Projet MONALISA MOnitoring Network of ALlergens by Immuno-SAmpling C. SINDT 1, G. OLIVER 1 et M. THIBAUDON 1

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1 Projet MONALISA MOnitoring Network of ALlergens by Immuno-SAmpling C. SINDT 1, G. OLIVER 1 et M. THIBAUDON 1 1 RNSA Réseau National de la Surveillance Aérogiologique - Chemin des Gardes 6961 Saint Genis l'argentière (France) Si l'information fournie par les comptes polliniques est devenue indispensable à la bonne pratique de l'allergologie, certaines discordances entre données "pollens" et "pollinoses" restent constatées. En effet, que ce soit grâce aux bulletins cliniques recueillis par le RNSA (Réseau National de la Surveillance Aérobiologique), que par des observations très spécifiques, il n'est pas rare de constater la survenue de symptômes quelques jours avant l'apparition des comptes de pollens correspondants ou encore leur prolongement quelques jours voire quelques semaines après la disparition des pollens spécifiques [1]. De plus, pour des données polliniques proches d'une année à l'autre, il est constaté une certaine différence de potentiel allergisant du même pollen d'une année à l'autre et d'une région à l'autre [2]. Si les grains de pollens sont les principaux porteurs d'allergènes, certains grains peuvent l'être plus ou moins pour des raisons de pollution [2] ou pour des raisons météorologiques [3,4]. L'équipe de Buters J.T et al. à récemment publié un travail [2,5] indiquant que la mesure de Betv1 dans des grains de pollens issus de chatons provenant d'environnements différents peut varier de 1 à 6. Les collègues australiens [3,6] mettent en avant les corrélations entre mesure de Betv1 dans l'air et les conditions météorologiques. Depuis 25, le RNSA a initié un projet de recherche concernant la mesure des allergènes dans l'air. Il s'agit du projet "MONALISA" (MOnitoring Network of ALlergens by Immuno-SAmpling). Ce projet Européen, du programme "Life Environnement" comprend neuf partenaires : PNARU Worcester Angleterre Jean Emberlin UCO Cordoba Espagne Carmen Galan UTU Turku Finlande Auli Rantio-Lehtimäki BERTIN Montigny le Bretonneux France Esmeralda Carvalho RNSA Lyon France Michel Thibaudon AIA Parma Italie Roberto Albertini (intégré en 27 en tant que membre invité) UAM Poznan Pologne Alicja Stach UEVORA Evora Portugal Rui Brandao METEOSWISS Payerne Suisse Bernard Clot (en sous-traitance avec le RNSA) Le projet MONALISA a pour objectif le développement d'une nouvelle approche de l'analyse du contenu biologique de l'air associant une méthode d'échantillonnage en milieu liquide et une méthode d'analyse immunologique (Elisa) afin de pouvoir mesurer l'allergénicité/antigénicité des principaux pollens ou particules présents dans l'air [7].

2 1 Objectifs du projet Mesurer la capacité allergisante des particules dans l'air (approche non limitée à la quantification des grains de pollens) Mettre en place une classification des pollens et autres particules microbiologiques en rapport avec leurs capacités allergisantes Etre capable de détecter des grains de pollens et autres petites particules (inférieure à 1 micron) Etablir un protocole d'analyse commun en vue d'une standardisation Démonter la robustesse et l'efficacité du matériel d'échantillonnage dans 7 climats biogéographiques différents Le résultat escompté est la mise en place d'un système de collecte et d'analyse directes comme nouvel outil standard pour la mesure des pollens et autres particules micro-biologiques ayant un potentiel allergisant. 2 Matériel et méthode Le bio-collecteur cyclonique développé par Bertin Technologies à la fois dans le cadre de la mesure de l'aérobiocontamination et pour le projet MONALISA est un capteur de type cyclonique. C'est-à-dire, l entrée spécifique par laquelle l air est aspiré, entraîne un mouvement d air rotatif dans un cône, ce qui permet la formation d un tourbillon. Ce mouvement va coller contre les parois les particules présentes dans l air. Le liquide présent dans le cône (par injection continue) est entraîné par l air qui balaie les parois et nettoie pendant la durée du prélèvement, le cône. Les particules, qui étaient sur les parois, se retrouvent en suspension dans le liquide à la fin de l échantillonnage. Ce système permet le recueil de toutes les particules >.1 micron, de l'air dans un échantillon liquide. Figure 1 : Schéma du bio-collecteur Coriolis Pour la saison 26, les partenaires avaient décidé d effectuer des prélèvements de 1 heure à raison de 2l/min, temps maximum possible avec l appareil Coriolis de 26, pour une aspiration optimale.

