Connaissance et Techniques du Gène

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1 Bio Connaissance et Techniques du Gène Application du clonage dans la génération d une souris transgénique Yannick Alexandre

2 Rappel : promoteur d un gène - Les facteurs de transcription recrutent l ARN polymérase sur le promoteur de gène - Le complexe formé permet l initiation de la transcription - Il existe des facteurs de transcription spécifiques à certains types cellulaires => Expression de gènes restreinte dans un type cellulaire donné

3 Principe du clonage

4 Propriétés des vecteurs de clonage capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée (origine de réplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique) possèdent un polylinker ou site multiple de clonage Possèdent des propriétés permettant la sélection de la cellule hôte (résistance antibiotiques) supportent l insertion d un fragment d ADN plus ou moins grand

5 Différents vecteurs de clonage Taille maximum approximative du fragment d ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur T ype de ve ct eu r Pl as mid e Ph a g e l a mbd a C osm i de Ph a g e P 1 BA C ( bac t eria l ar t i f ic i al chromo s ome) YA C ( yeas t ar t i f ic i al chromo s ome) A D N cl oné en kb

6 Le Cytomégalovirus humain Virus très répandu (60 à 98% population mondiale infectée) Infection latente chez l homme Très pathogène chez les personnes sans système immunitaire Aucun vaccin mais des traitements antiviraux existent (non prescriptibles femmes enceintes et nourrissons) Objectif : mieux comprendre la réponse immunitaire lors de l infection du cytomégalovirus => Établir de nouveaux traitements ou vaccins

7 Rôle des cellules dendritiques pour combattre les virus Système immunitaire inné Système immunitaire adaptatif Activation Cellule Natural Killer (NK) Activation T CD4+ Aide activation Lyse des cellules infectées Cellule dendritique Activation T CD8+ Lyse des cellules infectées

8 Est-ce que les cellules dendritiques sont essentielles au contrôle de l infection par le cytomégalovirus? Système immunitaire inné Système immunitaire adaptatif Activation Cellule Natural Killer (NK) Activation T CD4+ Aide activation Lyse des cellules infectées Cellule dendritique Activation T CD8+ Lyse des cellules infectées

9 Utilisation d un modèle souris dans lequel les cellules dendritiques sont déplétées Comment dépléter un type cellulaire in vivo? Anticorps ciblant la cellule (en général pas entièrement spécifique) Introduire une toxine dans le type cellulaire à dépléter

10 La toxine diphtérique et son Diphtérie : maladie infectieuse d origine bactérienne (nombreuses épidémies dont les symptômes sont de type angine) récepteur La bactérie secrète une toxine qui induit la mort des cellules du cœur et neuronales(une seule molécule suffit à tuer une cellule) par inhibition synthèse protéique

11 Comment faire exprimer le DTR dans les cellules dendritiques? P P CD11c CD11c P CD11c P CD11c P DTR P DTR Cellules dendritiques Autres cellules Cellules dendritiques Autres cellules +DT P CD11c P CD11c P P CD11c DTR P P CD11c DTR Cellules dendritiques Autres cellules Cellules dendritiques Autres cellules

12 Expression d une protéine fluorescente et du récepteur à la toxine diphtérique pour évaluer la déplétion des cellules dendritiques in vivo Etape 1 In vitro -Génération de la construction par clonage -Expression dans une lignée de cellules dendritiques Observation de l efficacité de la construction Observation des cellules GFP+ Evaluation de la déplétion Etape 2 In vivo Génération d une souris transgénique CD11c-DTR-GFP (le récepteur à la toxine diphtérique et la GFP sont sous contrôle du promoteur du gène CD11c) Observation des cellules GFP+ Suivi de la déplétion suite à l injection de la DT

13 Etape 1 Tissu humain ARNm total ADNc total SiteR ADNc site R Clonage

14 Amplifier l ADN du gène codant le récepteur à la toxine diphtérique A partir de quel matériel? à partir du génome : il restera les introns et les séquences non codantes avec de l ARNm : impossible (ARN est peu stable et U à la place des T) à partir de l ADNc : plus d introns (à utiliser pour de la transfection transitoire) E1 E2 E3 E4 E5 gène ARNm non épissé E1 E2 E3 E4 E5 ARNm épissé Etape 1

