TAB=test QUANTITATIF. Qualitative, Quantitative?
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- Denise Meunier
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1 COFRAC LAB GTA 06 NF EN ISO Paris Janvier 2012
2 Qualitative, Quantitative? «Le guide SH GTA 06 indique que «sont également assimilés au type quantitatif les examens fournissant un résultat de type qualitatif extrapolé à partir de la mesure d un signal continu quantifiable avec interprétation par rapport à un seuil» «On peut classer dans la catégorie des tests qualitatifs tous les examens ou aucune mesure d une donnée quantifiable ne peut être déterminée et ceux dont le résultat est obtenu par l observation de la réaction, par comparaison avec des témoins positif et négatif notamment» Hors pour le TAB Seuil quantifié et interprétation en fonction du seuil Interprétation quantitative ou semi quantitative des résultats (critère de sévérité) TAB=test QUANTITATIF
3 Notion de type de portée: Portée A : kit utilisé sans modification du laboratoire Portée B : Modifications apportées par le laboratoire jusqu au protocole de recherche. Utilisation d un volume de réactifs inférieur à celui recommandé par le fournisseur en conservant les mêmes proportions=portée A avec étude comparative. Le coût réactif fait aujourd hui partie de l assurance qualité
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5 Exemple du kit CD63/CCR3 Buhlmann Utilisation sans un troisième anticorps (Anti IgE) car problèmes de pureté de la population CCR3+ (avec variation du MFI CCR3 importante intra et inter assay), Pas de prise en compte des basophiles SSC+++ et surtout abandon d une augmentation de la sensibilité de 20 à 40%) pour les médicaments
6 La dilution d allergène optimale pour le patient positif à l allergène aura été définie grâce aux résultats obtenus la veille. Elle sera la seule à être testée. Chaque série comprendra, dans la mesure du possible, 10 dilutions optimales de l allergène pour le patient positif d une part et pour le patient négatif d autre part, ainsi que deux contrôles positifs et deux contrôles négatifs par patients, soit 28 tubes passés dans le cytomètre, en deux carrousels pour que les conditions d agitation des tubes soient identiques. Les paramètres analysés seront le pourcentage d expression du CD63, la MIF IgE et la MIF CD63
7 L essai de fidélité intermédiaire consiste à analyser un même échantillon dans des conditions différentes en faisant varier au moins un des facteurs (opérateur, temps, lot de réactifs, étalonnages ). Classiquement, la fidélité intermédiaire est évaluée à partir des résultats des contrôles internes de qualité du fournisseur testés àintervalle de temps répété. Or, il n existe pas de tel contrôle interne de qualité pour ce test et le laboratoire n est pas en mesure de stabiliser un sang de patient qui pourrait être testé sur plusieurs jours. Le laboratoire a donc décidé de tester la fidélité intermédiaire en faisant varier non pas le temps mais l opérateur (le laboratoire compte 3 techniciens formés). Pour rendre les résultats statistiquement exploitables en dépit du faible nombre de tests prévus, chaque opérateur réalisera 5 fois le même test (dans une même série) et c est la moyenne qui sera interprétée. En pratique, cet essai de fidélité intermédiaire sera réalisé à partir des contrôles internes de qualité, permettant ainsi l analyse sur deux niveaux de concentration. Le jour de l étude, les 3 opérateurs techniquerons séparément et dans une série 5 témoins positifs et 5 témoins négatifs à partir du même échantillon de sang. Les paramètres étudiés seront le pourcentage d expression du CD63, la MIF IgE et la MIF CD63
8 L évaluation de la justesse sera réalisée à partir des échantillons de contrôle externe de qualité (CEQ) lancé à l initiative de notre laboratoire (cf. procédure correspondante). La mise en place de ce contrôle de qualité est prévue pour février 2012). Nous calculerons alors l inexactitude de notre méthode en comparant les valeurs obtenues sur les échantillons de CEQ aux valeurs cibles correspondant àla moyenne de l ensemble des participants. Le paramètre analysé sera le pourcentage d expression du CD63 ou l index d activation (selon la famille structurelle de l allergène étudié).