3 Echantillonnage des pollens Pour une validation des données, 7 partenaires du réseau ont positionné en parallèle un capteur de pollen de type HIRST et un bio-collecteur cyclonique conçu spécifiquement par BERTIN Technologie Bio-collecteur cyclonique Une partie de l'échantillon est utilisé pour l'analyse pollinique au microscope optique, le reste est aliquoté puis congelé à 18 pour les dosages Elisa. Un volume donné de l échantillon liquide est déposé sur une lame, puis séché. Trois gouttes d un colorant se fixant électivement sur l'exine des pollens, sont déposées sur les lames. Une lecture par microscopie optique est faite de l échantillon à un grossissement de x4. La concentration des échantillons en pollens tient compte du volume analysé en fonction du temps et du débit d aspiration des prélèvements Capteur de type HIRST Il s'agit des capteurs utilisés par tous les réseaux d'information dans le monde. Ce sont des girouettes aspirant 1 litres d'air par minute et impactant les particules présentes dans l'air sur une bande transparente siliconée défilant devant la buse d'aspiration [8]. Figure 2 : Schéma du capteur de type Hirst La bande transparente est tout simplement découpée en tronçons correspondants à 24 heures d'impaction et la préparation pour microscopie est préparée en ajoutant trois gouttes d'un colorant (9). Les lames sont ensuite lues au x4. Pour 26, 4 lignes verticales sont lues à un grossissement x4, couvrant l heure d échantillonnage du bio-collecteur, ceci permettant une comparaison de données entre les 2 capteurs Mesure des allergènes Dans le cadre du projet MONALISA, les pollens étudiés pour 26 ont été betula (bouleau), poaceae (graminées), parietaria (pariétaire), et une spore de moisissure : alternaria. Les méthodes d'analyses utilisées sont des Elisa sandwich utilisant pour le bouleau un anticorps anti-betv1mab3b4, pour les graminées un anticorps anti-phlp5, pour les pariétaires un anticorps polyclonal obtenu par immunisation de lapin avec les allergènes majeurs Parj1 et Parj2, pour l alternaria un anticorps spécifique anti-alternaria. Les analyses ont été faites dans les laboratoires

4 de la faculté de Turku, de Worcester et de Cordoba, ainsi que par le laboratoire d'indicia Technologies. 3 Résultats Comptes polliniques Il existe une bonne concordance des comptes polliniques, les pics polliniques se situent en même temps et peuvent être soit supérieur avec le capteur HIRST (figure 3) soit équivalent avec le capteur CORIOLIS (figure 4). Coriolis /Hirst comparison on Betula pollens in Finland Coriolis Hirst grains/m3/samples April May June Figure 3 : Comparaison des données des comptes polliniques du Bouleau entre le capteur Hirst et le bio-collecteur Coriolis en Finlande en 26 Coriolis /Hirst comparison on Poaceae pollens in England Coriolis Hirst grains/m3/samples A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A April May June August Figure 4 : Comparaison des données des comptes polliniques de Graminées entre le capteur Hirst et le bio-collecteur Coriolis en Angleterre en 26 Les données obtenues sur 26 ont été traitées statistiquement avec un test de Pearson révélant des niveaux de corrélation acceptables (tableau 1).

5 On ne tient pas compte des données du Portugal qui ne comptait pas assez d essais, du fait de pannes sur le moteur du bio-collecteur Coriolis. Test de Alternaria Artemisia Betula Cupressaceae Olea Parietaria Poaceae All corrélation Pollens de Pearson Angleterre,8123,162,785,368,492,76,3545 Finlande,2154,9129,6843,5815,568,8465 France,7581,329,7666,5696,6443,7816,5884 Pologne,5966,5149,474,4357,7596,593 Portugal 1,1823,1149,4858,111 -,4771 Espagne,4583,7759,757,7583,7568 Tableau 1 : Corrélation entre les données du capteur Coriolis et du capteur Hirst pour les différents pollens et spore de l étude Mesure des allergènes/antigènes par Elisa Grâce à la courbe de calibration réalisée avec des antigènes de bouleau calibrés, il est possible de transformer les données obtenues en densité optique (DO) en concentration en antigènes. Les résultats obtenus avec tous les pollens et spore étudiés ne sont pas concluants. Trop peu d allergènes sont détectés ne permettant pas d interprétation des données obtenues. Grains/m 3 CORDOBA Aeolus Parietaria samples/ Indirect ELISA Par j ,5 3 2,5 2 1,5 1,5 ng Ag/ml Urticaceae pollen Ag Par j 2 Figure 5: Comparaison de l activité antigénique de Par j 2 et de la concentration de pollens de Parietaria à Cordoba en Espagne pendant les échantillonnages 26

