Qu est-ce que l Isothermal Titration Calorimetry (ITC)? à l arrêt. en service

Transcription

1 Qu est-ce que l Isothermal Titration Calorimetry (ITC)? à l arrêt en service Sylvain LE CAM Le 05 avril 2013

2 La microcalorimétrie de titration isotherme est une technique thermodynamique permettant l étude de l interaction qui se produit entre deux molécules, en solution. L ITC mesure directement la chaleur absorbée ou libérée pendant un processus de liaison moléculaire. En une seule expérience, on peut déterminer la constante d association à l équilibre (Ka), de la stœchiométrique de la réaction (n), l enthalpie ( H) et l entropie (ΔS). On peut élucider le mécanisme d une interaction intermoléculaire. Il est très utilisé en biochimie, pharmacologie, biologie cellulaire. 2

3 Les applications de l ITC incluent: Caractérisation des interactions moléculaires des petites molécules, protéines, anticorps, acides nucléiques, lipides et autres biomolécules. Cinétiques enzymatiques. Appréciation des effets de changement de structure moléculaire pendant le mécanisme de liaison. Appréciation de l activité biologique. Phénomènes d inhibition/compétition Les interactions pouvant être étudiées par ITC incluent: Protéine-petite molécule Protéine-protéine Cible-principe actif Enzyme-inhibiteur Anticorps-antigène Protéine-ADN Médicament-ADN Protéine-lipide Petite molécule-petite molécule 3

4 Avantages de l ITC Polyvalence d application: Etudier toute interaction biomoléculaire. Véritable technique en solution: Pas de modification chimique ou d immobilisation des composés. Pas de marquage. Pas de limitation de poids moléculaire. On peut travailler avec des solutions colorées ou turbides et des suspensions. Ne nécessite pas de surveillance après le chargement de l échantillon. La sensibilité et l exactitude de l ITC permet de mesurer un ΔH de réaction indétectable par DSC. 4

5 Principe de l ITC Un tampon aqueux placé dans la cellule de référence. Une solution diluée d une substance test dans un tampon aqueux placée dans la cellule d échantillon. La cellule échantillon est sans cesse sous agitation grâce à une seringue contenant une solution de ligand tel qu un principe actif, protéine, molécule d ADN, etc. Le ligand est titrée par injections multiples ou unique dans la cellule échantillon. 5

6 En pratique : Plage de température: 2 C 80 C Volume des cellules: 1,4301 ml Seringue de titration : volume de 290 ml; volumes d injection : 2-10mL (injections multiples) ; débit d injection : 0,1mL/sec (injection continue) [macromolécule] : 5 µm à 1 mm. [ligand] = 10 [macromolécule] Le ph des solutions de ligand et de macromolécule ne doivent pas différer de plus de 0,05. 6

7 Le système ITC utilise une cellule feedback network (CFB) pour compenser la chaleur produite ou absorbée dans la cellule échantillon par rapport la cellule de référence et pour maintenir à une valeur constante très proche de zéro la différence de température entre les cellules. On enregistre au court du temps la puissance appliquée à la cellule échantillon. Sous un logiciel de traitement de données, une isotherme complète de liaison pour les interactions est obtenu en traçant la chaleur intégrée par mole de ligand en fonction du ratio molaire ligands/macromolécules. 7

8 Les valeurs pour la stœchiométrie, la constante d équilibre, et l enthalpie sont déterminées automatiquement comme ci-dessous. La thermodynamique fournit des informations sur les changements de conformation, les liaisons hydrogènes, les interactions hydrophobiques, et les interactions charge-charge. A noter que K B = 1/K d = Ka = 1/affinité K B = binding constant ΔH reflète la force d interaction du ligand avec la macromolécule/celle avec le solvant Après détermination du Ka et du ΔH, on peut calculer : ΔG = -RT ln Ka ΔS = (ΔH ΔG)/T reflète les changement de solvatation et de conformation ΔG <0 réaction spontanée et ΔS>0 interactions hydrophobes, desolvatation ΔG <0 réaction spontanée et ΔS<0 liaison H 8

