MINISTÈRE DE L ÉDUCATION NATIONALE, DE L ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE DIRECTION DES PERSONNELS ENSEIGNANTS AGREGATION

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1 MINISTÈRE DE L ÉDUCATION NATIONALE, DE L ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE DIRECTION DES PERSONNELS ENSEIGNANTS AGREGATION SECTION : BIOCHIMIE-GENIE BIOLOGIQUE Concours INTERNE et concours d accès à l échelle de rémunération des professeurs agrégés Rapport de Monsieur Gérald ALCINDOR Président du jury 25

2 Sommaire Composition du jury.. p 3 Renseignements statistiques.. p 4 Epreuves d admissibilité Première épreuve... p 6 Deuxième épreuve p 33 Epreuves d admission Première épreuve... p 36 Deuxième épreuve p 39

3 COMPOSITION DU JURY Président Monsieur Gérald ALCINDOR, professeur des universités Université René Descartes à Paris Vice-président M. Guy LEYRAL, Inspecteur général de l'education Nationale Secrétaire général M. Patrick VANNESTE, professeur agrégé - E.N.C.P.B. de PARIS Membres : Mme Christine BENAYOUN, professeur agrégé - E.N.C.P.B. de PARIS M. Adrien BINET, professeur des universités IUT Quimper M. Joel CNOKAERT, IA - IPR M. Jean - Yves DANIEL, professeur des universités Université Bordeaux 2 M. rédéric DUCANCEL, Ingénieur de recherche - CEA Saclay Mme Isabelle ETIENNE, professeur agrégé - E.N.C.P.B. de PARIS Mme rançoise GUILLET, IA - IPR M. Jean rançois PERRIN, professeur agrégé Lycée Saint Louis BORDEAUX M. Christian PLAS, professeur agrégé - E.N.C.P.B. de PARIS Mme Claudine WALTHER, professeur agrégé - E.N.C.P.B. de PARIS

4 RENSEIGNEMENTS STATISTIQUES Concours interne Candidats présents aux épreuves d'admissibilité 51 Candidats admissibles 13 Candidats présents aux épreuves d'admission 12 Candidats proposés pour l'admission 5 Barre d'admissibilité 8.9 Barre d'admission Epreuves d'admissibilité Moyenne générale des candidats présents 6.74 Moyenne générale des candidats admissibles 1.3 Première épreuve dossier Moyenne des candidats présents 6.83 Moyenne des candidats admissibles Note maximale 16.5 Deuxième épre uve : Biochimie-Physiologie-Microbiologie Moyenne des candidats présents 6.55 Moyenne des candidats admissibles 8.79 Note maximale 11 Epreuves d'admission Première épreuve soutenance Moyenne des candidats présents Moyenne des candidats admis 15 Note maximale 18 Deuxième épreuve exploitation dossier Moyenne des candidats présents Moyenne des candidats admis Note maximale 15.4 Moyenne portant sur le total des épreuves de l'admission Moyenne des candidats présents Moyenne des candidats admis Moyenne portant sur le total général Moyenne des candidats présents 1.89 Moyenne des candidats admis Concours d'accès à l'échelle de rémunération Des professeurs agrégés Candidats présents aux épreuves d'admissibilité 13 Candidats admissibles 1 Candidats présents aux épreuves d'admission 1 Candidats proposés pour l'admission Barre d'admissibilité 9.75 Barre d'admission Epreuves d'admissibilité Moyenne générale des candidats présents 5.48 Moyenne générale des candidats admissibles 9.75 Première épreuve dossier

5 Moyenne des candidats présents 4.94 Moyenne des candidats admissibles 1 Note maximale 1 Deuxième épreuve : Biochimie-Physiologie-Microbiologie Moyenne des candidats présents 6.1 Moyenne des candidats admissibles 9.5 Note maximale 9.5 Epreuves d'admission Première épreuve soutenance Moyenne des candidats présents 8.5 Note maximale 8.5 Deuxième épreuve exploitation dossier Moyenne des candidats présents 9.4 Note maximale 9.4 Moyenne portant sur le total des épreuves de l'admission Moyenne des candidats présents 8.95 Moyenne portant sur le total général Moyenne des candidats présents 9.35

