MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN

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1 CHAPITRE MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN RÉSUMÉ La maladie hémorragique du lapin (RHD) est une maladie mortelle fortement contagieuse et aiguë qui atteint le lapin européen (Oryctolagus cuniculus) et est provoquée par un calicivirus. Une maladie semblable, dénommée syndrome du lièvre brun européen (EBHS), a été décrite chez les lièvres (Lepus europaeus). L agent étiologique est un calicivirus différent, mais antigéniquement proche du virus de la RHD (RHDV). La RHD est caractérisée par une morbidité et une mortalité élevées (40 à 90 %), et se propage très rapidement par transmission directe ou indirecte. L infection peut se produire par voie nasale, conjonctivale ou orale. La transmission de la RHD est facilitée par la stabilité élevée du virus dans l environnement. La période d incubation varie de 1 à 3 jours, et la mort se produit habituellement en 12 à 36 h après le début de l hyperthermie. Les manifestations cliniques ont principalement été décrites pour l infection aiguë (signes nerveux et respiratoires, apathie et anorexie). Les lésions pathologiques sont spécifiques et évidentes, autant macroscopiquement que microscopiquement. On constate une nécrose hépatique et une coagulopathie intravasculaire disséminée (CIVD) massive dans tous les organes et les tissus. Les lésions les plus importantes se retrouvent dans le foie, la trachée et les poumons. Des pétéchies sont visibles dans presque tous les organes et sont accompagnées d une diminution de la coagulation sanguine. Identification de l agent pathogène : le foie contient les titres viraux les plus élevés et est l organe le plus approprié pour la mise en évidence du virus. Comme aucune condition de croissance satisfaisante ou milieu de culture de cellules sensibles n a pu être établie, l isolement in vitro ne peut être employé. Le test d hémagglutination (HA) sur globules rouges humains du groupe sanguin O a été le premier test utilisé pour le diagnostic de routine en laboratoire de la RHD. Cependant d autres tests (immunomicroscopie électronique indirecte, méthode immuno-enzymatique (ELISA), marquage immunohistologique, amplification en chaîne par polymérase (PCR) et Western Blot) ont montré des niveaux de sensibilité et de spécificité plus élevés. Épreuves sérologiques : la caractérisation et le titrage des anticorps spécifiques résultant de l infection normale ou de l immunisation sont réalisés par inhibition de l hémagglutination ou par ELISA, indirect ou de compétition. Les réactifs suivants sont préparés : antigène à partir de foie de lapin infecté, sérum anti-rhdv de lapins convalescents ou hyperimmunisés et sérum négatif de lapins sensibles à l infection par le RHDV. Plusieurs laboratoires ont produit des anticorps monoclonaux (AcM). Quelques-uns ont produit un antigène recombinant, la protéine structurale VP6O exprimée en système baculovirus, antigène qui peut être employé à des fins diagnostiques. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : le contrôle indirect de la maladie est réalisé par la vaccination, en utilisant un vaccin inactivé préparé à partir de suspensions clarifiées de foie de lapins expérimentalement infectés, ensuite inactivées ainsi qu adjuvées. Les animaux vaccinés produisent rapidement une immunité complète contre l infection par le RHDV (et ceci dans les 5 à 10 jours). Les données expérimentales indiquent que la protection vaccinale peut s étendre sur une longue période (plus de 1 an). A. INTRODUCTION La maladie hémorragique du lapin (RHD) est une maladie mortelle fortement contagieuse et aiguë des lapins européens sauvages et domestiques (Oryctolagus cuniculus). Manuel terrestre de l OIE