9 La mesure de l enthalpie à 2 températures différentes permet de calculer le changement dans la capacité calorifique de liaison : = > 0 < 0 ruptures de liaisons hydrophobes formation de liaisons hydrophobes 9

10 Schéma du MicroCal VP-ITC Cellules de 1,4 ml et 0,2 ml 10

11 Comment l ITC fonctionne? 11

12 Interface utilisateur 12

13 Concentration de la macromolécule Mise au point d une manipulation Cas d un ligand L se liant à une macromolécule M. On veut un équilibre des ligands libres et des complexes dans la zone de titrage. n = stœchiométrie K = [ML]/[M][L] à l équilibre [Mtot] = concentration totale de la macromolécule dans la cellule au démarrage de l expérience 10< C idéal <100 M + L<=> ML La forme de l isotherme de liaison est déterminée par le paramètre adimensionnel de Brandt «C»: C = n K [Mtot] 13

14 Les 4 thermogrammes ci-dessous ont une courbure acceptable pour déterminer K. Expérience B ne produit pas assez d énergie Expérience C produit trop d énergie pour obtenir précisément ΔH. K < 10 4 M -1, la concentration en macromolécule doit être importante pour avoir une bonne courbure mais pas trop pour mesurer avec précision les changements de chaleur. et éviter l aggrégation. K > 10 8 M -1 (complexe anticorps-antigène), la concentration en macromolécule doit être faible pour avoir une bonne courbure mais pas trop faible pour produire des changements de chaleur mesurables. 14

15 Exemple de calcul Soit on veux déterminer n et K en plus de ΔH soit ΔH seul. Pour des mesures précises, chaque injection doit libérer ou absorber de 3 à 5 µcal. Considérons l inhibiteur cytidine 2'-monophosphate (2'-CMP) se liant à la ribonuclease-a dont on connaît approximativement : K = 10 6 M -1 ΔH = cal/mole pour un site unique de liaison a) détermination de n, K, ΔH par injections multiples Au moins 10 injections pour obtenir une isotherme donc il faut mesurer: Q = 10*5 µcal [Mtot] = Q/ ΔH*Vcellule On trouve : [Mtot] > 2,4 µm et en particulier pour C = 10 : [Mtot] > 10-5 M pour C = 100 : [Mtot] < 10-4 M b) détermination de ΔH par injection unique On prend C > 100, pour que l ordonnée à l origine de l isotherme donne directement la valeur de ΔH, ce qui veut dire que [Mtot] > 10-4 M Puisqu il y a un excès de macromolécule dans la seringue, tous les ligands seront liés. La chaleur libérée sera : Q = ( cal/mole)*(cseringue)*(vol injecté) Pour [Cseringue] = 10-3 M et Vol injecté = 0,29 ml on a Q > 4,3 µcal Il est aussi possible de mesurer ΔH en injectant un excès de ligand dans une très faible concentration de macromolécule. 15

16 Concentration du ligand Après avoir sélectionné [Mtot], on doit sélectionner la concentration de ligand [Xtot] dans la seringue de 290µl. C > 10 [Xtot] = 7,4 n [Mtot] C < 10 [Xtot] = 10 à 12,5 n [Mtot] D autres facteurs comme la quantité de produit disponible ou la solubilité de celuici sont importants. Choix du solvant : La macromolécule et le ligand devrons être préparés dans le même tampon (même ph, même concentration de tampon, même concentration en sels) pour éviter la chaleur de mélange et de dilution des tampons. Il est conseillé de dialyser ou de filtrer sur gel le ligand et la macromolécule. Si pendant la formation du complexe, des proton sont libérés ou captés, ils seront échangés avec le tampon. Si le tampon a une grande enthalpie d ionisation (Tris- HCl), celle-ci contribuera à l enthalpie mesurée. 16