6 EPREUVES ECRITES D ADMISSIBILITE Première épreuve Durée: 6 heures Coefficient 1 GLUCIDES ET BIOTECHNOLOGIES Les glucides constituent un monde extrêmement varié. Des molécules simples aux molécules complexes ils interviennent dans le métabolisme énergétique, les structures cellulaires et extra cellulaires. Des polyosides participent à des phénomènes d adhésion non spécifiques comme la formation de biofilms. Les interactions spécifiques protéines ligands font quelquefois intervenir des motifs glucidiques. D autre part de nombreux polyosides présentent un intérêt industriel certain : gommes, amidon et dérivés Le sujet propose quatre parties indépendantes concernant quelques aspects de la glycobiologie : Dosage de la digoxine et de la digitoxine Site d interaction lectines - ligands Les cellulosomes Les polyosides : épaississants ou gélifiants

7 PARTIE A : Dosages de la digoxine et de la digitoxine La digoxine et la digitoxine (Document 1 : formule chimique de la digoxine) sont des glucosides cardiotoniques utilisés le plus souvent pour le traitement de l insuffisance cardiaque et des troubles du rythme cardiaque. Il existe un certain chevauchement entre les limites thérapeutiques et les limites toxiques, aussi la toxicité de ces produits continue de constituer un problème clinique courant. Les effets de la toxicité sont souvent sévères et peuvent être mortels. Par conséquent, il est très important de suivre les taux de digoxine ou de digitoxine dans le sérum. De nombreuses méthodes de dosage existent, deux d entre elles seront étudiées. QUESTION A1 La digitoxine ne diffère de la digoxine que par la perte de l hydroxyle porté par le C12 (Document 1). Quelle est la conséquence de cette modification sur la solubilité de la molécule dans le sérum? La digitoxine et la digoxine sont transportées par l albumine plasmatique. Discuter l affinité de ces deux molécules pour la molécule transporteuse. QUESTION A2 Le document 2 est une fiche technique simplifiée d une méthode de dosage de la digoxine (méthode Tina-quant Digoxine). Réaliser un schéma illustrant le principe de dosage de la digoxine. Réaliser un schéma de principe des deux appareils permettant ce dosage en milieu trouble. Préciser et justifier pour chacun la longueur d onde choisie. Donnée : La loi de Rayleigh est inapplicable dans ce cas. Loi de Rayleigh : Id = K. I. 2 2 n - n 2 2 n + 2 n. N V2 4 λ Id : intensité diffusée I : intensité du faisceau incident K : constante dépendant de la direction et de la géométrie du système n : indice de réfraction de la particule n : indice de réfraction du solvant N : nombre ou concentration de particules V : volume moyen d une particule λ : longueur d onde QUESTION A3 Le document 3 présente les réactifs utilisés pour une méthode de dosage de la digitoxine faisant appel à la complémentation. Réaliser un schéma illustrant le principe de ce dosage.

8 PARTIE B : site d interaction lectines - ligands Il s agit dans cette partie d établir la cartographie du site d interaction spécifique entre des lectines bactériennes et leurs ligands oligosidiques à l aide d analogues structuraux par réaction d inhibition d hémagglutination. Les questions concernées par ce thème requièrent l utilisation du document 4. QUESTION B1 Rappeler en quelques lignes pourquoi les réactions de liaisons lectines/motifs oligosidiques peuvent intéresser la bactériologie médicale. QUESTION B2 Justifier l utilisation de plaques à puits à fonds coniques pour réaliser les réactions d hémagglutination. Décrire l aspect d un puits ne montrant pas d hémagglutination et l aspect d un puits montrant une hémagglutination totale. QUESTION B3 Utiliser essentiellement les données du paragraphe d introduction, du paragraphe présentant les structures des osides inhibiteurs mis en oeuvre et des deux derniers paragraphes du document 4. Expliquer comment les résultats expérimentaux obtenus dans le paragraphe intitulé «Inhibition of hemagglutination» et résumés par le tableau n 1 conduisent au modèle schématique de la figure 3. Les raisonnements tenus dans le cadre de l explication précédente doivent être l aboutissement d une séance de travail collectif avec un groupe d élèves dans le cadre de travaux dirigés. Quels sont les objectifs pédagogiques visés? QUESTION B4 Quel est l intérêt de la figure 4 du document 4? QUESTION B5 Pour chaque ligand I i (analogue inhibiteur), les auteurs de l article présenté dans le document 4 déterminent la différence d enthalpie libre de référence entre la réaction de fixation de I i et la réaction de fixation du ligand de référence I ref (I ref est en fait le composé 1) sur les motifs protéiques adhésines P. Cette différence est appelée G. Pour déterminer G les auteurs utilisent la relation suivante : G = -RT ln(k rel ) avec K rel = (IC 5 de I ref / IC 5 de I i ). La question qui suit a pour but de démontrer cette relation.