2 La RHD a été rapportée pour la première fois en 1984 en République Populaire de Chine (19) ; actuellement elle est enzootique en Asie de l Est, en Europe et en Océanie. Des épizooties ont également été enregistrées en Amérique Centrale (au Mexique et à Cuba), en Arabie Saoudite ainsi qu en Afrique du Nord et de l Ouest. En 2000 et 2001, 3 épizooties indépendantes ont été enregistrées aux États-Unis d Amérique. L agent causal de la RHD est un calicivirus de 32 à 35 nm de diamètre et sa capside est constituée d un polypeptide unique (60 kda), son génome est constitué d un ARN de 7437 kb et un ARN sous-génomique de 2,2 kb (9, 20-22). La protéine de capside (VP60) du virus de la RHD (RHDV) se compose de 2 domaines distincts liés par une région charnière : les résidus en positions de la partie N-terminale constituent le domaine intérieur et les résidus au-delà des positions , c est-à-dire de la partie C-terminale, constituent le domaine saillant. Dans l image globale de la capside, ces domaines forment une couche interne et une couche externe, cette dernière étant caractérisée par des structures en forme d arche. Cette structure est également en corrélation avec les caractéristiques antigéniques du RHDV ; en fait les déterminants antigéniques principaux sont situés dans la partie C-terminale (4, 5, 23, 27). Depuis 1991, un second type de particule virale a été identifié comme composant principal dans approximativement 5 % des échantillons RHDV-positifs, c est-à-dire pris sur des lapins présentant une évolution longue de la maladie (8). Les caractéristiques de cette particule sont : i) une surface lisse et un diamètre plus petit que le RHDV ; ii) sa protéine est de 28 à 30 kda ; iii) elle réagit avec les sérums de lapins convalescents de la RHD et avec des anticorps monoclonaux (AcM) anti-rhdv réagissant avec la partie N-terminale de la VP60 du RHDV, et iv) elles est négative à l hémagglutination (HA). Cette particule virale plus petite correspond à la coque interne du RHDV, et 2 hypothèses ont été proposées pour expliquer son origine. Granzow et al (15) ont supposé qu elle résultait du génome tronqué du RHDV ou d une expression défectueuse de son génome. Cependant, Barbieri et al. (2) ont observé ce qui suit : i) une forte corrélation entre une présence plus grande de particules lisses de RHDV (s-rhdv) dans les organes et l apparition d IgM spécifiques anti-rhdv au jour 3 ou 4 post-infection ; ii) la présence de grandes quantités de s-rhdv dans le foie et la rate seuls et pas dans la circulation sanguine, comme cela se produit dans la phase de virémie de RHD aiguë ; iii) la découverte de fragments de la VP60 ayant différentes masses moléculaires (41 à 30 kda) durant la transition entre RHDV et s-rhdv. De cela, ils concluent que la genèse de la particule est due au processus de dégradation qui est probablement la conséquence du nettoyage physiologique des complexes immuns IgM-RHDV formés en grandes quantités lors du début de la réponse humorale. Indépendamment de son origine, l identification de cette deuxième particule dans le foie peut être considérée comme un marqueur de la forme subaiguë/chronique de la RHD, qui évolue habituellement entre les jours 4 et 8 post-infection et est suivie de la mort du lapin ou, moins souvent, par son rétablissement (2). Tous les isolats viraux connus de RHD semblent appartenir à un seul sérotype. La séquence complète de souches de RHD d origines géographiquement différentes a été publiée. Les comparaisons révèlent une homologie assez proche en termes de séquence génomique avec peu ou pas de changements dans la composition en acides aminés (différences variant de 2 à 5 %). Néanmoins des isolats qui montrent des variations dépendant de la température de l hémagglutination (3) ont été décrits, et plus récemment un variant génétique et antigénique du RHDV a été décrit simultanément en Italie (4) et en Allemagne (23). Ce variant RHDV, appelé RHDVa présente des changements en acides aminés 3 fois plus importants que dans les isolats précédemment séquencés, ceci en surface de la région exposée E (aa ) qui contient les épitopes principaux des calicivirus. Un set d anticorps donné qui protègent contre l infection par le RHDV a été testé négativement par réaction immuno-enzymatique (ELISA) contre un antigène du RHDVa. Cependant, des lapins expérimentalement vaccinés avec le vaccin actuellement disponible contre le RHDV ont été protégés lors d un challenge avec le RHDVa, même si c était avec une efficacité inférieure (4, 23). Un autre virus, provisoirement appelé