17 Protocole expérimental 1 ère expérience Une solution de composé 2 dans le solvant 1 est titrée par une solution du composé 3 dans le solvant 1. La chaleur mesurée comprend : - La chaleur d interaction entre les composés 2 et 3 qui nous intéresse. - La chaleur de dilution du composé 2 - La chaleur de dilution du composé 3 que l on peut évaluer comme la chaleur mesurée après la saturation du composé 2. Elle est 10 à 20 fois plus importante que la chaleur de dilution du composé2. - La chaleur d interaction du composé 3 avec le dispositif (paroi de cellule, agitateur, seringue) 2 ère expérience Le solvant 1 est titré par une solution du composé 3 dans le solvant 1. La chaleur mesurée comprend : - La chaleur de dilution du composé 3 - La chaleur d interaction du composé 3 avec le dispositif (paroi de cellule, agitateur, seringue) 17

18 Protocole expérimental 3 ère expérience Une solution de composé 2 dans le solvant 1 est titrée par le solvant 1. La chaleur mesurée comprend : - La chaleur de dilution du composé 2 4 ère expérience Le solvant 1 est titré par le solvant 1. Cette expérience participe au protocole car sa contribution apparait dans les 3 premières expériences. Chaleur d interaction = [chaleur de l expérience 1] - [chaleur de l expérience 2] - [chaleur de l expérience 3] + [chaleur de l expérience 4] D un point de vue pratique, les chaleurs des expériences 3 et 4 sont insignifiantes. Il reste : Chaleur d interaction = [chaleur de l expérience 1] - [chaleur de l expérience 2] Ces 2 protocoles empiriques semblent convenables et fiables pour obtenir la chaleur d interaction, ils sont soutenus par de nombreuses preuves expérimentales néanmoins on n a pas de démonstration rigoureuse que la chaleur mesurée est la chaleur d interaction. 18

19 Thermodynamique de l injection La titration se fait à T, P, V constant, habituellement: Q mesurée = ΔH = enthalpie d interaction Titration de l eau par l eau: injections de 20 µl d eau On passe d un volume V d eau à un même volume V d eau donc Δ H est nul, la chaleur mesurée devrait l être aussi. Il faut trouver une équation pour remplacer Q = ΔH 19

20 Thermodynamique de l injection 1 er principe de la thermodynamique: ΔU = W + Q Q est la chaleur mesurée H = U + PV P, V cst => ΔH = ΔU ΔH = W + Q ΔH = 0 car l état initial et final sont les mêmes. Qmesurée = -Winj provient du travail accompli et est appelée chaleur d injection Le déplacement du piston de la seringue introduit une quantité de liquide dans la cellule et force ce même volume à sortir par le drain. Le travail nécessaire pour cela est appelé «travail d injection». Pour un processus général de titration : ΔH = Winj +Q Q ne représente pas que la chaleur associée à la liaison mais aussi la chaleur associée à la perturbation du solvant aux environs du site de liaison et des changements de conformation des biomolécules ayant lieux par ailleurs et à la formation de liaisons non-covalentes entre d autres solutés. 20

21 Applications de L ITC Un jeu de n sites Une macromolécule à n sites indépendants et identiques avec le même K et ΔH. Cette macromolécule est assimilable à n macromolécule à 1 site. M + L <=> ML K = [ML]/[M][L] = θ/(1-θ)[l] θ fraction de sites occupés par le ligand 21

22 Deux jeux de n1 et n2 sites Applications de L ITC Sites indépendants et pas identiques avec 2 valeurs différentes de K et/ou ΔH K 1 = θ 1 /(1-θ 1 )[L] K 2 = θ 2 /(1-θ 2 )[L] θ fraction de sites occupés par le ligand Exemple :La protéine ovotransferrine possède deux sites d accueil des ions ferriques Injections 1 à 5, titrage des sites N de la protéine Injections 7 à 11, titrage des sites C de la protéine Injections 13 à 15, pas de titrage car les sites sont saturés 22

