La réponse inflammatoire gastrique à l infection par Helicobacter pylori

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1 La réponse inflammatoire gastrique à l infection par Helicobacter pylori 1 Christophe BURUCOA EA 4331 Laboratoire Inflammation Tissus Épithéliaux Cytokines Université de Poitiers Laboratoire de Bactériologie CHU de Poitiers

2 Helicobacter pylori Bactérie spiralée et mobile Colonise la muqueuse gastrique humaine Infecte 50% de la population mondiale Transmission interhumaine, familiale Gastrite, ulcère, cancer gastrique Tri-thérapie orale Seule bactérie responsable d un cancer chez l homme 2

3 Où en est-on? 1983 la découverte 1987 l ulcère : maladie infectieuse 1994 agent carcinogène de type I ère conférence de consensus 1997 séquençage de séquençage de J ème conférence de consensus 2005 prix Nobel ème conférence de consensus ème conférence de consensus 3 Cancer Résistance

4 Infection à Helicobacter pylori : Modèle d inflammation ANTIMICROBIENS Facteurs bactériens Cellules épithéliales gastriques Inflammation Cancer CYTOKINES CYTOKINES MALADIES MALADES 4

5 Décades Helicobacter pylori Infection Inflammation Gastrite aiguë Gastrite chronique Développement du MALT Hypersécrétion acide 90% Atrophie Métaplasie 5 Ulcère duodénal 10% Gastrite chronique stable 85% Ulcère gastrique 5% Cancer 1% Lymphome

6 Projet Hospitalier de Recherche Clinique Interrégional 2009 Expression des médiateurs de l inflammation dans l infection gastrique à Helicobacter pylori PYLORIKINE 6 Christophe BURUCOA, Christine SILVAIN, Julie CREMNITER ARC : Audrey MERON, Laetitia ROULEAU Tech. : Emilie PEYROT Laboratoire de Bactériologie, Service d Hépato Gastroentérologie, CHU de Poitiers EA4331 Laboratoire Inflammation Tissus Épithéliaux Cytokines, Université de Poitiers Méthodologie : Joëlle GUILHOT, CIC-P 802 Poitiers Ana-Path : Gaëlle FROMONT

7 CagPAI CagA PGN Nod1 NFkB IL-1 IL-8 TNF-a DC VacA Uréase OipA Hsp60 HP-NAP Autres? PN IL-12 IL-10 MF IL-12 Th1 Th2 IL-1b IL-6 TNF-a IFN-g IL-2 TNF-a IL-4 IL-5 IL-13 7

8 CagPAI CagA PGN Nod1 NFkB Défensines HBD2 S100A7 IL-17 IL-22 IL-1 IL-8 TNF-a DC Th17 VacA Uréase OMPs Hsp60 HP-NAP Autres? PN IL-12 IL-10 IL-23 MF IL-12 Th1 Th2 8 IL-1b IL-6 TNF-a IFN-g IL-2 TNF-a IL-4 IL-5 IL-13 Nature Immunol 2007 J Immunol 2005, 2007

9 PYLORIKINE 9 1. Étude transcriptomique des médiateurs de la réponse inflammatoire de la muqueuse gastrique : RT-PCR quantitative Réponse Th17 : IL-17, IL-23, IL-22 Peptides antimicrobiens : BD2, BD3, S100A9 Réponse Th1 : IFNg, TNFa, IL-2, IL-12 Réponse Th2 : IL-4, IL-13, IL-10 IL-8, IL-1 Marqueurs d infiltration : PNN, CD, LT, MP 2. Quantification de H. pylori et recherche des facteurs de virulence Présence et quantification par PCR quantitative temps réel Facteurs de virulence : îlot Cag, caga, génotypage vaca, icea, baba, saba, OipA, dupa : PCR temps réel Culture

10 PYLORIKINE Etude cognitive, prospective, multicentrique, nationale, interventionnelle (deux biopsies supplémentaires propres à l étude). Objectif principal : caractériser la réponse anti-infectieuse Th17 dans les biopsies gastriques de patients lors des pathologies sévères liées à H. pylori non infectés 100 infectés - gastrite chronique (90% des infectés) 50 - ulcère duodénal (6% des infectés) 50 - ulcère gastrique (4% des infectés) 50 - cancer gastrique (1% des infectés) 50 et lésions précancéreuses (3%) 10

11 PYLORIKINE Etude multicentrique : 9 centres Poitiers Angers Limoges La Rochelle Niort Poitiers Polyclinique Henri Mondor Ambroise Paré Lariboisière 11

12 DEROULEMENT PRATIQUE Inclusion 1500 patients biopsiés Consentement éclairé 2 ans + 1 Biopsies Évaluation et suivi centres CR Endoscopie CR Histologie UD UG Normal Lésions prék & ADK Gastrite Poitiers Hp+ PCR HP + culture Hp+ Hp- Hp+ Hp

13 Résultats préliminaires au 25 janvier 700 patients inclus 110 analysables : 58 non infectés, muqueuse normale 52 infectés 32 gastrites 4 ulcères duodénaux 3 ulcères gastriques 13 lésions précancéreuses et cancers 1 atrophie 10 métaplasies 1 dysplasie 1 adénocarcinome 13

14 Expression relative des différentes interleukines et défensines Infectés/non infectés 14 expression Hp+/Hp- HBD IL IL 17A IL S100A p

15 Expression relative des différentes interleukines et défensines Gastrites/pathologies sévères (UD, UG, prék et K) 15 expression Gastrite/sévère HBD IL IL 17A IL S100A p

16 Statut caga/pathologie 16 caga+ Gastrite Sévères 18 2 caga- U. duodénal 4 0 U. gastrique 2 1 prék et K Densité bactérienne UFC/mg de biopsie CagA CagA p expression caga+/caga- HBD IL IL 17A IL S100A p

