AQUAMANCHE. Développement de techniques de discrimination de sources de pollution fécale des eaux, application à l étude du site du havre de l Ay
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- Jean-Baptiste Dumais
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1 Unité de Recherche Risques Microbiens Université de Caen Basse-Normandie AQUAMANCHE France (Channel) England INTERREG IVA Program (FEDER) Développement de techniques de discrimination de sources de pollution fécale des eaux, application à l étude du site du havre de l Ay Colloque de restitution de fin de projet Plouzané, le 12 mars 2012 Lessay, le 13 mars 2012
2 EA 956 USC INRA Laboratoire de Microbiologie de l'environnement (LME) (Pr. Y. Auffray) EA 2128 Interactions hôte et microorganismes des épithéliums (Pr. R. Leclercq) EA 4655 Unité de Recherche Risques Microbiens (U2RM) (Pr. A. Rincé) Entérocoques Etude de l adaptation aux fluctuations de leur environnement Etude de mécanismes de virulence Etude de mécanismes de résistance aux antibiotiques Typage des sources de pollution fécale
3 Entérocoques Etude de l adaptation aux fluctuations de leur environnement Etude de mécanismes de virulence Etude de mécanismes de résistance aux antibiotiques Typage des sources de pollution fécale Indicateurs de contamination (limiter les éventuels biais liés à des variations entre les concentrations des marqueurs et celles des indicateurs de contamination). Présentent l avantage de pouvoir être facilement enrichis sur milieu sélectif dans le but d abaisser la limite de détection.
4 Contribution de l Unité de Recherche Risques Microbiens dans le projet Aquamanche Action 2.1. Développement de méthodes de typage de sources microbiennes. L objectif principal consistait à développer une nouvelle méthode pour discriminer les pollutions d origine Ovine Bovine Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). Suivi mensuel pendant 2 ans et sur 10 points contrôlés. Analyse d un ensemble de paramètres pour chaque échantillon. - Dénombrement d indicateurs de contamination fécale - Paramètres physicochimiques - Typage des sources de pollution Actions Analyses des données, dissémination des résultats
5 Action 2.1. Développement de méthodes de typage de sources microbiennes. Travaux réalisés dans le cadre d une précédente étude Typage de souches d Enterococcus faecalis dans le but de discriminer les origines des pollutions fécales des eaux Travaux soutenus par : - Le Conseil Régional de Basse-Normandie - L'Agence de l'eau Seine Normandie (AESN DEPEE/DLM-EAU et SANTE) Echantillons Eaux usées (origine humaine) Fèces de Bovins Fèces de moutons Isolement de souches d Enterococcus faecalis
6 Typage de souches d Enterococcus faecalis dans le but de discriminer les origines des pollutions fécales des eaux Travaux soutenus par : - Le Conseil Régional de Basse-Normandie - L'Agence de l'eau Seine Normandie (AESN DEPEE/DLM-EAU et SANTE) Echantillons Eaux usées (origine humaine) Fèces de Bovins Fèces de moutons Isolement de souches d Enterococcus faecalis sala gki Amplification et séquençage d ADN à partir de 109 souches 11 gènes: gdh, gyd, psts, gki, aroe, xpt, yqil, sala, efaa, ace, ddle xpt Chromosome d E.faecalis ace ddle gdh Analyses des séquences d ADN pour obtenir un marqueur permettant de discriminer les origines Ovine et Bovine. efaa gyd psts aroe yqil
7 Analyses des séquences d ADN pour obtenir un marqueur spécifique d une origine donnée
8 A T C G Origine 1 G C T A Origine 2 - Hu EF - Hu+Bo EF Fèces Bovins (n=15) Ovins (n=15) Humains (aux usées : n=10) Enrichissement en entérocoques (Slanetz and Bartley) extraction d ADN qpcr EVC Eaux Volontairement Contaminées par des matières fécales (E. coli = 500 (+/-100) UFC/100ml) Bovins (n=10) Ovins (n=10) Humains (n=10) Filtration - Enrichissement (Slanetz and Bartley), extraction d ADN qpcr Marqueur Sensibilité Spécificité Fèces EVC Fèces EVC Hu+Bo EF 96.0 % (n=25) 100 % (20) 100 % (15) 100 % (10) Hu EF 100 % (10) 100 % (10) 96.7 % (30) 100 % (20)
9 Très nombreuses variations de séquence entre les différentes souches d E. faecalis. Seules des souches d origine humaine présentent les mêmes séquences que des isolats cliniques. La recherche de gènes de virulence et de gènes de résistance aux antibiotiques chez les 109 souches étudiées a révélé qu ils sont plus fréquents chez les souches d origine humaine comparativement aux souches d origine animale. % of strain carrying the genes 60 Virulence genes Série1 cattle Série2 sheep Série3 human 10 0 cylb esp gls24 nuc1 psaa xyls like Virulence gene