6 Birch pollen antigenic activity in Turku - Finland SQ-U (bet ELISA sand) Birch count grains/m3 Coriolis bet/m3 Figure 6 : Comparaison de l activité antigénique de Bet v 1 et de la concentration de pollens de Betula à Turku en Finlande pendant les échantillonnages 26 4 Discussion - conclusion Bien qu ayant obtenus des résultats encourageant avec les comptes de pollens du capteur Coriolis, ceux des données des tests ELISA ne correspondent pas à l attente des partenaires au projet. Un développement poussé de l appareil a été nécessaire pour permettre de collecter des quantités d allergènes plus importantes. Pour la saison 27, le bio-collecteur a été positionné sur une girouette afin d'offrir la buse d'aspiration face au vent. Le débit d'aspiration est resté de 2litres par minute et les durées de prélèvement ont augmenté de 1 heure à 6 heures selon les étapes d'avancement du projet MONALISA. Les premiers résultats des tests ELISA de l année 27 sont en cours d étude, mettant à jour une meilleure détection, mais proposant des données mitigées. La mise en œuvre du projet MONALISA a montré, à la fois l'importance de la mesure d'allergénicité/antigénicité de l'air et des difficultés que l'on peut rencontrer. Il paraît nécessaire de poursuivre les pistes suivantes : Echantillonnage : l'échantillonnage en milieu liquide présente des avantages mais aussi des inconvénients, et il conviendrait de poursuivre avec, en comparaison, des méthodes de prélèvement soit cyclonique en milieu sec [1] ou par immune empreinte [11] ou en utilisant des capteurs de type cascades filtrantes [3,5,6]. Méthode Elisa : elle reste une méthode relativement peu sensible puisqu'elle nécessite plusieurs dizaines voire centaines de grains pour être mesurable. D'autres méthodes plus sensibles comme l'immuno-cytométrie en phase solide [12] devraient pouvoir être testées tout en tenant compte de la qualité et de la spécificité des anticorps utilisés. En attendant, les comptes polliniques ont de beaux jours devant eux surtout lorsqu'on les associe aux données phénologiques de production de pollens et aux données cliniques représentant l'impact sanitaire de l'exposition aux pollens.

7 Bibliographie [1] Oliver G., Thibaudon M. Clinical and phenological data interest for the determination of the allergic risk. EAACI Congress 27 in Göteborg. [2] Buters JT., Kasche A., Weichenmeier I. et al. Year-to-year variation in release of Bet v 1 allergen from birch pollen: evidence for geographical differences between west and south Germany. Int Arch Allergy Immunol. 27 Sep 1; 145(2): [3] Schäppi GF, Suphioglu C, Taylor PE, Knox RB. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol Nov;1(5): [4] Spieksma FT, Nikkels AH. Similarity in seasonal appearance between atmospheric birch-pollen grains and allergen in paucimicronic, size-fractionated ambient aerosol. Allergy Mar;54(3): [5] Buters JT, Weichenmeier I, Ochs S, Kreyling W, Boere J, Cassee F, et al. Comparison between ambient Bet v 1 concentration and birch pollen count. JES of RNSA 27 in Barcelona. [6] Schäppi GF, Taylor PE, Staff IA, Rolland JM, Suphioglu C. Immunologic significance of respirable atmospheric starch granules containing major birch allergen Bet v 1. Allergy 1999 May;54(5): [7] Thibaudon M, Lachasse C. Phénologie : Intérêt et méthodes en aérobiologie. Revue Française d Allergologie et d Immunologie Clinique 25 ;45: [8] Hirst JM. An automatic volumetric spore traps. Ann. Applied Biology 1992; 39: [9] Kapila M, Penttinen A. An evaluation of the microscopical counting method of the tape in Hirst Burckard pollen and spore trap. Grana 1981;2: [1] Moreno-Grau S, Elvira-Rendueles B, Moreno J, García-Sánchez A, Vergara N, Asturias JA, et al. Correlation between Olea europaea and Parietaria judaica pollen counts and quantification of their major allergens Ole e 1 and Par j 1-Par j 2. Ann Allergy Asthma Immunol. 26 Jun;96(6): [11] Razmovski V, O'Meara TJ, Taylor DJ, Tovey ER. A new method for simultaneous immunodetection and morphologic identification of individual sources of pollen allergens. J Allergy Clin Immunol. 2 Apr;15(4): [12] Thibaudon M, Rabillon J. A new approach of analysis in aerobiology. IPC 24 in Granada.

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