Dystrophies Musculaires Thérapie génique et Thérapie cellulaire

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1 Dystrophies Musculaires Thérapie génique et Thérapie cellulaire Pr. François Rivier Service de Neuropédiatrie CHU de Montpellier EA Université Montpellier I

2 Plan q Les dystrophies musculaires q Prise en charge actuelle q Thérapie Génique q Thérapie Cellulaire

3 Situation du sujet: Les Dystrophies Musculaires? Appartiennent au groupe des Maladies neuromusculaires Maladies du système nerveux périphérique Amyotrophies spinales infantiles Neuropathies sensitivomotrices Myasthénies Maladies musculaires Myopathies congénitales Dystrophies musculaires

4 Situation du sujet: Les Dystrophies Musculaires? Nécrose Cellules satellites Régénération Maladies dégénératives du muscle Squelettique Cardiaque Fibrose - Adipose Disparition des myofibres En fonction de l age de début Dystrophies musculaires Congénitales Progressives

5 Situation du sujet: Les Dystrophies Musculaires? Maladies dégénératives du muscle Congénitales (début avant 8 mois) 10 formes différentes Progressives 25 formes différentes Dystrophinopathies 1/3000 NN masc

6 Situation du sujet: Les Dystrophinopathies? Récessives liées à l X Gène DMD Xp21 = 2,25 Mpb Continuum clinique: Duchenne MD Becker MD Formes frustres Muscle Cœur Cerveau

7 Dystrophies Musculaires: Signes d appel Difficultés motrices Troubles de l autonomie motrice Chutes fréquentes Fatigabilité anormale Douleurs musculaires Troubles orthopédiques Troubles de la statique rachidienne Cyphose, hyperlordose, scoliose Malpositions, déformations des pieds équin Troubles cognitifs Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) Myotonie de Steinert

8 Dystrophie Musculaire de Duchenne: Évolution Perte de la marche autour de 10 ans Scoliose et effondrement en lordose lombaire Perte des gestes de la vie quotidienne Insuffisance respiratoire restrictive Cardiomyopathie dilatée Décès au cours de la 2ème ou 3ème décennie (DMD) Malgré une prise en charge multidisciplinaire

9 Prise en charge actuelle: Multidisciplinaire Neuropédiatrique diagnostic, coordination, nouveaux ttt Génétique Orthopédique conseil génétique préserver l autonomie et le bien être Cardio-respiratoire cardiomyopathie et IR Nutritionnelle lutte contre l obésité Educative Psychologique Importance de l AFM et des SRAI

10 Prise en charge actuelle: Traitements proprement dit? Réentraînement musculaire: Amélioration de l endurance? Démontré pour les muscles respiratoires Stéroïdes: X essais européens et nord-américains Prednisone ou prednisolone 0,75 mg/kg/j Déflazacort 0,9 mg/kg/j Bénéfice sur la fonction motrice et l autonomie Scoliose? Cardiomyopathie? Long terme?

11 Traitement à venir: Thérapie Génique? Thérapie génique «classique» changer le gène Tout à été essayé: Vecteurs viraux (Adénovirus, Rétrovirus, Adeno-associated virus) Vecteurs plasmidiques Cellules souches de type SP Sans vecteur Pour apporter: dystrophine totale, minidystrophine, microdystrophine Difficultés: Voie IM: - peu de diffusion - réaction inflammatoire - réaction immune - masse de tissu à traiter Structure du muscle: matrice extracellulaire

12 Traitement à venir: Thérapie Génique? Thérapie génique «ciblée» réparer le gène Thérapie génique par saut d exon: Goyenvalle A et al. Science 2004;306: Vecteur AAV Très efficace pour la transduction des cellules musculaires Séquense antisens liée à un petit ARN nucléaire, snrna U7 Injection intra-artérielle chez la souris mdx (mutation exon 23) restauration de l expression de la dystrophine + protéines associées restauration de l intégrité membranaire récupération d une résistance à l effort normal 40% des patients DMD seraient concernés traitement à la carte transformation d un DMD en BMD avec expression d une protéine tronquée