15 Banque de données Séquençage génome humain : Dans une banque de données la séquence du gène, ARNm, ADNc est disponible ainsi que le profil d expression A partir de la séquence on définit des amorces d ADN pour amplifier le gène par PCR Etape 1

16 Obtention ADNc 1) Isolation ARNm d un tissu humain A partir d un tissu humain où le DTR est exprimé Purification ARNm total Utilisation d une colonne qui accroche l acide nucléique (ADN et ARN) Besoin de dégrader l ADN (DNase) Elution de l ARNm total Etape 1

17 Obtention ADNc 2) Rétrotranscription ARNm Etape 1 On utilise une ADN polymérase ARN-dépendant (copie l ARN en ADN) Cette même polymérase possède une activité exoribonucléase sur les molécule ARN-ADN Les amorces sont des oligo-dt et des amorces générées aléatoirement

18 Il faut maintenant amplifier l ADNc correspondant au gène codant pour le DTR et modifier la séquence de l ADNc pour y inclure aux extrémités des sites de restriction => mutagenèse par PCR Tissu humain ARNm total ADNc total SiteR ADNc site R Etape 1 Clonage

19 Mutagénèse par PCR Eco RI Bam HI 3 ADNc Du DTR cycles PCR Bam HI ADNc du DTR EcoR I Etape suivante : cloner la séquence d ADN amplifiée Etape 1

20 Vecteur de clonage pegfp-n1 : vecteur disponible dans le commerce Gène codant la GFP en aval du site MCS Insertion ADNc du DTR dans le cadre de lecture de la GFP Protéine de fusion DTR-GFP Les cellules GFP+ sont les cellules qui expriment le DTR Etape 1

21 Etape du clonage GGATCC CCTAGG ADNc du DTR GAATTC CTTAAG BamHI EcoRI Etape 1

22 Validation protéine de fusion Il faut vérifier que la protéine de fusion est fonctionnelle avant de passer à l étape suivante (transgenèse de la souris) Transfection d une lignée cellulaire avec le plasmide Observation fluorescence de la GFP Injection de toxine diphtérique et quantification taux de mort cellulaire Etape 1

23 Validation protéine de fusion Sélection d un clone bactérien contenant le plasmide ayant le gène de la protéine de fusion Amplification du clone et purification du plasmide DTR-GFP Transfection DTR-GFP Puis DT Visualisation GFP et test de la DTR La construction fonctionne in vitro L étape suivante : insérer le transgène dans le génome de la souris

24 Clonage de l ADN Nouvelle construction de plasmide => transfection de cellules ES Neo : gène résistance à la néomycine NotI Etape 2

25 Description des cellules souches embryonnaires Les cellules souches embryonnaires sont des cellules souches pluripotentes issues d un embryon au stade de blastocyste. => Elles peuvent donner des cellules spécialisées par différenciation cellulaire =>Elles peuvent pratiquement se renouveler indéfiniment Etape 2 Transfection des cellules souches et sélection des cellules ayant incorporé le transgène de façon stable

26 Reconstitution souris transgénique Cellules ES injectées dans des blastocystes de souris blanches Cellules souches contenant le transgène CD11c-DTR- GFP Mixed Progeny Accouplées avec souris noirs Mix Balb/c // C57BL/6 Souris chimères C57BL/6 contient le transgène?

27 Validation de la souris transgénique Injection de DT ou non puis infection ou non Identification des cellules dendritiques par cytométrie de flux Souris CD11c-DTR-GFP Les cellules dendritiques sont nécessaires à la survie des souris infectées par le cytomégalovirus Prochaine étape : comprendre pourquoi les souris meurent => quel est l état d activation du système immunitaire

28 Conclusions sur le clonage Méthode très répandue et peu couteuse Nombreuses applications : Séquençage des génomes Production à grande échelle de protéines (hormone de croissance par exemple) Transgénèse => organisme génétiquement modifié

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