calicivirus du lapin (RCV) et lié au RHDV, a été identifié chez des lapins sains (6, 7). Il est significativement différent des isolats précédemment caractérisés de RHDV en terme de pouvoir pathogène, titrage viral, tropisme tissulaire et séquence primaire de la protéine structurale. Il est avirulent, se réplique dans l intestin à un bas titre et a une homologie génomique d environ 92 % avec le RHDV. Les résultats d expériences de protection croisée indiqueraient que ce virus ne pourrait pas infecter les lièvres. En outre les données antigéniques et les comparaisons de séquence ont démontré qu il est plus proche du RHDV que du virus du syndrome du lièvre brun européen (EBHSV). Le RHDV est très stable et résistant dans l environnement. L infectiosité du virus n est réduite ni par traitement au chloroforme, ni par l éther, ni par la trypsine, ni par exposition à ph3, ni par chauffage à 50 C pendant 1 h. Le virus survit durant au moins 225 jours dans une suspension d organe maintenue à 4 C, au moins 105 jours à l état déshydraté sur tissu à température ambiante, et au moins 2 jours à 60 C, autant en suspension d organe qu à l état déshydraté (24). Il garde également son infectiosité à des températures basses, et reste tout à fait stable lors des processus de congélation/décongélation. Le RHDV est inactivé par l hydroxyde de sodium à 10 %, par le formol à 1-1,4 % et par la béta-propiolactone à 4 C. De tels traitements n altèrent pas l immunogénicité du virus Manuel terrestre de l OIE 2005

3 Le lapin européen (Oryctolagus cuniculus) est la seule espèce connue à être infectée par la RHD. Aucun autre lagomorphe, tel le lapin du volcan du Mexique (Romerolagus diazzi), le lapin à queue noire (Lepus californicus) et le lapin de garenne d Amérique du Nord (Sylvilagus floridanus), ne s est avéré sensible (16). Une maladie semblable, nommée le syndrome du lièvre brun européen (EBHS), a été décrite chez les lièvres (Lepus europaeus), mais son agent étiologique, qui est également un calicivirus, est différent du RHDV, bien qu il lui soit antigéniquement apparenté. L alignement des séquences d ARN des génomes du EBHS et du RHDV montre une identité nucléotidique de 71 %, et l alignement des acides aminés montre une identité de 78 % et une similitude de 87 % (27). L infection croisée expérimentale de lapins avec l EBHS et de lièvres avec le RHDV ne se produit pas (18). Des études récentes ayant tenté de démontrer la sensibilité du lapin à l EBHSV ont indiqué une prévalence diffuse du virus dans une population sauvage de lapins de garenne et la possibilité d induire une maladie clinique et une mortalité chez un petit nombre de ces lapins de garenne expérimentalement infectés (Lavazza données non publiées). La RHD est caractérisée par une morbidité élevée et un taux de mortalité qui se situe entre 40 et 90 %. L infection se produit chez les lapins de tout âge, mais la maladie clinique n est seulement observée que chez les adultes et les jeunes animaux de plus de 40 ou 50 jours. Le mécanisme pathogénique de résistance des jeunes animaux est encore inconnu (8). L évolution clinique de la maladie peut être suraiguë, aiguë, subaiguë ou chronique. Les manifestations cliniques ont été décrites principalement pour l infection aiguë, puisque habituellement il n existe aucun signe clinique dans la forme suraiguë, et que la forme subaiguë est caractérisée par des signes similaires, mais plus légers. La période d incubation varie de 1 à 3 jours ; la mort peut survenir 12 à 36 h après le début de la fièvre (>40 C). Pendant une épizootie, un nombre limité de lapins (5 à 10 %) pourra développer une forme chronique ou subaiguë de la maladie. Ces animaux meurent souvent 1 à 2 semaines plus tard, probablement suite à une dysfonction hépatique. Les lésions pathologiques sont variables et peuvent être légères. Les lésions primaires sont de la nécrose hépatique et de la splénomégalie. Cependant, une coagulopathie massive est généralement la cause d hémorragies dans toute une série d organes et d une mort soudaine. Dans la maladie subaiguë et la maladie chronique, un ictère des oreilles, de la conjonctive et des muqueuses est clairement