Microscopies optiques innovantes Applications à la biologie Jacques DEROUARD Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (LIPhy)

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1 Microscopies optiques innovantes Applications à la biologie Jacques DEROUARD Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (LIPhy)

2 La préhistoire Van Leeuwenhoek ( )

3 La préhistoire

4 La préhistoire Microscope composé 18ème siècle

5 L Histoire Microscope Zeiss (1885) NB Collaboration Abbe - Schott - Zeiss

6 Microscope optique début du 21ème siècle

7 Imagerie morphologique d objets biologiques transparents observés en transmission contraste de phase Microscopie optique contraste interférentiel Milieu inhomogénéité d indice δn épaisseur e: π déphasage 2 δn. e λ coloration (membrane, noyaux ) de cellules «fixées», c est-à-dire mortes!

8 Microscope optique

9 Microscopie optique Contraste de phase (Zernike, 1935) Image transmission normale (cellules de l épithelium de la bouche) Contraste de phase

10 Microscopie optique Contraste interférentiel (Nomarski, 1955)

11 Microscopie optique Imagerie morphologique d objets transparents Imagerie «fonctionnelle» détection, localisation et comportement de molécules impliquées dans le fonctionnement cellulaire cf protéines, ADN, Ca nécessité de «marquage» par objet visible avec une grande sensibilité

12 Microscopie optique Marquage par objet «visible» Molécule colorée, ou particule, spécifiquement attachée ou sensible à molécule ciblée Détection par fluorescence lumière diffusée ou échauffement local

13 Microscopie optique Marquage par objet «visible» Molécule colorée, ou particule, spécifiquement attachée ou sensible à molécule ciblée Détection par fluorescence lumière diffusée ou échauffement local

14 Microscopie de fluorescence La fluorescence est extrêmement sensible et permet dans certains cas la détection de molécules individuelles.

15 Microscopie de fluorescence Il existe des quantités de marqueurs fluorescents commerciaux synthétisés chimiquement Doivent être introduits dans les cellules Doivent être non toxiques pour observation de cellules vivantes Cas des protéines fluorescentes

16 Le prix Nobel de chimie 2008 (R. Tsien, M. Chalfie, O. Shimomura) Molécule «Green Fluorescent Protein» présente naturellement chez certaines méduses

17 Protéines fluorescentes et génie génétique Organismes peuvent être génétiquement modifiés pour fabriquer des protéines «fusionnées» avec cette protéine fluorescente

18 Protéines fluorescentes et génie génétique Organismes peuvent être génétiquement modifiés pour fabriquer des protéines «fusionnées» avec cette protéine GFP

19 Microscope optique de fluorescence «Cube» séparateur

20 Lumière de fluorescence très peu intense / illumination -> «Cube» séparateur Spectres d absorption et de fluorescence d un colorant fluorescent

21 Filtre d excitation Filtre d arrêt Miroir dichroïque

22

23 Immuno-fluorescence à plusieurs couleurs: détection simultanée de plusieurs types de molécules

24 Microscopie de fluorescence Très souvent lampe d excitation est remplacée par un laser imagerie plein champ si faisceau défocalisé ou au contraire image point par point obtenue en balayant le faisceau focalisé sur l objet étudié. -> simple photodétecteur plutôt que caméra -> montage confocal pour limiter profondeur de champ

25 Fluorescence excitée par absorption d 1 photon Objectif

26 Microscopie confocale: trou de filtrage placé devant photodétecteur

27 Microscopie confocale: trou de filtrage placé devant photodétecteur + miroir mobile pour balayer le faisceau Conchello et Lichtman 2005

28 Résolution latérale de l image Dépend essentiellement de la taille du spot du laser focalisé par l objectif Optique des faisceaux laser «gaussiens»: Diamètre du spot laser focalisé 0,38 λ ON

29 Résolution longitudinale de l image: meilleure qu avec une image éclairée plein champ Plein champ Confocal Application à l imagerie 3D par «section optique»

30 Reconstitution 3D