9 Soit H, I ref, I i, désignant les motifs saccharidiques libres (H faisant référence aux motifs des érythrocytes) et P désignant les sites adhésines bactériennes libres. Soit P* H, P* I ref et P* I i désignant les complexes adhésine motif saccharidique. Les réactions suivantes peuvent être écrites : P* H < > P + H K D,H = ([P][H]) / [P*H] G H = - RT ln(k D,H ) P* I ref < > P + I ref K D,Iref = ([P][I ref ]) / [P*I ref ] G Iref = - RT ln(k D,Iref ) P* I i < > P + I i K D,Ii = ([P][I i ]) / [P*I i ] G Ii = - RT ln(k D,Ii ) Montrer que pour une concentration en I i totale qui détermine une inhibition d hémagglutination de 5% comparée à une concentration en I ref totale qui détermine la même inhibition de 5%, la relation suivante peut être écrite : En déduire alors que G = - RT ln([i ref ]/[I i ]). K D,Ii / K D,Iref = [I i ] / [I ref ] La formule proposée par les auteurs de l article est G = - RT ln(k rel ) ; soit en fait G = -RT ln([i ref total] / [ I i total]) compte tenu de leur définition de K rel. Il y a donc une différence entre l égalité exacte déduite ci-avant et la formule proposée par l article. Quelle est la condition de validité de la formule de l article? Pourquoi peut on affirmer qu elle est respectée?

10 PARTIE C : les cellulosomes Les cellulosomes sont des complexes extracellulaires de masse moléculaire élevée impliqués dans la dégradation de la cellulose chez certains micro-organismes. Ils sont constitués de plusieurs sous-unités catalytiques organisées autour d'une protéine centrale : la scaffoldine. La structure des sous-unités catalytiques fait apparaître un domaine commun appelé dockerine nécessaire pour leur intégration dans le complexe. Les cellulosomes d origine bactérienne diffèrent des cellulosomes fongiques par la structure de la dockérine, la nature des hydrolases présentes et par conséquent la nature des produits formés : cellobiose chez les bactéries, glucose chez les champignons. Les travaux suivants ont contribué à préciser la structure et la fonction de la molécule responsable de l activité ß-glucosidasique libérant le glucose : criblage immunologique (immunoscreening) d une banque d'adn complémentaire de Picomyces (vecteur λzap 11 / Escherichia coli) ; sous-clonage des clones immunoréactifs (pbluescript SK) puis séquençage ; analyse et comparaison des séquences et mise en évidence d un gène d intérêt appelé cel3a ; amplification par PCR et purification des régions codant les domaines catalytiques et auxiliaires ; clonage et expression de la protéine rcel3a marquée (tagged protein) chez E.coli BL21 (vecteur pqe, cotransformation par prep4, plasmide portant le gène laci, gène codant le répresseur de l opéron lactose) ; purification de la protéine recombinante Cel3a par chromatographie d affinité ; détermination de l activité catalytique de la protéine d intérêt. Document 5 : documentation technique / picoblue TM Immunoscreening kit Document 6 : caractéristiques des vecteurs de clonage utilisés Document 7 : support de chromatographie (document à compléter) QUESTION C1 A partir des données du document 5, construire un organigramme des différentes étapes qui ont été nécessaires à la réalisation du criblage immunologique (immunoscreening). QUESTION C2 A l aide du document 6, justifier le choix des différents vecteurs pour chaque application en précisant l intérêt de leurs différents éléments fonctionnels. QUESTION C3 La purification de la protéine recombinante rcel3a est effectuée sur colonne de Ni 2+ -nitrilotriacétate après avoir ajusté les concentrations en NaCl et en imidazole de l extrait cellulaire respectivement à 3 et 1 mmol.l -1, ph 8. Justifier ces conditions opératoires et indiquer la composition probable du tampon d élution. Compléter le document 7 en représentant les liaisons de coordinence entre le nitrilotriacétate et l ion Ni 2+ d une part, entre la protéine et l ion Ni 2+ d autre part. Joindre le document 7 à la copie.