9 L activation du basophile est elle une image fiable du status immun du sujet? Nature de la population étudiée? Spécificité des anticorps utilisés
10 Spécificité moléculaire de la réponse (Latex, béta lactams, curares ) Pricks et IDR Buffy coat CD63 et IgE Rocuronium Vécuronium Suxaméthonium Atracurium Cis-atracurium Pancuronium Mivacurium Rocuronium Vécuronium Suxaméthonium Atracurium Cis-atracurium Pancuronium Mivacurium Méthode : Analyse rétrospective: Nous effectuerons une étude sur 30 résultats d analyses effectuées en routine et concernant les venins (guêpe/abeille), les curares et les béta lactamines, le gold standard étant l association des TC/ histoire clinique
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12 Expérience personnelle lors de réunions avec les cliniciens Intérêt particulier de l analyse des TAB positifs
13 Non applicable
14 La limite de quantification correspond à la plus petite valeur mesurée exprimée en concentration rendue avec un niveau de confiance acceptable et d incertitude connue. Pour le TAB cut off de 4 ou 5% pour plus de 300 basophiles et intervalle de mesure limité à 100% Un résultat négatif est interprété en fonction des résultats des témoins négatifs: fmlp inutile Anti récepteur trop optimiste Anti IgE semble le plus fiable : résultats ininterprétables si <5% et sous réserves si compris entre 5 et 15%, zone d incertitude confirmée par S Glaumann, CD sens for peanut Allergy 2012; 67: pour l anti récepteur
15 Données fournisseur. La stabilité des échantillons de sang sera étudiée à 24h (température ambiante et +4 C), 48h (température ambiante et +4 C) et 72h (température ambiante et +4 C). Chaque résultat sera comparé à celui obtenu dès la réception des échantillons. Seuls les 3 allergènes modèles seront étudiés, chaque mesure de stabilité étant réalisée à partir de 5 échantillons de patients de sorte de s affranchir des variations interindividuelles. Les paramètres étudiés seront le pourcentage d expression du CD63 ou l index d activation (selon la famille structurale à laquelle l allergène appartient).
16 fmlp Anti-igE J0 J1 J2 J3 4 C RT J0 J1 J2 J3 4 C RT venin de vespula J0 J1 J2 J3 4 C RT
17 % act. basophils [CD 63] ACD and EDTA BLOOD STABILITY FLOW CYTOM ETRY RT 2-8 C RT 2-8 C RT 2-8 C RT % activated basophils K3-EDTA BLOOD STABILITY WITH BEE AND WASP ALLERGENS (25 ng/ml) Bee Wasp Bee Wasp 1h 24h 48h 72h edta acd time [h]
18 fmlp Anti-IgE % CD C RT % CD C RT J0 J1 J2 J3 0 J0 J1 J2 J3 Curares % CD C RT J0 J1 J2 J3
19 A la discrétion du biologiste (% activation, MFI, algorithme..etc) mais les méthodes de validation doivent inclure le mode d expression retenu
20 Les principales interférences sont connues : Médicaments : antihistaminiques, immunosuppresseurs, anti mitotiques, corticoïdes à haute dose... EDTA des tubes de prélèvement : dans le cas d un tube insuffisamment remplis (volume inférieur à ) L interférence due aux médicaments est prise en compte lors de la validation biologique : le biologiste rend ininterprétable un résultat négatif lors de la prise d un médicament interférant. L interférence due àun tube EDTA insuffisamment rempli est prise en compte au niveau du mode opératoire.
21 Utilisation des témoins positifs (anti IgE et fmlp) y = -0,3287x + 40,366 ALIQUOTS 09/2010 à 09/2011 % CD Série1 moyenne +2 ECART TYPE - 2 ECTRT TYPE Linéaire (Série1) Deux lots successifs d anti IgE
22 Essai de mise en place début 2012
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