17 Expression relative (GOI/REF) Expression relative (GOI/REF) Résultats HBD2 * * * * * IL8 * Muqueuse normale Gastrite Ulcère Patho sévères Muqueuse normale Gastrite Ulcère Patho sévères

18 Expression relative (GOI/REF) Expression relative (GOI/REF) Résultats IL17A * * * IL22 * Muqueuse normale Gastrite Ulcère Patho sévères Muqueuse normale Gastrite Ulcère Patho sévères

19 Expression relative (GOI/REF) Résultats S100A Muqueuse normale Gastrite Ulcère Patho sévères

20 nombre d'inclusions cumulé Progression des inclusions Evolution des inclusions Théorique Réel févr-10 avr-10 juin-10 août-10 oct-10 déc-10 févr-11 avr-11 juin-11 août-11 oct-11 déc-11 févr-12 avr-12 juin-12 août-12 oct-12 20

21 Perspectives mettre en évidence des profils inflammatoires spécifiques de chaque pathologie (ulcères, cancers, gastrites) mettre en évidence le rôle de la voie Th17 et des défensines mettre en évidence l impact des facteurs de virulence (cagpai, caga, oipa, vaca ) pistes pour des expérimentations contrôlées : nécessité de modèles d étude

22 AGS + HP141k AGS + HP141s AGS quantité d'il-8 en pg/ml Intérêt des modèles Mutants des facteurs de virulence In vitro AGS Coculture pangénomique moyenne (n=4) sauvage mutant In vivo souris 22

23 CagPAI CagA PGN Nod1 NFkB défensines IL-17 IL-22 Validation du modèle IL-1 IL-8 TNF-a DC Th17 Uréase OMPs Hsp60 HP-NAP Autres? PN IL-12 IL-4 IL-23 MF IL-12 Th1 Th2 IL-1b IL-6 TNF-a IFN-g IL-2 TNF-a IL-4 IL-5 IL-13 23

24 Modèle murin Gavage C57/Bl6 H. pylori 141 CagA+/CagA- sacrifices : étude cinétique (J3-J30) cinétique de la réponse inflammatoire RT-PCR Q cytokines Infectiosité UFC/estomac 24

25 Densité d infection 25

26 Cinétique des cytokines 26

27 Cinétique des défensines 27

28 Modèle murin : déception pas d influence de caga sur : la colonisation l inflammation On ne retrouve pas dans le modèle murin ce qu on observe chez les malades 28

29 Mise en place d un nouveau modèle : cellules gastriques ex vivo Patients atteints d obésité morbide : Sleeve gastrique Pr Jean-Pierre Faure 29 Dr Thierry Barthès

30 21 Approche expérimentale Estomac réséqué Fundus Dissociation mécanique Récupération de la muqueuse gastrique Digestions enzymatiques Filtrations Lavages.. Mise en culture Antre 50 µm

31 I. Isolation and culture of primary gastric cells : development of the cell culture model J2 200X Figure 1. Antral and fundic gastric epithelial cells after 48h of culture. A,D Gx40 ; B,E Gx100 ; C,F Gx200 31

32 26 Modèle d infection par H. pylori Etablissement de la dose infectieuse Dose infectieuse (Bactéries/cellul e) Dose infectieuse (Bactéries/cellul e) Dose infectieuse (Bactéries/cellul e) Production dose-dépendante 1 faible dose (10 bactéries/cellule) et 1 forte dose (100 bactéries/cellule)

33 II. Expression of Cytokeratin 18, Mucin 1, Mucin 5AC and Trefoil Factor 1 in primary gastric human epithelial cells Primary antral cells AGS cells Mucine 1 Mucine 5AC TFF-1 Rodhamine CK18 Alexafluor B D F RedX H Control J L 488 Control Figure 2. Specific cytoplasmic immunostaining in primary antral cells and AGS cells: Mucin 1 (A) & (B); Mucin 5AC (C) & (D); Trefoil Factor 1 (E) & (F); Rhodamine-RedX negative controls (G) & (H); CK18 (I) & (J); Alexa fluor 488 negative controls (K) & (L). 33

34 III. Chemokine, cytokine and antimicrobial peptides expression after stimulation with H. pylori Réponse 3H Inflammatoire HP B128 cagpai HP B128 cagm Antimicrobienne Figure 3. Chemokines gene expression by H. pylori-stimulated primary epithelial cells. Antral cells were cultured in the presence of H. pylori B128 or B128ΔcagM at MOI of 10 or 100 for 3h or 24h. QRT-PCR analysis was carried out on total RNA from 3 independent primary cultures. mra expression levels are normalized using housekeeping genes and expressed as the fold increase above unstimulated cultures. 34

35 perspectives du modèle Appliquer le modèle à l étude d autres facteurs de virulence Étudier la variabilité de la réponse inflammatoire selon les donneurs collaborations 35

36 Axe Helicobacter pylori Formes coccoïdes Inflammation cancer H Vin et Helicobacter H H H 36 Transfert d ADN chromosomique Systèmes de sécrétion de type IV Virulence H H SELDI Diagnostic Résistance Microbial Drug Resistance 2002 FEMS Microbiol Letters 2002 J Clin Microbiol 2002 Helicobacter 2010 Infect Immun 2003 Aliment Pharmacol Ther 2003 Antimicrob. Agents Chemother 2005 BMC Genomics 2010 Microbiology 2005 FEMS Microbiol Lett 2005 Crit Care 2006 Ann Clin Microbiol 2010 Helicobacter 2006 J Clin Microbiol 2008 Proteomics 2009 AAC 2011

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