11 PARTIE D : les polyosides : épaississants ou gélifiants Un certain nombre de produits industriels (dentifrice, confitures, sauces...) contiennent un ou plusieurs épaississants et/ou gélifiants. La nature de l'épaississant ou du gélifiant utilisé confère au produit des propriétés rhéologiques particulières. La formulation de ces produits implique donc un choix raisonné. La connaissance des structures chimiques est un élément important permettant de prévoir les propriétés rhéologiques. QUESTION D1 Il s'agit, lors d'une séance de travaux dirigés avec des étudiants en section de technicien supérieur Bioanalyses et contrôles, de mettre en évidence les relations entre les structures des polyosides et leurs propriétés rhéologiques. A cette fin, préparer deux séries de schémas commentés devant être exploités avec les élèves : - la première série expliquant les différences entre épaississants et gélifiants (des exemples concrets seront utilisés : pectines plus ou moins méthylées, rôle du ph...) ; - la seconde série montrant les relations entre la structure et les propriétés rhéologiques (rhéogrammes) de quelques polyosides : amylose, amylopectine, xanthane. Les documents 8 et 9 sont fournis comme aide à la préparation des deux séries de schémas. QUESTION D2 Parmi les polyosides cités ci-dessus, lequel semble le plus adapté à la formulation d'une pâte dentifrice? Justifier votre réponse.

12 Document 1 ormule de la digoxine O O OH 12 O OH O O O O O OH HO OH OH

13 Document 2 Dosage de la digoxine Réactifs R1 Réactif anticorps : Tampon BIS-TRIS :,25 mol.l -1, ph 6,4 ; anticorps monoclonaux de souris anti-digoxine ; = 1, mg.l -1 ; conservateur R2 Réactif contenant les microparticules particules de latex tapissées de digoxine ; conservateur R3 R4 R5 R6 Tampon BIS-TRIS :,25 mol.l -1, ph 6,4 ; Calibrateur bas Calibrateur haut Solution de contrôle Echantillon : Plasma : Plasma recueilli sur héparine de lithium ou de sodium ou sur EDTA de sodium. Conservation : 2 jours entre 2 et 8 C, 6 mois à -2 C. Ne congeler qu une fois. Il convient de prélever les échantillons au moins 6 à 8 heures après la dernière administration du médicament. Centrifuger les échantillons formant un précipité avant de commencer le dosage. Le dosage est réalisé en microplaque selon le tableau suivant : R1 R2 R3 R4 R5 R6 Echantillon Remarque : lors de ce test aucune précipitation des billes de latex n est observée.

14 Document 3 Dosage de la digitoxine Cette méthode fait appel à la complémentation de la b-galactosidase Les réactifs utilisés sont les suivants : R1 : Réactif enzyme accepteur Tampon HEPES ; Enzyme accepteur ; Anticorps anti-digitoxine ; Tampon phosphate ; Conservateur ; Agents stabilisants. R2 : Réactif enzyme donneur Tampon HEPES ; Enzyme donneur-digitoxine ; Rouge de chlorophénol b-galactopyranoside ; Tampon phosphate ; Conservateur ; Agents stabilisants. Données : Les anticorps anti-digitoxine peuvent se fixer aussi bien sur la digitoxine libre que sur la digitoxine liée à l enzyme donneur. L enzyme donneur est liée à la digitoxine par une liaison covalente.

