(quelques) méthodes pour l'identification de modules cis-régulateurs (CRM) Carl Herrmann TAGC & Aix-Marseille Université carl.herrmann@univ amu.

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1 (quelques) méthodes pour l'identification de modules cis-régulateurs (CRM) Carl Herrmann TAGC & Aix-Marseille Université amu.fr -1Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

2 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012 [ Sandelin & Wasserman (2004) ] -2-

3 Vocabulaire enhancer séquence d'adn qui a une activité régulatrice (vérifiée par une expérience de gène rapporteur) on ne connaît pas forcément la composition en TFBS! notion biologique module cis-régulateur (CRM) séquence d'adn ayant des propriétés in-silico compatibles avec les propriétés d'un enhancer notion bioinformatique CRM enhancers -3Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

4 Exemples d'enhancers drosophile ftz zebra element eve stripes 2 & 3+7 elements repression site cluster stripe 2 stripes rho lateral neurectoderm stripe element kni posterior element Ubx PBX element ps 6,8,10,12 stripes Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012 blastoderm + Mesoderm at GBE -4-

5 Validation expérimentale gène rapporteur eve stripes 2 expression endogène de eve -5Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

6 Propriétés des enhancers grande densité de TFBS pour des TF identiques homotypiques enhancer de zen pour des TF différents hétérotypiques enhancer de kni conservation évolutive vrai pour certains enhancers (ex : régions ultra- conservées chez les vertébrés [Bejerano, Science (2004)]) remis en question par des études genome-wide récentes (enhanceurs cardiaques [Visel, Nature (2010)]) -6Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

7 Recherche de clusters de sites Recherche de clusters homotypiques de sites Dorsal: recherche de deux sites ou plus (haute affinité) dans une fenêtre de 400 ou 1000 pb Markstein et al. "Genome-wide analysis of clustered Dorsal binding sites identifies putative target genes in the Drosophila embryo". Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99: Recherche de clusters hétérotypiques impliquant les gènes de segmentation: recherche de groupes de sites pour 5 facteurs (Bcd, Hb, Cad, Kni, Kr) dans une fenêtre de 700 bp Berman BP et al. "Exploiting transcription factor binding site clustering to identify cisregulatory modules involved in pattern formation in the Drosophila genome." Proc. Natl. Acad. Sci.(2002) USA 99: Dans les deux cas, les enhancers identifiés ont été évalués par des constructions transgèniques (enhancer + gène rapporteur) et/ou des hybridation in situ. -7Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

8 Formation de l'axe dorso-ventrale dorso ventral le facteur de transcription dorsal (dl) forme un gradient de concentration selon l'axe dorso-ventrale les gènes cibles de dl réagissent à ce gradient au delà d'un certain seuil de concentration une centaine de gènes cible ont été identifiés par des approches génétiques et genome-wide [Biemar, PNAS (2006)] -8Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

9 Formation de l'axe dorso-ventrale zen sog Markstein et al. "Genome-wide analysis of clustered Dorsal binding sites identifies putative target genes in the Drosophila embryo". Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99: exemple de 2 gènes cibles : zen et sog leurs enhancers contiennent plusieurs sites pour dl Stratégie : recherche de clusters homotypiques de sites Dorsal: recherche de sites dl de haute affinité dans une fenêtre de taille fixe Nombre de sites? Taille de la fenêtre? -9Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

10 Marksteinet al Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

11 Markstein et al. Ady Phm Patron d'expression compatible avec le patron typique des gènes cibles de Dl (expression ventrale) - 11 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

12 Mise en place de l'axe antéro-postérieure Bcd, Nanos Kr, Kni, Gt, Hb,Tll Eve En LIFE: The Science of Biology, Purves et al, Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

13 Berman et al. Sites that occur in 700-bp windows containing at least 13 predicted binding sites Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

14 Berman et al. Results test utilisant un jeu de contrôle de 19 CRM actifs dans le dévelop. embryonnaire de la drosophile sensibilité = bonnes prédictions/total des positifs = VP / (VP+FN) spécificité = bonnes prédictions/ensemble des prédictions = VP/(VP+FP) - 14 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

15 Berman et al. Results Fig. 3. Expression patterns of selected genes flanking novel binding site clusters. We examined the expression patterns of 49 genes adjacent to one of the 28 novel binding site clusters described in Table 2 in syncytial and cellular blastoderm embryos (whole mount RNA in situ images are available in Table 2 (which is published as supporting information on the PNAS web site) and on the Berkeley Drosophila Genome Project website ( Eleven of these genes representing 10 clusters had early embryonic expression patterns characteristic of genes regulated by maternal and gap transcription factors and are shown here., References for flanking genes are as follows: gt (25, 30, 37-40), otd (41-43), btd (44, 45), pdm1 (46), pdm2 (46), Dfd (47-49), Antp (49, 50), ftz (5153), odd (54), and psq (55) - 15 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

16 Berman et al. - Results Fig. 4. Identification of a novel enhancer controlling posterior expression of giant. (A) Cluster of binding sites found between 2.9 Kb and 1.8 Kb upstream of giant. The DNA segment surrounding the cluster (labeled "posterior enhancer") was cloned into a lacz fusion construct and introduced into the genome via germline transformation as described in Materials and Methods. (B and C) Expression of giant in syncitial blastoderm stage embryos as determined by RNA in situ hybridization. B shows a wild-type embryo, and C shows a Kr1/Kr1 embryo lacking Krüppel (Kr) function. Without repression by Kr, the anterior border of the posterior expression domain shifts anteriorly. (D and E) Expression of lac Z in embryos containing construct from A. D shows a wild-type embryo, and E shows a Kr1/Kr1 embryo. Expression of the lacz construct in the mutant embryo shows similar expansion to that seen in gt Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

