singe RhÅsus (RMK) TÅmoin de cytotoxicitå Lot Z0905B8 (GROUPE C) TÅmoin de cytotoxicitå Lot Z2012B7 (GROUPE C) TCID 50 /0,1 ml <10 0,5 10 0,5 (+) = Positif (pråsence du virus d essai) (0) = Absence de dåtection du virus d essai et/ou absence de cytotoxicitå
11 TABLEAU 3: RÅsultats pour le contrâle de neutralisation Niveau non virucide de la substance É l essai (Contrâle de neutralisation) Dilution TÅmoin cellulaire Virus d essai + TÅmoin de cytotoxicitå Lot Z0905B8 (GROUPE D) Virus d essai + TÅmoin de cytotoxicitå Lot Z2012B7 (GROUPE D) (+) = Positif (pråsence du virus d essai) aprés addition de solution-mére de virus Ç faible titre (conträle de neutralisation) (0) = Absence de dåtection du virus d essai et/ou absence de cytotoxicitå Les råsultats du conträle de niveau non virucide montrent que la substance Ç l essai est neutralisåe Ç une TCID 50 infårieure ou Ågale Ç 0,5 log 10 pour les deux lots.
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