15 Document 4 Ce document reprend de larges extraits de l article intitulé Specific mapping of bacterial lectins by inhibition of hemagglutination using deoxy and deoxyfluoro analogs of receptor-active saccharides ; Göran Magnusson, Scott J. Hultgren, Jan Kihlberg ; Methods in enzymology, 253, (1995). Introduction Many bacteria use their surface lectins for attachment to saccharide moieties on the surface of eukaryote cells. [ ] Detailed knowledge of the lectin-saccharide interaction would make it possible to interfere with bacterial binding and thereby provide an opportunity to develop antiadhesive agents [ ] Hydrogen bonds between saccharide and lectin seem to be the most important type of bond in the lectinsaccharide complex. Consequently, the use of a complete set of monodeoxysaccharide analogs as inhibitors [ ] reveals which hydroxyl groups in the natural saccharide are necessary for complex formation. In addition, deoxyfluorosaccharide reveal the directionality of the hydrogen bond, because the fluoro group is a hydrogen bond acceptor but not a donor. [ ] Substitution of hydroxyl group for alkyl or ether group may reveal steric requirements for a good fit between saccharide and protein. It is important that different saccharide analogs used for receptor mapping have very similar conformations, ensuring that the only difference between the saccharide structures is the presence of the absence of specific hydroxyl groups. [ ] Hemagglutination is based on aggregation of erythrocytes. Specific bacterial adhesins presented in fibers called pili or fimbriae on bacterial surface bind to saccharides on the erythrocyte surface, causing hemagglutination. Inhibition of the aggregate formation causes the erythrocytes to sediment, thereby enabling the identification of efficient inhibitors. Plastic particles coated with an active saccharide can be used as an alternative to erythrocytes. [ ] An illustration of the use of deoxysaccharide and deoxyfluorosaccharides in epitope mapping is our investigation of the galabiose (Galα1 4Galβ) binding specificity of uropathogenic Escherichia coli bacteria.[ ] Deoxysaccharides and Deoxyfluorosaccharides used ig.1. : Galabioside analogues 1-14 and ethyl lactoside 15 used as hemagglutination inhibitors. Arrows indicate which hydroxyl group has been replaced by a hydrogen or fluorine atom in compounds 1 14.

16 Preparation of Erythrocytes [ ] The surface of these erythrocytes presents the P antigen (globoside) which contains the dissacharide moiety recognized by P piliated bacteria. [ ] Pilus Architecture and Preparation of bacterial Strains HB11/pPAP5 The E. coli strain [ ]HB11/pPAP5 [ ] produce the P pili [ ] Expression of P pili is induced by growing the HB11/pPAP5 bacteria overnight at 37 C on a solid medium such as CA [ ]. Note importante des auteurs du sujet : la partie protéique la plus externe du pili P ( = partie PAPG) possède la fonction adhésine (= lectine) de reconnaissance du motif galabiose (Gala1 4Galb). L antigen P des hématies (= globoside) présente ce motif. Hemagglutination reactions [ ] Bacterial suspension 1. Suspend bacteria (fresh, overnight culture) in PBS to an A 54 of Spin down 1 ml of the cell solution in a microfuge for 1 min. 3. Suspend the cell pellet in 1 µl PBS. Red blood cell suspension 1. Wash blood in PBS [ ] (no lysed cells). 2. Suspend red blood cells (RBC) in PBS to an A 64 of 1.9. Hemagglutination assay and determination of titer 1. In a microtiter plate with pointed well bottoms [ ], dispense 25 µl PBS/well. 2. Add 25 µl bacterial suspension to the first well. Mix. Make serial dilutions by taking 25 µl from the first well, transferring to the next well, mixing, taking 25 µl from the second well, and so on. 3. Add 25 µl RBC suspension to all wells. 4. Mix suspension gently [ ] Cover and place at 4 C. 5. Read the HA titer [ ] In the absence of hemagglutination the RBC are able to settle into a pellet at the bottom of the well. In the presence of hemagglutination the red blood cells and bacteria form a diffuse sheet clumped of cells covering the entire well. Inhibition of hemagglutination The bacterial suspension is diluted to an HA titer of 64 [ ]. The saccharide inhibitors 1 15 are dissolved in PBS buffer to give 1 mm solutions. Each inhibitory solution (25 µl) is serial diluted in microtiter plate wells containing 25 µl PBS each. The bacterial suspension (25 µl ; HA titer of 64) is added to each well, and the plates are incubated for around 15 min at room temperature. The erythrocytes (1% suspension, 25 µl) are added, and the plates are shaken gently, then incubated at 4 C for 16 hr. The end point (IC5) is defined as the inhibitory concentration that gives 5% inhibition (seen as incomplete formation of an erythrocyte pellet) of hemagglutination. The IC5 values for the different inhibitor saccharides, shown in Table I, are mean values from two or three consecutive determinations. [ ]

