Microscopie Confocale. Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire

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1 Université Paris Descartes L3 - Licence Professionnelle «Industries chimiques et Pharmaceutiques Option Biotechnologie» Microscopie Confocale Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire Bruno SAUBAMEA EA3621 Service de Biologie Cellulaire Service Commun d Imagerie Cellulaire et Moléculaire

2 Pourquoi faire de la microscopie? Limite de résolution ~ 0.1 mm Principe de la microscopie Former une image de l objet grâce à des photons ou des électrons Agrandir cette image grâce à des lentilles

3 Principe de la Microscopie Microscopie en transmission Microscopie en émission Origine du contraste Différences d absorption Origine du contraste Différences d émission Microscopie optique traditionnelle & Transmission Electron Microscopy (TEM) Microscopie de fluorescence & Scanning Electron Microscopy (SEM)

4 Microscopie optique Transmission Emission (fluorescence) Fond clair Champ large Fond noir Confocal Contraste de phase

5 Grossissement et résolution en microscopie optique Grossissement Résolution G = γ ob x G oc R 0 = λ 0.61 n sinα α n Lentilles (focale de l objectif) Lentilles (NA de l objectif) + λ = 500 nm Rayonnement (longueur d onde) NA = n sinα = R = nm G max 1500

6 Préparation des échantillons biologiques pour la microscopie optique Dégradation rapide Fixation Sauf pour l imagerie in vivo Contraste très faible Coloration Colorants classiques Microscopie à transmission Fluorophores Microscopie de fluorescence Opacité des tissus Sectioning Coupes minces (5 à 10 µm) Microscopie en champ large Coupes épaisses (jusqu à 100 µm) Microscopie confocale

7 Microscopie optique en transmission Colorants classiques (Eosine, Bleu Azur, Fuchsine,...) Coupes des tissus en paraffine (plus rarement au cryostat) Epaisseur maximum 10 µm + Idéal pour l histologie Résolution subcellulaire faible In vivo impossible

8 Microscopie d émission de fluorescence Excitation S 1 Emission S 1 S λ (nm) + + Très fort contraste sur un fond quasiment noir Le couplage à des sondes spécifiques (anticorps, ) permet de visualiser quasiment tous les constituants cellulaires Stabilité limitée par le photobleaching

9 Séparation des chemins optiques Trans-illumination Epi-illumination Filtre Image Image Objectif I exc 6 10 I em Miroir dichroïque Objectif Condenseur

10 Sélection des longueurs d onde Cube à fluorescence Cut Off Transmission Image Filtre d émission Dichroïque Filtre d excitation λ (nm) Réflexion

11 Caméra CCD + Acquisition de l image globale Microscopie en champ large lampe Image nette du plan focal + Image floue des plans situés de part et d autre du plan focal dichroïque objectif plan focal Photobleaching de tout l échantillon

12 Microscopie confocale Détecteur Construction de l image point par point pinhole + Elimination de la fluorescence issue des plans non focaux pinhole Tranche optique de moins de 500 nm Optical slicing dichroïque objectif plan focal + Excitation focalisée

13 Slicing optique en microscopie confocale Actine F Champ large Confocal

14 Tranches optiques de qqs centaines de nm Champ large Confocal

15 Résolution en microscopie confocale La résolution est un peu meilleure en confocal qu en champ large Résolution latérale Champ large (WF) R 0 = λ 0.61 n sinα λ = 488 nm R 0 = 213 nm Confocal R 0 = λ 0.46 n sinα ΝΑ = 1.4 R 0 = 160 nm L amélioration des images provient essentiellement de l élimination de la lumière issue des plans non focaux Section optique de moins de 500 nm

16 Fluorescence pinhole Microscopie confocale dichroïque x-scanner y-scanner Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) objectif Fréquence de balayage jusqu à 1000 Hz pour un galvanomètre linéaire, jusqu à 8 khz pour un galvanomètre résonnant Balayage de l échantillon point par point

17 PMT Tension de sortie DAC pinhole Em Exc laser Niveau de gris dichroïque pinhole sur 8 bits sur 12 bits X XY scanner OBJET X Objectif Y 512 x x 1024 IMAGE Y

18 Zoom électronique en microscopie confocale On peut balayer une zone plus petite avec le même nombre de pixels Résolution variable La résolution reste limitée par la diffraction

19 PMT 3 PMT 2 PMT 1 Multi-Colors Confocal microscopy PMT 4 pinhole Laser1 Diode bleue : 405 nm Laser 2 Ar + : 458, 476, 488, 514 nm dichroïque pinhole Laser 3 Laser 4 HeNe : 543 nm HeNe : 633 nm XY scanner Objectif

20 Détection spectrale Pinhole émission PMT 2 Avantages de la détection spectrale PMT 1 1. Adaptable à n importe quel fluorophore Prisme 2. Minimisation des crosstalks 3. Signaux plus forts 4. Mesure des spectres d émission PMT 3 Leica

21 Détection spectrale Avantages de la détection spectrale 1. Adaptable à n importe quel fluorophore 2. Minimisation des crosstalks 3. Signaux plus forts 4. Mesure des spectres d émission Leica

22 Leica TCS SP2 Filtres d émission Pinhole émission Dichroïques Pinhole excitation PMTs Lasers Objectif XY scanner

23 Avantages de la microscopie confocale Obtention de coupes optiques très fines (500 nm) Elimination du flou provenant des plans situés de part et d autre du plan focal - Reconstruction 3D Source lumineuse monochromatique (laser) Pas de filtre d excitation Diminution des crosstalks Imagerie point par point Image d emblée digitalisée Diminution du bleaching de l échantillon Relativement lent Signal/Bruit plus faible Inconvénients de la microscopie confocale Très onéreux Au minimum euros