évident. Les signes cliniques et les lésions macroscopiques et microscopiques observés chez les lièvres atteints de EBHS sont très similaires à ceux décrits pour la RHD chez le lapin. À l autopsie, les principales découvertes sont de l œdème et de la congestion de la trachée avec un contenu hémorragique spumeux, de la dégénérescence hépatique, de la splénomégalie et un ictère généralisé (8). La maladie chez les lièvres dure légèrement plus longtemps et cause un taux de mortalité un peu plus bas (autour des 50 %) que la RHD chez le lapin ; le pic de mortalité chez des lièvres expérimentalement infectés est généralement observé entre 60 et 90 h post-infection. 1. Identification de l agent pathogène B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC Le foie contient le titre viral le plus élevé (de 10 3 DL 50 [dose létale 50 %] à 10 6,5 DL 50 ) et est l organe de choix pour l identification virale du RHDV comme du EBHSV. La quantité de virus présente dans d autres parties du corps est directement proportionnelle à la vascularisation ; ainsi la rate et le sérum sont assez riches en virus et peuvent servir de matériel alternatif de diagnostic. En particulier, de plus hauts niveaux en particules sous-virales peuvent être détectés dans la rate plutôt que dans le foie de certains animaux morts de la forme subaiguë/chronique de la maladie (2). Le traitement initial de l échantillon de diagnostic est presque identique quelque soit la méthode de diagnostic à appliquer, à l exception des techniques d immunomarquage. Un fragment d organe est homogénéisé mécaniquement dans une solution physiologique tamponnée au phosphate à 5-20 % (w/v) (PBS), ph 7,2, filtré à l aide de gaze et clarifié par centrifugation à g pendant 5 min. À cette étape, le surnageant peut être directement examiné par un test d hémagglutination (HA) ou par un ELISA. Si l échantillon doit être examiné au microscope électronique (EM), il est envisageable de réaliser une seconde centrifugation à g pendant 15 min, avant l ultracentrifugation finale. Comme aucune condition de croissance satisfaisante ni de culture de cellules sensibles n a pu être établie, l isolement in vitro du RHDV ou du EBHSV ne peut pas être inclus dans les méthodes virologiques. L inoculation de suspensions de tissus de lapins infectés ne permet pas de reproduire la maladie et aucune réplication du virus n a été détectée par la technique de la transcription inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) chez 28 espèces de vertébrés autres que le lapin (24). L inoculation au lapin reste donc la seule manière d isoler, de propager et de titrer l infectiosité du virus. De grandes quantités d antigènes viraux sont préparées pour les réactifs diagnostiques et pour produire des vaccins inactivés dérivés de tissus. L infection expérimentale n est pas pratique comme méthode de diagnostic de Manuel terrestre de l OIE

4 routine, bien que cela puisse être utile dans le cas où des échantillons donneraient des résultats de tests équivoques (exemple : HA négatif/elisa positif) ou pour le diagnostic initial dans des pays où la RHD n est pas censée exister. Pour faire des essais expérimentaux réussis, les lapins concernés doivent être entièrement sensibles au virus, c est-à-dire qu ils devraient être âgés de 40 ou 50 jours et ne pas posséder d anticorps spécifiques, même à bas titre. La RHD peut être reproduite par utilisation de suspensions de foie filtrées et traitées aux antibiotiques, inoculées soit par voie intramusculaire, soit par voie intraveineuse, soit per os. Quand la maladie est cliniquement évidente, les signes et les lésions post mortem sont identiques à ceux décrits pour une infection naturelle. Une augmentation de la température corporelle est enregistrée entre 18 et 24 h post-infection, suivie, aux alentours de 70 à 90 % des cas, de mort entre 24 et 72 h post-infection. Quelques individus peuvent survivre jusqu à 6 jours après l infection. Les animaux qui surmontent la maladie montrent seulement une hyperthermie transitoire, de l abattement et de l anorexie, mais présentent une forte séroconversion saisissante qui peut être facilement détectée 4 à 6 jours après l