UE Biologie Intégrative Protocole du dosage de la cystéine
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- Antoinette Dubois
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1 Sineux Jade et Houée Sophie UE Biologie Intégrative Protocole du dosage de la cystéine
2 Pourquoi cette expérience? Arabidopsis Thaliana, Graines Les prédictions bioinformatiques sont : -O-acétylserine,Aspartate aminotransferase 3,glyoxylate aminotransferase sous-expression. -Cystéine suraccumulé. Confirmation d'une suraccumulation de cystéine par l'expérimentation.
3 Quelles techniques? Extraction des acides aminés libres. Dérivation des groupements thiols HPLC Chromatographie en phase liquide.
4 Extraction des acides aminés libres Broyage avec de l'éthanol à 90% Centrifugation + récupération du surnageant Ajout de l'éthanol à 80% Échantillons testés : - Graines provenant des plantes mères de la condition standard et de la condition froide -Graines provenant du mutant SALK_ Contrôle positif de l'étape d'extraction -Quantité de graines : 10 grammes -3 Réplicats biologiques sont effectuées.
5 Extraction des acides aminés libres Broyage avec de l'éthanol à 90% Centrifugation + récupération du surnageant Ajout de l'éthanol à 70% Échantillons testés : - Graines provenant des plantes mères de la condition standard et de la condition froide -Graines provenant du mutant SALK_ Contrôle positif de l'étape d'extraction -Quantité de graines : 10 grammes -3 Réplicats biologiques sont effectuées.
6 Extraction des acides aminés libres Broyage avec de l'éthanol à 90% Centrifugation + récupération du surnageant. Extrait introduit dans une colonne contenant de la permutite Q Elimination de l'ammonium Ajout du tampon citrate solution à ph=1,8 Centrifugation + récupération du surnageant Ajout de l'éthanol à 70% Décrochage des acides aminés par élution avec NaOH Échantillons testés : - Graines provenant des plantes mères de la condition standard et de la condition froide -Graines provenant du mutant SALK_ Contrôle positif de l'étape d'extraction -Quantité de graines : 10 grammes -3 Réplicats biologiques sont effectuées.
7 Extraction des acides aminés libres Broyage avec de l'éthanol à 90% Centrifugation + récupération du surnageant. Extrait introduit dans une colonne contenant de la permutite Q Elimination de l'ammonium Ajout du tampon citrate solution à ph=1,8 Centrifugation + récupération du surnageant Ajout de l'éthanol à 70% Décrochage des acides aminés par élution avec NaOH Échantillons testés : - Graines provenant des plantes mères de la condition standard et de la condition froide -Graines provenant du mutant SALK_ Contrôle positif de l'étape d'extraction -Quantité de graines : 10 grammes -3 Réplicats biologiques sont effectuées. Étapes critiques de la méthode.
8 Dérivation des groupements Thiols Réaction de substitution nucléophile Pour les acides aminés soufrés seulement Réaction quasi-total Solvant : Citrate de sodium à 0,2 N, ph=2,2.
9 Dérivation des groupements thiols Réalisation d'une chromatographie sur colonne échange de cation. Permet la séparation du produit et des réactifs. Étape critique est la réaction entre les acides aminés soufrés et le mbbr
10 HPLC Chromatographie en phase liquide. Phase stationnaire : Colonne de silice C18 HPLC inversé Phase mobile : Éluant composé de nos extraits d'acides aminés libres et d'un solvant composé d'éthanol et d'eau. Une solution contenant que de la cystéine pure, témoin positif. On réalise deux HPLC par échantillon. HPLC du mutant Contrôle positif
11 HPLC Chromatographie en phase liquide.
12 HPLC Chromatographie en phase liquide. HPLC doit être accompagné d'une analyse statistique de quantification de l'aire sous PIC Étape limitante dû à la taille de la colonne et la nature de l'élution qui diminue la sensibilité. Avantage : Fort pouvoir de séparation.
13 Durée de nos expérimentations Extraction des acides aminés totaux : Durée de 3 heures par échantillon soit 3 jours. Dérivation des thiols et HPLC : Pour un échantillon durée de 40 minutes au lieu de 3 à 4 heures. Soit une durée de 320 heures ou 14 jours. Obtention de résultats au bout d'un mois.
14 Résultats attendus Profil pour le mutant Profil des graines de la condition froide Conclusion : Pour le mutant on observe bien de la cystéine, extraction OK. Condition froide suraccumulation de la cystéine. Profil des graines De la condition standard
15 Expériences envisagés Deux lignées de mutants conditionnels à réaliser : suraccumulation de la cystéine et inactivation de l'enzyme O-acétylserine. Récupération des mutants à partir des banques de données qui ne synthétise pas de glutathion. Taux de germination et dosage de la cystéine. Action du métabolisme de la cystéine sur la qualité germinative
16 Retour sur le budget Pour 3 conditions on réalise 3 réplicats biologiques, chaque réplicat subit deux HPLC soit 18 résultats. Extraction des acides aminés : 705,90 euros Dérivation des groupements thiols: 271,50 euros HPLC/Fluorimétrie : 710,70 euros Montant total de l'expérience : 1688,10 euros
17 Références Nguyen et Paquin, J.Chromatogr.,61(1971) Newton,Doriand and Fahey, Analytical Biochemistry 114, (1981) Rüegsegger and Brunold, Plant Physiol (1992)99,
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![K W = [H 3 O + ] [OH - ] = 10-14 = K a K b à 25 C. [H 3 O + ] = [OH - ] = 10-7 M Solution neutre. [H 3 O + ] > [OH - ] Solution acide](/thumbs/20/420627.jpg "K W = [H 3 O + ] [OH - ] = 10-14 = K a K b à 25 C. [H 3 O + ] = [OH - ] = 10-7 M Solution neutre. [H 3 O + ] > [OH - ] Solution acide")
La constante d autoprotolyse de l eau, K W, est égale au produit de K a par K b pour un couple acide/base donné : En passant en échelle logarithmique, on voit donc que la somme du pk a et du pk b d un
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