13 Traitement à venir: Thérapie Génique? Thérapie génique «ciblée» Trans lecture de codon stop: Gentamicine Action au niveau des ribosomes Efficacité est plus importante en fonction: du type de codon stop : UGA > UAG > UAA du nucléotide en amont Une étude avec un effet significatif chez la souris mdx Barton-Davis ER et al. J Clin Invest 1999;104: Chez l homme? Wagner KR et al. Ann Neurol 2001;49: Politano L et al. Acta Myol. 2003;22:15-21 Autres molécules à l étude

14 Traitement à venir: Thérapie Cellulaire? Nécrose Cellules satellites Régénération? Cellules Souches Fibrose - Adipose Disparition des myofibres Maladies dégénérative du muscle Squelettique Cardiaque

15 Les Cellules Souches Myogéniques Différentes sources de cellules myogéniques Différents types de cellules myogéniques Limites et potentialités?

16 Différentes sources de cellules souches myogéniques Cellules Satellites Myoblastes Monopotentielles SP cells FACS Multipotentielles MDSC - Preplate Multipotentielles CS isolées dans le Muscle CS Nerveuses Muscle CS isolées en dehors du Muscle CS cutanées SP cells CS Endothéliales CS Adipocytaires CS hématopoïétiques Moelle osseuse Sang de cordon ombilical Sang circulant CS mésenchymateuses MAPC

17 Différent types de cellules souches myogéniques q Myoblastes (cellules satellites activées) q Muscle-Derived Stem Cells (MDSCs) q SP cells q MAPCs q Mesoangioblasts q CD133 Pos

18 Myoblastes & Muscle-derived stem cells q Injection IM de cellules mononuclées musculaires: myoblastes + autres types de cellules Souris mdx Patients DMD Bonne tolérance cellules MDSC (preplate, repiquage) J. Huard Souris mdx Efficacité limitée Dans le temps (destruction par une réaction immune et inflammatoire après qqs mois) Dans l espace (quelques centimètres autour du site d injection) Traitement d appoint de certains muscles?

19 Les cellules souches de type SP: Fraction enrichie en CS avec capacité de reconstitution à long terme SP cells: expulsion du colorant Hoechst,Propriété physique dynamique Pompe MDR Bcrp1/ABCG2 Isolement par FACS 1000 Hoechst Hoechst + Vérapamil MO FL4-H: ho SP cells 68.3 FL4-H: ho Goodell et al. 1996; MP cells FL5-H: pi FL5-H: pi Gussoni et al. Nature 1999 Hoechst FL4-H: ho SP cells MP cells FL5-H: pi FL4-H: ho FL5-H: pi Muscle PI

20 Les cellules souches de type SP q Disponibilité? Diffusion dans tous les muscles après injection IV q Efficacité chez la souris? Reconstitution du système hématopoïétique après irradiation létale Fusion avec les fibres musculaires du receveur Expression de la dystrophine chez la souris mdx? 5% avec SP cells provenant de la moelle osseuse ou du muscle Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation Gussoni et al., Nature 1999;401:

21 Les cellules souches de type SP Corbel et al. Nature Medicine 2003;9: Camargo et al. Nature Medicine 2003;9: Greffe clonale d une cellule souche hématopoïétique SP Descendance d une seule cellule SP peut Reconstituer le système hématopoïétique (après irradiation létale) Participation à la régénération musculaire Spontanément dans le panniculus carnosus Après lésion dans le tibialis anterior Chez la souris mdx

22

23 Pas de greffe musculaire chez la souris desmine-/- Participation à la régénération musculaire: Les noyaux dérivés des cellules souches hématopoïétiques présents dans les myofibres proviennent de cellules inflammatoires circulantes. Elles seraient incorporées par fusion au cours de la formation des myofibres Camargo et al. Nature Medicine 2003;9:

24 Les cellules souches de type MAPC Jiang et al. Nature 2002;418:41-49 MAPC = Multipotent Adult Progenitor Cells q Isolées au sein des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse par des techniques de culture, propriété physique (adhérence Fibronectine) q Propriétés comparables aux cellules souches embryonnaires: Capacité de prolifération à long terme in vitro Injection d une cellule MAPC dans un blastocyste murin Participation à la majorité des lignées cellulaires Des cellules souches mésenchymateuses sont présentes dans différents tissus adultes: Muscle, Cerveau