17 Table I Inhibition of hemagglutination of human erythrocytes by Escherichia coli (HB11/paP5) Using compounds Compound IC5 a (mm) Inhibitory power b (%) G c (kj/mol) > <1. a The 95% confidence limits are as follows : [.93*IC5 ; 1.7*IC5] mm. b The 95% confidence limits are [.94 * Inhibitory power ; 1.11 * Inhibitory power] %. c The 95% confidence limits are G ±.25 (kj/mol) >11 Data analysis The relative equilibrium constant (K rel, equal to the ratio of IC5 values) for each of the saccharides is derived using saccharide 1 as a reference inhibitor. Inhibitory power is defined as 1 K rel. The K rel values are used to calculate the difference in free energies ( G = -RT ln(k rel )). [ ] The saccharide inhibitors 2 15 were categorized according to their G values : (1) G < kj/mol : more potent than the reference saccharide 1 ; (2) G = 2 kj.mol -1 : marginal loss of potency ; (3) G = 4 1 kj.mol -1 : significant loss of potency, indicating either loss of a hydrogen bond or introduction of a steric repulsion ; and (4) G > 11 kj.mol -1 : non inhibitory, indicating the loss of more than one important interaction. The loss of a hydrogen bonding site in a ligand binding enzyme has been found to cause decreased binding strength by kj.mol -1. It is recommended that conclusive argumentation based on borderline G values ( kj.mol -1 ) be avoided. [ ] The data and interpretations are summarized in the schematic model of the galabiose-specific binding site shown in ig. 3. Galabiose is the central dissacharide of globoside, which is the natural glycolipid present on human erythrocytes. igure 4 is a three-dimensional representation of globoside with the hydrogen bonded hydroxyl groups highlighted.

18 ig.3. Schematic model of the galabiose-specific binding site of the PapG adhesin of E.coli. [ ] (remarque des auteurs du sujet : les flèches représentent les liaisons hydrogènes orientées intervenant dans la reconnaissance de l adhésine et du motif osidique ; les traits pointillés des interactions hydrophobes). ig. 4. Space filling model of globotetraosylceramide. The oxygen functionalities of that are involved in hydrogen bonding to the PapG adehsin ( HO-6, HO-2, O-3, HO-4, and HO-6 ) are highlighted.

19 Document 5 Documentation technique / picoblue TM Immunoscreening kit Cloning vectors having promoters that are functionnal in Escherichia coli (such as the β-galactosidase promoter found in the Lambda ZAP vectors and the Lambda gt11 vectors, the Bluescript II phagemids and the puc plasmids) and that are positioned to transcribe cdna inserts with the appropriate 5 sequences can be used to express fusion proteins. These recombinant proteins may be identified using a primary antibody (Ab) directed against the protein of interest, the alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody and the nonradioactive color-producing substrates provided in this kit. The picoblue TM immunoscreening kit provides the following components : A high quality, immunoaffinity-purified secondary antibody conjugated to AP. Bovine serum albumine (BSA) to block any non specific binding sites on the nitrocellulose. Nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) for the color development reaction. An E.coli phage lysate to remove cross-reactive antibodies that may be contaminating the primary antibody. The picoblue immunoscreening kit has been design to screen lifts of phage plaques, replicas of phage lysogens and plasmid colonies, or the products of in vitro translation that are blotted onto nitrocellulose membranes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).

20 Document 6 Caractéristiques des vecteurs de clonage utilisés Document 6 a Lambda ZAP II Vector Extrait d une fiche technique de la société QIAGEN λ ZAP is an insertion vector with multiple cloning sites within plasmid sequences that can be excised in vivo and converted to a plasmid vector, Bluescript SK (-) vector. DNA fragments up to 1 kb in length can be inserted in unique XhoI, EcoRI, SpeI, XbaI, NotI, or SacI sites. [ ] The polycloning site is located in the amino-terminal portion of lacz, often leading to a Lac (-) phenotype on isolpropylthio-β-d-galactoside / X-gal. If the cloned DNA is in-frame with the LacZ sequence, a fusion protein may be expressed and detected by antibody screening. The Bluescript SK (-) plasmid carrying the cloned DNA is excised in the presence of f1 or M13 helper bacteriophages. λ ZAP contains two signals necessary for excision, initiator (I) and terminator (T), where f1 (+) strands DNA synthesis initiates and terminates, respectively. [ ] λ ZAPII is equivalent to λ ZAP except that the Sam 1 mutation has been removed. GENETIC CHARACTERISTICS Amber mutations Sam 1 Suppressor required sup Deletions nin 5 Substitutions T amp r ColE1 ori lacz (bacteriophage T3 Promoter, polycloning site, bacteriophage T7 promoter I) Insertions no red / gam status of vectors red + gam + red / gam status of recombinants red + gam + chi site present in recombinants yes Propagates on reca (-) hosts yes Spi selection no Recommanded hosts E.coli BB4 (λ ZAP, λ ZAPII) E.coli XL1-Blue (λ ZAPII) Cloning Site SacI NotI XbaI SpeI EcoRI XhoI Insertion / Substitution Size (kb) Left arm Right arm insert Recombinants Insertion Lac - REERENCE : Short et al. Bacteriophage λ vector (1988)

