Détection d`un clone HPN par cytometrie en flux chez les patients atteints d`aplasie médullaire.
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- Édouard Beaudet
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1 Détection d`un clone HPN par cytometrie en flux chez les patients atteints d`aplasie médullaire. F.Harieche, F.Zerhouni, N.Aouanouk, N.Abdennebi, F.Boukhemia, A.Talbi, R.M.Hamladji.
2 Hémoglobinurie paroxystique nocturne Maladie acquise Clonale: une (+ieures) cellule(s) souche(s) hématopoeitique(s) Mutation somatique du gène PIG-A Xp22 (Phosphatidyl Inositol Glycane de classe A) Sensibilité anormale des cellules à l`action lytique du complément
3 Glycosyl Phosphatidyl Inositol (ancre GPI) mb cytoplasme cytoplasme
4 Déficit en molécules GPI ancrées normale déficit partiel Déficit total Atteinte de toutes les lignées cellulaires : Leucocytes Plaquettes Globules rouges +++
5 Protéines GPI déficientes HPN Protéines du complément DAF CD55 MIRL CD59 enzymes récepteurs Autres protéines Acétylcholinestérase (GR) Phosphatases alcalines (GB) 5`exonucleotidase (lympho) Fcg-type III (CD16a) Récepteur LPS bactériens (CD14) Récepteur a l`urokinase CD24, CD66b, CD67
6 2 protéines régulatrices de l`action du complément CD55: DAF (Decay Accelerating Factor) Accélère la production de C3 convertase. CD59: MIRL (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis) Inhibe la formation du complexe d`attaque membranaire (CAM = C5b-9). facteurs de protection des cellules contre l`action lytique du complément.
7 Classification: signes cliniques + histoire naturelle HPN classique Signes d`hémolyse intra vasculaire HPN / insuffisance médullaire Signes d`hémolyse intra vasculaire HPN infra clinique Pas de signes d`hémolyse + clones CMF Absence d`hémopathie associée Anomalie médullaire sous-jacente: Aplasie médullaire, MDS Anomalie médullaire aplasie médullaire +++ Anémie réfractaire
8 MDS Associés expansion de cellules PIG-A mutées. Défaut d`expression de mol GPI ancrées. MDS/HPN
9 Patients 6 patients: consult Hematologie- CPMC Pre-greffe age: 23, 24, 25,28,55 et 60 ans. Sexe: 5 hommes 1 femme S/type FAB: 2 AR 4 RCMD (EB + Gx).
10 Méthodes -1- Test de Ham Dacie: Sensibilité des hématies au complément en milieu acide. Cytomètrie de flux: IFD GR CD55-CD59/ GPH-A PN CD16-CD66b/CD15(CD33) mono CD14/CD64 Fenêtre immunologique: Ag non GPI- ancrés.
11 Méthodes -2- Transfusions: Augmente la proportion de cellules CD55 et CD59 normales: diluer clone!!! Avant / distance de toute transfusion (1 mois). Estimation précise de GR GPI déficientes. granulocytes: Non affectés par les transfusions Durée de vie normale Reflètent mieux la proportion de cellules déficitaires.
12 CMF analyse intensités de fluorescences I CD59-PE CD59-PE CD59-PE CD59-PE Identification d`une pop déficiente en mol GPI- dépendantes. Estimation de la proportion des cellules GPI déficientes (taille clone). Préciser le degré du déficit: total ou partiel: type I, II ou III.
13 CMF: interprétation Diagnostic HPN: Pop déficiente en au moins 2 mol GPI dépendantes faux positifs: déficits héréditaires isolés Déficit sur deux pop cellulaires différentes : faux neg CD14/ infections bact; CD16/ cellules immatures, forme transmembranaire. Expression des résultats: % de cellules GPI déficientes: Quantification du clone: Seuil: 5%. Intensité de fluorescence: log 3 types de pop: HPN III: déficit total HPN II: déficit partiel HPN I: absence de déficit (cellules normales).
14 Résultats Clone HPN: 4 patients patient Age (ans) s/type FAB Signes d`hémolyse Ham -Dacie CMF UP1 24 A.R absents négatif Normale UP2 55 RCMD absents Négatif 6% type II UP3 28 A.R Urines foncées matin Positif 35% type III UP4 25 RCMD Absents Négatif 8% type II UP5 60 RCMD Absents Négatif Normale UP6 23 RCMD Urines foncées matin Positif 25% type III
15 Commentaires -1-: MDS/HPN: 4 patients: 2 HPN infra cliniques type II (déficit partiel). clones< 10% Ham Dacie négatif 2 HPN + signes cliniques d`hémolyse type III (déficit total). clones >20% Ham Dacie positif. Type III: s`accompagne de signes cliniques d`hémolyse Type II: formes infra cliniques (GR +protégés?). Série «petite»
16 Commentaires -2- Ham Dacie: Manque de sensibilité: 2/4 (taille clone seuil+?) Une seule pop GR: sous estimation Lyse cellulaire (ddv courte) Transfusions CMF: Sensible (1%) Rapide: 1h Réalisée sur sang périphérique. Plusieurs pop cellulaires: PN++ et mono: meilleur reflet de la taille du clone Outil diagnostic majeur de l`hpn
17 Conclusion MDS/HPN sont souvent retrouvés chez le même patient. MDS forme de complication de L`HPN (1,2). HPN: polymorphisme clinique: hypoplasiques myelodysplasiques hémolytiques et thrombotiques Nécessité de rechercher un clone HPN anémie ou cytopénie réfractaire en l`absence de signes d`hémolyse. CMF est outil fiable: référence. 1.G.Socie:Hematol Cell Therapy (1997) 39: C.Parker et al:blood 2005.
18 Cyto morphologie -2-
19 Cyto morphologie -3-
20 Cyto-morphologie -1-
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