infection. a) Test d hémagglutination L HA a été le premier test utilisé pour le diagnostic de laboratoire en routine de la RHD (19). Il devrait être réalisé avec des globules rouges (GR) humains de groupe O, fraîchement collectés, stockés toute une nuit dans de la solution d Alsever, et lavés avec du PBS à 0,85 % et à ph 6,5 (gamme de 6-7,2). L HA est moins évidente voire inexistante lorsque des GRs d autres espèces sont utilisés. Les GRs lavés sont suspendus dans du PBS à 0,75 %. Une dilution 2x du surnageant clarifié d un homogénat à 10 % de tissus de foie ou de rate est incubé avec un volume égal de GRs lavés dans une plaque de microtitrage scellée à 4 C, de préférence. Après 1 h (entre 20 min et 2 h) d incubation, l hémagglutination à une dilution > à 1/160 est considérée comme positive. Des titres moins élevés pourraient être considérés comme douteux, et devraient être vérifiés par d autres méthodes. Aux alentours de 10 % des échantillons sont positifs par ELISA ou microscopie électronique, mais donnent des résultats négatifs au test d hémagglutination (HA faux négatifs). Certains isolats de RHD peuvent montrer des différences dépendant de la température dans leurs caractéristiques d hémagglutination (3) et pourraient montrer une activité HA seulement lorsque le test est réalisé à 4 C. Néanmoins les faux négatifs au HA sont principalement détectés dans les organes de lapins montrant une forme subaiguë/chronique de la maladie et cela dépend des caractéristiques des particules lisses, tronquées de RHDV. Les organes de lièvres donnent rarement un titre significatif quand le protocole HA RHDV est utilisé. Pour metttre en évidence une activité HA dans des organes provenant de lapins infectés par le EBHSV, une procédure modifiée doit être adoptée : toutes les étapes sont effectuées à 4 C, la suspension d organe est traitée avec un volume égal de chloroforme, et les GRs ne sont pas utilisés à un ph plus élevé que 6,5 (8). Même avec cette méthode, environ 50 % seulement des échantillons donnent un résultat positif, car cette maladie est le plus souvent subaiguë ou chronique chez les lièvres et que le virus doit donc avoir les caractéristiques antigéniques et structurales typiques des particules s-rhdv (8). En raison de la difficulté pratique d obtenir et de conserver des cellules sanguines humaines du groupe O, ainsi que du risque de travailler avec ces cellules, et de la difficulté d obtenir des résultats répétables, ce test a été remplacé par la détection du virus par ELISA. b) Microscopie électronique La microscopie électronique en coloration négative peut être réalisée par la méthode dite «méthode de la goutte». Une grille recouverte de formvar/carbone est placée sur une goutte de suspension d organe (préparée de la façon décrite dans la section B.1.a), et laissée pendant 5 min. Après avoir enlevé l excès de fluide avec le bord d un morceau de papier filtre déchiré, la grille est laissée, flottant sur une goutte à 2 % de phosphotungstate de sodium (NaPT), ph 6,8, pendant 1,5 min. L excès de coloration est enlevé et la grille peut être observée à un grossissement de Du fait de la faible sensibilité de la méthode de la goutte, il est envisageable de centrifuger l échantillon dans le but de concentrer les particules virales. Le culot obtenu après ultracentrifugation d au moins g pendant 30 min ou, alternativement en utilisant une Beckman Airfuge à 21 psi durant 5 min est resuspendu dans du PBS ou de l eau distillée, déposé sur une grille pendant quelques minutes, et ensuite coloré tel que décrit par avant. Les virions de RHD sont visibles sous forme de particules sans membrane, de 32 à 35 nm de diamètre, présentant une structure interne (25 à 27 nm de diamètre), délimitée par un anneau duquel radient 10 petites projections périphériques à distribution régulière. Les particules lisses (s-rhdv) sont identifiées par la perte complète des portions externes, devenant parfaitement hexagonales et plus petites, avec seulement l anneau de la capside visible (2, 8, 14). Dans le but de réaliser un diagnostic, notamment lorsque les autres méthodes donnent des résultats douteux, la meilleure méthode microscopique est une technique immuno-électromicroscopique (IEM). Cette méthode utilise soit un sérum hyperimmun anti-rhdv, obtenu de lapin ou d autres espèces, soit des AcMs 1048 Manuel terrestre de l OIE 2005