21 Document 6 b pbluescript SK (-) Vector Extrait d une fiche technique de la société QIAGEN

22 Document 6 c pqe and prep4 vectors Principle QIAexpress pqe vectors combine a powerful phage T5 promoter (recognized by E. coli RNA polymerase) with a double lac operator repression module to provide tightly regulated, high-level expression of recombinant proteins in E. coli. Protein synthesis is effectively blocked in the presence of high levels of lac repressor and the stability of cytotoxic constructs is enhanced. The pqe vectors enable placement of the 6xHis tag at either the N- or C-terminus of the recombinant protein. pqe Vectors Elements present in QIAexpress pqe Vectors pqe vectors. or a description of numbered features, see table "Elements present in QIAexpress pqe Vectors". Diagram not to scale. Element 1 Optimized promoter/operator element 2 Synthetic ribosomal binding site RBSII 3 6xHis-tag coding sequence 4 Translational stop codons 5 Two strong transcriptional terminators 6 ColE1 origin of replication 7 beta-lactamase gene (bla) Description Consists of the phage T5 promoter and two lac operator sequences, which increase the probability of lac repressor binding and ensure efficient repression of the powerful T5 promoter or efficient translation Either 5' or 3' to the polylinker cloning region In all reading frames for convenient preparation of expression constructs t from phage lambda, and T1from the rrnb operon of E. coli, to prevent read-through transcription and ensure stability of the expression construct rom pbr322 Confers ampicillin resistance

23 Procedure Inserts encoding proteins of interest are cloned into appropriate constructs* and transformed into a suitable E. coli strain for expression. Expression is induced by addition of IPTG. Vector pqe-trisystem constructs can be transformed into E. coli, used as a shuttle vector for recombinant protein expression in insect cells, or transfected into mammalian cells. Any E. coli strain carrying the laclq mutation can be used for expression of most proteins with pqe vectors. or stable propagation of expression constructs encoding toxic or hydrophobic proteins, a higher level of lac repressor may be required. This is obtained in trans with repressor plasmid prep4 or in cis with the pqe-8l vector series, both of which constitutively express the lac repressor at high levels. Expression hosts M15[pREP4] and SG139[pREP4] are provided in QIAexpress Kits and in the E. coli Host Strains Set. Alternatively, prep4 can be transformed into any E. coli strain. Since prep4 contains a p15a origin of replication, it is compatible with plasmids containing a ColE1 origin of replication, such as the pqe vectors, and is maintained in the cell by kanamycin selection. Applications The QIAexpress Expression System provides high-level expression of proteins suitable for many applications, including: Purification of functional, conformationally active proteins (1) Purification under denaturing conditions for antibody production (2) Crystallization for determination of three-dimensional structure (3) Assays involving protein protein (4) and protein DNA interactions

24 Document 7 Support de chromatographie Acide nitrilotriacétique (NTA = Nitrilotriacetic Acid) Document à compléter et à joindre à la copie NTA O O N O O O O

25 Document 8 NOTIONS DE RHEOLOGIE Lorsqu un fluide newtonien s écoule laminairement le long d une paroi plane immobile, on admet que la couche immédiatement au contact de la paroi reste immobile. Chaque couche successive se déplace à une vitesse qui augmente avec la distance de la paroi. La force de frottement qui s oppose au déplacement d une couche par rapport à la couche adjacente est proportionnelle à la superficie de l interface (A) et au gradient de vitesse entre les deux couches (dv/dx). dv = η A dx A = τ = η dv dx η est la viscosité dynamique et τ est appelée contrainte de cisaillement.

26 Pour les fluides newtoniens, le rhéogramme (τ??f(dv/dx)) est donc le suivant : τ η dv/dx De nombreuses solutions de macromolécules n ont pas un comportement newtonien, par exemple : - diminution de la viscosité lorsque le gradient de vitesse augmente (rhéofluidifiant),