23 Applications de L ITC Sites de liaisons séquentielles La liaison d un ligand sur un site est influencée par la liaison d un ligand sur un autre site. Sites non indépendants et identiques M + L <=> ML K 1 = [ML]/[M][L] ML + L <=> ML 2 K 2 = [ML 2 ]/[ML][L] ML n-1 + L <=> ML n K n = [ML n ]/[ML n-1 ][L] K2 > K1 coopérativité positive : les 2 sites se saturent avec la chaleur H1 + H2, on ne voit qu une phase sur l isotherme. K 1 > K 2 coopérativité négative : 2 phases apparaissent, la liaison forte du premier ligand et la liaison faible du second ligand. 23

24 Applications de L ITC Sites de liaisons séquentielles Exemple 1: Protéine homodimérique avec 2 sites identiques Exemple 2: liaisons de 4 Br - à Cd ++ 24

25 Applications de L ITC Liaisons compétitives Quand K A >> 10 8 M -1, les concentrations sont trop faibles pour obtenir une valeur précise de K A. Dans ce cas, on mélange la macromolécule avec un ligand B faible et on titre avec le ligand fort A. Le ligand A apparaît moins fortement lié en présence du ligand B. K B et ΔH B sont mesurés dans 1 première expérience La [B] tot est choisie comme ceci à partir du K A estimé: 10 5 M -1 < K A /K B [B] tot < 10 8 M -1 25

26 Etude enzyme/substrat/inhibiteur Applications de L ITC Inhibition compétitive : E = enzyme, S = substrat ; I = inhibiteur Puissance instantanée générée : = ΔH V cell valable sans inhibiteur, dans ce cas [I] = 0 Avec : ΔH = chaleur molaire de décomposition du substrat K M = (k 2 +k -1 ) / k 1 constante de Michaelis-Menten K I = [E] [I] / [EI] constante de dissociation du complexe EI 26

27 Applications de L ITC Etude enzyme/substrat/inhibiteur Méthode 1 : injection unique Substrat dans la cellule et enzyme dans la seringue. En intégrant la compensation de puissance entre t i et t f, on obtient ΔH de décomposition du substrat : ΔH = La concentration du substrat en fonction du temps est : = 27

28 Applications de L ITC Etude enzyme/substrat/inhibiteur Méthode 1 : injection unique K cat (k 2 ) et K M sont les paramètres d ajustement. Expérience similaire effectuée en présence d inhibiteur compétitif mis dans cellule ou la seringue. K cat (k 2 ), K M et ΔH déterminés dans la première expérience sont les paramètres d entrée. La constante d inhibition K I est le paramètre d ajustement. 28

29 Applications de L ITC Etude enzyme/substrat/inhibiteur Méthode 2 : injections multiples Enzyme dans la cellule et le substrat dans la seringue. [Enzyme] méth1 > [Enzyme] méth2 ΔH est obtenu par une injection unique. Les valeurs de: R t = et ne sont plus temporelles mais discrètes. K cat (k 2 ) et K M sont les paramètres d ajustement. 29

30 Applications de L ITC Etude enzyme/substrat/inhibiteur Méthode 2 : injections multiples Expérience similaire effectuée en présence d inhibiteur compétitif mis dans cellule ou la seringue. K cat (k 2 ), K M et ΔH déterminés dans la première expérience sont les paramètres d entrée. La constante d inhibition K I est le paramètre d ajustement. 30

31 Dissociation de dimères Applications de L ITC A forte concentration, une protéine peut se trouver sous forme de dimère. Une injection de cette solution de protéine dans la cellule contenant un tampon provoque une dissociation des dimères accompagnée d un effet thermique. Les paramètres d ajustement sont ΔHdis et la constante de dissociation K. 31

32 Dilution de solution de gomme arabique Applications de L ITC Cellule échantillon : Tampon acétate Seringue : 20 g de gomme arabique / l de tampon acétate 32