25 Les cellules souches de type MAPC Muguruma et al., Experimental Hematology 2003;31: MAPC isolées à partir de moelle osseuse congelée provenant de 21 donneurs sains In vitro: - différenciation en myocyte avec 5%FCS, VEGF, bfgf, IGF-1 In vivo: - participation a la régénération musculaire après culture et injection IM chez la souris NOD/SCID dont le muscle a été lésé par la cardiotoxine

26 Mesoangioblast: small vessels-derived stem cells Sampaolesi et al. Science 2003;301: q In vivo: Après injection intra artérielle chez la souris déficiente en a-sarcoglycane: correction de 30% des muscles en amont (processus dystrophique + expression a-sarcoglycane + fonction) Control a-sg null Réussite de la transplantation grâce à la voie intra artérielle et/ou le type de cellules sélectionnées?

27 Human circulating AC133 (CD133) Torrente et al., JCI 2004;114: q In vitro: Formation de myotubes en co-culture avec des cellules myogéniques ou avec des cellules sécrétant Wnt q In vivo: après injection intramusculaire ou intra artérielle chez la souris scid/mdx, les cellules AC133 participent au renouvellement des cellules satellites participent à la régénération musculaire permettent l expression de la dystrophine humaine dans au moins 10% des myofibres après injection IM Similarités entre les cellules AC133+ circulantes et les MDSCs?

28 Chez l homme? q 1 patient connu: Transplantation MO père à 1 ans pour X-SCID Diagnostic de DMD à 12 ans, délétion exon 45 Phénotype Becker avec: myofibres exprimant une dystrophine tronquée Présence de noyaux du donneur ayant fusionnées avec moins de 1% des fibres musculaires Long-term persistence of donor nuclei in a DMD patient receiving bone marrow transplantation Gussoni et al., JCI 2002;110:

29 Différents mécanismes de régénération musculaire par transplantation cellulaire? Rudnicki Nature Medicine 2003;9: MDSC SP cells 1 Myogenic precursor Satellite cell Myoblast SP cells CD133 2 Myogenic precursor Satellite cell Myoblast SP cells? MAPC? 3 Myogenic precursor Satellite cell Myoblast

30 Cellules souches myogéniques: une voie thérapeutique? Beaucoup de contraintes q Nécessité d un muscle en régénération q Muscle sans trop de fibrose } Solutions? Certaines formes de dystrophies musculaires Le plus tôt possible q Masse du tissu à traiter q Large distribution du tissu à traiter } Voie intra vasculaire q Structure du muscle squelettique densité de la matrice extracellulaire tissu hautement différencié qui possède son propre système de régénération q Source cellulaire facile à obtenir } Qualité des cellules sélectionnées Tissus hématopoïétiques

31 ESSAIS THERAPEUTIQUES EN COURS OU PREVUS Source AFM

32 Dystrophie musculaire de Duchenne et de Becker (DMD et DMB) Essai thérapeutique de phase II de thérapie cellulaire Rationnel : L étude de phase I de faisabilité et de tolérance de l injection de myoblastes provenant d un donneur, dans le tibialis anterieur d'enfants âgés de 5 à 15 ans a montré l expression de dystrophine dans 10 à 50% des fibres musculaires dans la partie du muscle (1 cm3) injectée. Objectif : Evaluer la tolérance et l efficacité de l injection de myoblastes provenant d un donneur, dans la totalité d un biceps d adultes atteints de la maladie de Duchenne. Critère d inclusion : Patients atteints d une DMD ou DMB dont la biopsie musculaire présente moins de 20% des fibres musculaires dystrophine-positives (10 patients âgés de 18 ans ou plus, dont 3 ayant participé à la phase I) Investigateur principal : Pr. J.Tremblay (Québec) Centre investigateur : Québec

33 Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) Essai clinique phase I de thérapie génique Rationnel : Les connaissances acquises ont conduit à envisager une essai d administration intra veineuse locorégionale de plasmide dystrophine pleine longueur constituant la méthode la plus accessible de traitement par transfert de gène de la myopathie de Duchenne. Cet essai s appuiera sur, d une part les résultats en matière de sécurité de l essai de phase I du plasmide dystrophine achevé en 2003, et d autre part sur les données d efficacité de transfection par injection intra-veineuse chez le singe, le rat, la souris mdx et le chien grmd. Objectif : Evaluer la faisabilité et la tolérance de l'administration intraveineuse sous pression de plasmide dystrophine pleine longueur, chez des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. Centres investigateurs : Etats-Unis / France