17 Berman et al. - épilogue Genome Biology (2004): test systématique de 37 enhancers prédits: 15 3? 19 est-ce qu'on peut distinguer les positifs des négatifs?? - 17 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

18 Critère le plus discriminant densité de sites alignés et préservés % identité Seq A Seq B "Aligné" conservation de séquences Seq A Seq B Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012 "Préservé" les sites se trouvent dans un même pic de- 18 conservation

19 outil en ligne ecis-analyst (n'est plus maintenu!) - 19 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

20 MSCAN [W. Alkema et al. NAR (2004)] input : jeu de séquences + set de PSSM Méthode recherche de TFBS dans une fenêtre de taille fixe et calcul des p-values individuelles des TFBS calcul de la p-value combinée des TFBS si p-value combinée < seuil, on garde la fenêtre fusion des fenêtres qui se superposent seuil : p<0.01 TFBS prédits 0.02 CRM prédit CRM prédit Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

21 ClusterBuster [ M. Frith et al. Bioinformatics (2003)] input : jeu de séquences + set de PSSM Méthodes : modélisation de CRM par modèle de Markov caché (HMM) TFBS séquences de background entre TFBS séquences de background flanquantes CRM Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/

22 Cluster Buster 92 kb de séquence résultats en ~ 3 sec. avec 12 matrices - 22 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

23 principe du Modèle de Markov caché (HMM) départ Paramètres du jeu: /6 de 1, 2/6 de 2 4/6 de 2, 2/6 de Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

24 principe du Modèle de Markov caché (HMM) départ Paramètres du jeu: /6 de 1, 2/6 de 2 4/6 de 2, 2/6 de Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

25 principe du Modèle de Markov caché (HMM) J'ignore la succession des dés, mais j'observe la série de chiffres suivante : Est ce que je peux trouver la succession de dés rouge/bleus la plus vraissemblable (le meilleur chemin C)? Pr(S,C M)? En considérant tous les chemins possibles, quelle est la probabilité que cette suite soit issue de ce jeu? Pr(S M) - 25 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

26 Modélisation de CRM par HMM background entre CRM motif 1 CRM Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012 motif 2 background entre 2 motifs à l'intérieur d'un CRM

27 Modélisation de CRM par HMM pm1(a,c,g,t) mo t if 1 probabilités d'émission pbck(a,c,g,t) tm>back back g DNA round tback>m de nombreux paramètres à estimer - 27 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

28 Modélisation de CRM par HMM étant donnés les paramètres... étant donnés la séquence observée quelle la probabilité que la séquence soit issue de ce modèle? Pr(S M)? background en dehors du CRM background dans le CRM algorithme de Viterbi, quadratique motif 1 motif 2 CRM Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/

29 Modélisation de CRM par HMM paramètres "biologiques" d'un CRM nombre moyen de background en dehors du CRM sites dans un CRM espacement moyen entre sites espacement moyen entre CRM background dans le CRM comment sont-ils reliés aux paramètres α β γ? motif 1 motif 2 CRM Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/

30 Cluster Buster ClusterBuster utilise un HMM plus simple, et une heuristique motif background dans le CRM background intra- CRM quelle est la sousséquence (de la séquence totale) qui maximise la probabilité d'être décrite par ce modèle? motif 1 motif 2 CRM Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/

31 Cluster Buster on teste toutes les sous-séquences Si [1 i], et on calcule s(i) = Pr(Si M) on identifie un CRM comme la séquence [i,j] qui maximise s(j)-s(i) CRM prédit s(i) Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

32 Limite de ces trois approches MSCAN, matrix-scan et ClusterBuster nécessitent de connaître à priori les facteurs de transcription impliqués cette information n'est pas toujours disponible! autres approches ("motif blind") définition d'un CRM à partir d'un jeu de CRM connus (jeu d'entraînement) et d'un contrôle négatif apprentissage (régression logistique, SVM) recherche de CRM à partir de gènes co-exprimés (~ recherche de motifs) - 32 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

33 Similarité avec des CRM connus score de similarité basé sur la composition en k-mers 1. jeu de CRM de référence (ex: CRM ayant une expression dans le CNS) jeu positif jeu négatif 4. validation sur un jeu de 16 CRM impliqués dans l'embryogénèse précoce 2. liste d'hexanucléotides sur-représentés Hd CACGTT 10.2 GTTGCA 9.7 TTCTAG 9.1 GCTTAA 8.4 TTGGAA f p h R h = f n h 3. score d'une séquence quelconque: utilisation d'une fenêtre glissante Si = Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012 hd Hd n hd R hd [ HexDiff, Chan & Kibbler (2005) ]

34 Similarité avec des CRM connus score de similarité composite validation sur différents jeux de CRM drosophile et souris (LOOCV) différentes propriétés influent sur l'efficacité de la méthode homotypiques: +, hétérotypique conservation évolutive: + taux de GC élevé: + [ Kantorovitz et al. "Dev. Cell. 17(4) (2009) ] drosophile Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

35 Difficultés majeures 1. localisation Enhancers (CRM) de drosophile (base de données RedFly) enhancer du gène Sonic Hedgehog chez la souris [Li et al., Genome Biology, 2007] - 35 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

36 Difficultés majeures 2. conservation évolutive Stripe 2 enhancer of even skipped (eve) est ce que l'orthologue du S2E enhancer sauve un mutant S2EΔ de D.melanogaster? [Ludwig et al., PloS Biology (2005)] - 36 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012

37 Difficultés majeures 2. conservation évolutive [Hare et al. PloS Genetics, 2008] 100 Myears "Our results show that there is no necessary relationship between enhancer phylogenetic (or sequence) relatedness and functional similarity."- 37 Carl Herrmann - M2 "analyse de réseaux biologiques" 2011/2012