10 Marqueur bacteroidales EF447F /EF990R du Wapiti (Elk) Dick et al. 2005: (A.E.M. 71: ) Dick et al Nous avons montré que ce marqueur permettait l obtention d un signal à partir d ADN extrait de fèces d ovins, mais pas à partir de fèces de bovins. Elk Bac EVC Hu EVC Bo Ct > Ct neg > Ct neg EVC Ov Ce marqueur Elk Bac permet de discriminer l origine de pollution ovine
11 Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). LESSAY
12 Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). Conchyliculture
13 Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). St Germain sur Ay Plage St Germain sur Ay Lessay Humaine Créances Conchyliculture Pirou plage
14 Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). Humaine Ovine Conchyliculture
15 Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). Humaine Ovine Bovine Conchyliculture
16 Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). Humaine le Dun l Ay Ovine Bovine Conchyliculture
17 Action 2.2. Etude de bassin versant et zones côtières (site du Havre de l Ay (50)). F A B G H I le Dun l Ay J Humaine Ovine C Bovine E D Conchyliculture
18 Echantillonnage mensuel pendant 2 ans : de juillet 2009 à juin points contrôlés chaque mois (240 échantillons) Analyse d un ensemble de paramètres pour chaque échantillon Echantillon d eau Dénombrement des indicateurs de contamination fécale -E. coli : NPP -Entérocoques : NPP Filtrations de 200 ml (filtre 0,45µm) Mesure de paramètres physico-chimiques -Température -ph -Salinité -Oxygène dissous -Turbidité Q U A N T I T A T I F Discrimination de l origine des contaminations avec les marqueurs Bacteroidales -Extraction de l ADN à partir des filtres -qpcr marqueurs bacteroidales: - all Bac - Hu Bac - Rum Bac - Elk Bac Discrimination de l origine des contaminations avec les marqueurs E. faecalis - Enrichissement en entérocoques (gélose Slanetz and Bartley) - Extraction d ADN - qpcr marqueurs E. faecalis: - Hu+Bo EF - Hu EF N O N Q U A N T I T A T I F Diagramme du protocole utilisé pour l étude du site du Havre de l Ay.
19 Action 2.3. Analyses des données. Principales conclusions
20 F A B G H le Dun I l Ay J C Points F, G, H et I pollution systématiquement importante (moyenne >4000 E. coli /100ml) Pollution relativement élevée au point J (moy = 1400 E. coli /100ml) E D A, B et E: très forte variation C et D : eau de bonne qualité
21 F A B G le Dun I H l Ay J C Aux points A, B, mais aussi C, D et F, la pollution est plus importante lors des marées à fort coefficients. E D Sur certains points, dont le point G, la pollution était supérieure en été comparativement aux périodes hivernales
22 F A B G le Dun I H l Ay J Ovine C Fréquence (%) Origine des pollutions des eaux Fréquence (%) d échantillons pour lesquels [E. coli >500 UFC/100ml] Fréquence (%) d échantillons pour lesquels le typage a révélé une origine: Série6 non déterminée animale, Série5 généralement ovine Humaine 40 animale, Série4 ovine et bovine animale, Série3 généralement bovine Bovine E D 20 0 A1 B2 C3 D4 E5 F6 G7 H8 I9 10 J mixte Série2 humaine Série1 Point de prélèvement
23 Conclusions: Durant les fortes marées (Coefficient > 90), la pollution dans le havre et à la sortie semble être principalement liée à l origine ovine. Cependant, aux points C et D, l eau de mer reste conforme : principalement de bonne qualité et plus rarement de qualité moyenne. Les marqueurs utilisés dans cette étude sont complémentaires pour discriminer les trois origines de pollutions Humaine, Ovine, Bovine. Nous avons ainsi pu montrer qu il est possible d identifier les pollutions d origine Ovine. Cependant, le seuil de détection du marqueur Elk Bac est assez élevé comparativement aux marqueurs Rum Bac et Hu Bac.
24 Remerciements:
25 Remerciements: Agence Régionale de Santé (St Lô) Syndicat Mixte Espace Littoraux de la Manche Détermination des sites de prélèvement Mise en relation avec les exploitants agricoles Exploitants agricoles Prélèvements de fèces SAUR Prélèvements d eaux usées Partenaires du projet Aquamanche (Univ Brighton, Environment Agency, Ifremer) Ensemble du personnel de l Unité de Recherche Risques Microbiens S. La Carbona, N. Sauvageot, A. Benachour, N. Verneuil, J.C. Giard, I. Rincé, E. Marchand, A. Blandin, S. Mascré, Y. Auffray
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