24 Applications de la microscopie de fluorescence en biologie cellulaire La plupart des molécules constituant les cellules animales ont une fluorescence quasi nulle Marquage fluorescent des organelles ou des molécules d intérêt

25 Marquage fluorescent en imagerie Accumulation sélective d un fluorophore dans un compartiment cellulaire Marqueurs nucléaires DAPI, Sytox, TOPRO, Marqueurs des Mitochondries MitoTracker, Marqueurs du Reticulum Endoplasmique ER tracker, Ex : sonde nucléaire Marquage spécifique d un compartiment subcellulaire (imagerie structurale)

26 Marquage fluorescent en imagerie Couplage covalent d une molécule d intérêt à un fluorophore Extraction Purification Marquage Injection Technique lourde assez peu utilisée aujourd hui

27 Marquage fluorescent en imagerie Marquage spécifique d une protéine par un anticorps fluorescent (immunofluorescence) Protéines de surface in vivo Protéines intracellulaires après fixation et perméabilisation Technique très largement utilisée pour étudier la localisation précise d une protéine

28 Marquage fluorescent en imagerie Fusion d une protéine d intérêt avec une protéine fluorescente Gène X Gène GFP X GFP Gène de fusion GFPs (méduse Aequorea victoria) DsRed (anémone de mer Discosoma striata) RCFP (corail Heteractis scrispa) X GFP Protéine X fluorescente synthétisée par la cellule elle-même Technique de choix pour la localisation in vivo

29 On peut observer des cellules fixées

30 Fibroblastes de cerf Muntjac Marquage du cytosquelette d actine par la phalloïdine-af350 (bleu) Marquage des mitochondries avec un AbI dirigé contre une protéine de la chaine mitochondriale et un AbII couplé AF500 (vert) Marquage du noyau par un intercalant de l ADN, le TOPRO3 (rouge)

31 Cellules de peau de cerf Muntjac Marquage du cytosquelette d actine par la phalloïdine-af680 (gris) Marquage de l appareil de Golgi avec un AbI anti-golgine 97 et un AbII couplé AF488 (vert) Marquage du noyau par un intercalant de l ADN, le DAPI (bleu clair)

32 Spermatozoïde et ovocyte bovins (FIV) Marquage des mitochondries avec le MitoTracker Green FM (jaune) Marquage des microtubules avec un AbI anti-tubuline et un AbII couplé TMR (rouge) Marquage du noyau par un intercalant de l ADN, le DAPI (bleu)

33 On peut observer des cellules vivantes (maintien de conditions in vivo grâce à un incubateur à température et CO2 contrôlés)

34 Vague calcique lors de la fécondation d un ovocyte de Pisaster ochraceus (étoile de mer) Point de contact avec le spermatozoïde L ovocyte a été microinjecté avec une sonde calcique, le Calcium Green-1 Dextran puis imagé toutes les 5 secondes

35 Cellules transfectées avec un gène codant pour une fusion Tubuline - GFP

36 Cellules transfectées avec un gène codant pour une fusion Tubuline - GFP

37 On peut observer des tissus épais avec une haute résolution (jusqu à 50 µm voire plusieurs centaines de µm pour les tissus transparents) impossible en microscopie en champ large

38 Coupe d intestin de raton (50µm) Actine F Champ large Confocal

39 Coupe d intestin de raton (50µm) NHERF1 Actine F ADN

40 On peut réaliser des images en 3 dimensions faisable mais beaucoup plus difficile en microscopie en champ large

41 Cellules CACO2 infectées par des mycoplasmes 1 plan z 1 stack en z ADN marqué par un intercalant, le TOTO-3

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44 Marquage des astrocytes dans le cerveau de rat GFAP (Astrocytes) ADN (Noyaux) Microcapillaire

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47 Microvaisseau dans le cerveau de rat Astrocytes périvasculaires

48 Embryon de Cerebratulus au stade 8 cellules Marquage de l actine (bleu) Marquage des microtubules (jaune)

49 On peut étudier la colocalisation de deux molécules d intérêt (dans la limite imposée par la diffraction soit environ 200 nm) faisable mais beaucoup moins précis en microscopie en champ large

50 Cellules épithéliales bronchiques COMMD1 marquée en vert Rab 11 marquée en rouge Overlay ADN marqué en bleu PAS DE COLOCALISATION

51 1 protéine marquée en rouge Vésicules jaunes 1 protéine marquée en vert COLOCALISATION

52 On peut étudier l interaction entre deux molécules d intérêt (sans être limité par la diffraction) faisable mais beaucoup moins précis en microscopie en champ large

53 Transfert Résonnant d Energie de Fluorescence (FRET) + Donneur Accepteur

54 Association de deux protéines régulatrices de la migration cellulaire Pak + Rac Pak Rac Migration Interaction Rac/Pak uniquement au niveau des lamellipodes

55 On peut étudier la dynamique des molécules d intérêt faisable mais beaucoup plus difficile en microscopie en champ large

56 Shuttling nucléocytoplasmique de STAT1 dans des cellules NIH3T3 Noyau Cytoplasme STAT1-EGFP Bleaching pendant 40s Image toute les 10 minutes Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Après stimulation par l Interféron γ

57 Autres développements Spinning Disk Confocal Microscopy Acquisition en temps réel avec une cadence vidéo Confocal à 2 photons Imagerie à plusieurs centaines de µm de profondeur dans des tissus vivants Microscopie confocale résolue en temps (FLIM) Mesure in vivo de concentrations ioniques (ph, Ca 2+, K +, )