Techniques d étude des interactions protéine-protéines à grande échelle. Hervé PHILIPPE BIN1001 hiver 2006

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1 Techniques d étude des interactions protéine-protéines à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1001 hiver 2006

2 Pourquoi étudier les interactions protéineprotéine? beaucoup de matériel à disposition focus sur l étude des fonctions cellulaires capacité des protéines à former des complexes 5 partenaires pour chaque protéine importance des complexes protéiques dans l aspect fonctionnel interactome

3 De nombreuses techniques d étude Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14 in vivo maintien du contexte cellulaire in vitro caractérisation détaillée des interactions (cinétique, stochiométrie ) validation des résultats in vivo

4 Co-immunoprécipitation

5 Double hybride Principe : utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure domaine d activation domaine de liaison à l ADN fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent

6 Double hybride TF DA DA : domaine d activation DL : domaine de liaison à l ADN Système rapporteur DL colonies de levures pas d expression marn expression du gène Fusion protéines et modules du facteur de transcription DA prot 1 prot 2 DL prot 3 DL Expression du système marn

7 Double hybride Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340: Avantages : Inconvénients : Application : expérience facile à mettre en place analyse qualitative faux positifs si les interactions préexistent chez la levure faux négatifs : problème d expression des protéines cibles chez la levure non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome) identification des interactions criblage de banque de protéines

8 Interactome chez C. elegans Li S. et al.; Science 2004; 303:

9 PCA : protein fragment complementation assay Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91: Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7 Principe : a) rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente) b) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester c) mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent

10 PCA : protein fragment complementation assay Avantages : applicable pour les protéines membranaires réponse très rapide Inconvénients : décalage temporel de la réponse au signal d expression nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique Application : identification des interactions étude des réseaux d interaction

11 FRET (fluorescence resonance energy transfer) L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: R 0 excitation Å émission accepteur donneur 475 nm 525 nm nm Principe : excitation d un fluorophore donneur par un photon émission fluorescence par le donneur excitation du fluorophore accepteur s il est suffisamment proche mesure du rapport de fluorescence

12 FRET (fluorescence resonance energy transfer) Avantages : étude dynamique en temps réel applicable in vivo dans le système cellulaire originel peut être couplé à un signal biologique applicable dans tous les compartiments cellulaires Inconvénients : création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions nécessite la surexpression des protéines testées Application : signification biologique des interactions localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie

13 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification Principe : peptide de fixation à la calmoduline tag domaines de fixation de la ProtA aux IgG site de clivage à la TEV protéase 1. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules 2. fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d affinité et élution douce des contaminants 3. clivage du tag par la protéase 4. fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase 5. élution du complexe et analyses subséquentes Puig O. et al.; Methods 2001; 24:

14 Spectrométrie de masse Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21 Inconvénients : Application : nécessite la purification des complexes méthode compliquée et coûteuse identification des protéines présentes dans un complexe

15 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification Avantages : seul l appât est modifié, pas les autres protéines du complexe taux d expression biologique des protéines identification de complexes avec plus de 2 protéines Inconvénients : seules les interactions très stables peuvent être détectées Application : identification des complexes protéiques