34 Dystrophie musculaire facio-scapulo-humérale (FSH) Essai clinique de phase I, ouvert, sans bénéfice individuel direct, de thérapie cellulaire autologue Rationnel : L'atteinte musculaire sélective et asymétrique de la FSH permet d'envisagerla réimplantation dans des muscles malades, de myoblastes produits dans les territoires non affectés d'un même patient, dans le but d'en améliorer le potentiel régénératif. Objectif : Etude de faisabilité et de tolérance clinique et biologique d une série d'injections, dans le muscle tibial antérieur, de myoblastes autologues prélevés dans un muscle cliniquement indemne de la maladie, après 3 semaine -1 mois de culture cellulaire. Critère d inclusion : Patients âgés de 18 à 65 ans (9 patients). Investigateur principal : Pr. C.Desnuelle (Nice) Centres investigateurs : Nice

35 Dystrophie musculaire oculo-pharyngée (DMOP) Essai thérapeutique phase I/II multicentrique avec bénéfice individuel direct, de traitement de la dysphagie par thérapie cellulaire Rationnel : Une approche par greffe de myoblastes autologues dans les muscles pharyngés a été validée dans un modèle canin, ce qui a permis de vérifier la sécurité de la procédure et la survie des myoblastes injectés. Objectif : Evaluer la tolérance et l'efficacité de l injection dans le muscle pharyngé de myoblastes autologues (provenant d un muscle cliniquement indemne de la maladie). Evaluer l effet sur la qualité de la propulsion pharyngée. Critère d inclusion : Patients qui présentent une dysfonction du sphincter supérieur de l œsophage (10 patients). Investigateur principal : Pr. J.Lacau Saint Guilly (Paris-Hôpital Tenon) Centres investigateurs : Paris (Hôpital Tenon)

36 Gamma-sarcoglycanopathie ou dystrophie musculaire des ceintures type 2C (LGMD 2C) Essai clinique de thérapie génique de phase I. Rationnel : Une étude a montré la faisabilité d un transfert du gène de la gamma-sarcoglycane par un vecteur viral AAV1 chez la souris, ainsi que la stabilité de la protéine exprimée. Objectif : Evaluer la tolérance du transfert de gène à l'aide d'un AAV1, contenant le gène gamma-sarcoglycane chez des personnes atteintes d'une dystrophie musculaire des ceintures de type 2C. Critères d inclusion : Patients ayant un diagnostic confirmé de LGMD 2C établi sur la clinique, la biopsie musculaire et la génétique et portant la mutation del525t à l état homozygote. (9 patients, âgés de plus de 15 ans). Investigateur principal : Pr. S.Herson (Paris) Centre investigateur : Paris (Pr S.Herson, Pr. B.Eymard)

37 Dystrophie musculaire de Duchenne Essai de phase I/II de thérapie génique par exon-skipping Rationnel : L'approche thérapeutique dite du saut d'exon est une technique de "chirurgie du gène «réalisée au niveau de l ARN: des ARN anti-sens transportés par des vecteurs viraux sont injectés et vont masquer la séquence mutée sur le gène, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. Objectif : Evaluer la faisabilité et la tolérance sur 4 patients atteints de maladie de Duchenne d une injection intramusculaire d oligonucléotides de synthèse visant au saut de l exon 51, étudier la production et l intégration d une dystrophine plus courte mais fonctionnelle et mesurer sa persistance dans le temps (28 jours). Investigateur principal :J. Van Deutekom Centres investigateurs :Hollande Commentaire:Cet essai suppose des injections répétées à intervalles réguliers d'arn antisens car ils ne restent pas durablement dans l'organisme. D'où l'intérêt de l'approche alternative proposée par les chercheurs de Généthon qui explorent actuellement une voie d'administration des ARN antisens grâce à un vecteur viral AAV capable de produire dans les muscles ces ARN antisens de manière stable sur la durée.

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