5 spécifiques, qui sont incubés avec un volume équivalent de l échantillon pendant 1 h à 37 C avant ultracentrifugation. La réaction immunologique induit l agglutination des particules virales dans un agrégat qui est rapidement et aisément identifié à l EM. Les méthodes immunologiques utilisant l or sont également appliquées pour mieux visualiser les virions et les protéines virales. L EBHSV peut aussi être identifié dans des échantillons diagnostiques par examen en EM. En outre, la méthode IEM utilisant du sérum convalescent anti-ebhsv ou des AcMs spécifiques anti-ebhs peut être appliquée pour identifier l EBHSV. En utilisant des antisérums spécifiques pour l EBHSV et le RHDV, il est possible de différencier les 2 virus. c) Méthodes immuno-enzymatiques La détection de virus par un ELISA se fonde sur une technique de type «sandwich» et beaucoup de techniques dérivées ont été décrites. Une procédure utilise les réactifs, solutions, temps et température qui sont employées dans l ELISA de compétition (c-elisa) pour la sérologie (voir section B.2.b.), excepté que la concentration en Tween 20 est 2 fois plus importante (0,1 % [v/v]). La microplaque utilisée doit avoir de bonnes capacités d absorption (par exemple Nunc Maxisorp immunoplate). L homogénat de foie est resuspendu à 10 % (w/v) dans du PBS standard ; 50 µl est le volume standard à utiliser à chaque étape. Le tampon d ELISA utilisé pour toutes les étapes est du PBS avec 1 % d extrait de levure (ou l albumine sérique bovine [BSA]), et du Tween 20 0,1 %, ph 7,4. Toutes les étapes d incubation durent de 50 à 60 min à 37 C en agitation douce. Après toutes ces étapes, 3 lavages de 3 à 5 min doivent être réalisés en employant du PBS avec du Tween 20 0,1 %. Des homogénats de foie de lapin positif et négatif pour la RHD doivent être utilisés comme témoins. La peroxydase de raifort (HRPO) peut être couplée à des IgG purifiées d un sérum polyclonal ou à des AcMs (voir section B.2.b.). Les AcMs anti-rhdv ont été produits dans plusieurs laboratoires et peuvent être utilisés à la place de sérums polyclonaux. Plus récemment, des AcMs reconnaissant des épitopes spécifiques exprimés seulement par le variant RHDVa ont été également produits (Capucci, données personnelles). Pour mieux caractériser l antigénicité des isolats de RHD par un ELISA sandwich, il est envisageable de tester chaque échantillon 4 fois, et d utiliser 4 conjugués HRPO différents, par exemple 2 AcMs reconnaissant le même déterminant antigénique présent à la surface du virus et exprimé soit par la souche classique soit par le variant RHDVa, un sérum hyperimmun anti-rhdv polyclonal (qui pourrait identifier des «nouveaux variants potentiels» ou des virus apparentés, comme le EBHSV) et un pool d AcMs reconnaissant des épitopes internes qui peut détecter les particules s-rhdv lisses, dégradées telles que le EBHSV. Un ELISA de capture d antigène alternatif utilisant des anticorps anti-rhdv de moutons comme anticorps de capture et un AcM pour la détection du RHDV a été décrit (11). Protocole (exemple) Pour les étapes qui ne sont pas indiquées spécifiquement, voir la procédure du c-elisa pour la sérologie (section B.2.b.). i) Recouvrir la plaque avec un sérum hyperimmun anti-rhdv et un sérum RHDV négatif, le dernier servant de témoin vis-à-vis de réactions non spécifiques (échantillons faux positifs). Pour chaque échantillon, 4 puits doivent être sensibilisés avec le sérum positif et 4 puits avec le négatif. ii) Diluer l extrait de foie au 1/5 et au 1/30 (2 répliques pour chaque dilution) dans le tampon d ELISA (voir ci-dessus), directement dans les puits de la plaque (par exemple ajouter 45 µl du tampon dans tous les puits de la plaque, ajouter 10 µl de l échantillon dans les 2 premiers puits et ensuite, après basculement, transférer 9 µl dans le second puits). Traiter les témoins, aussi bien le positif que le négatif, de la même façon que les échantillons. iii) Après incubation et lavage (voir ci-dessus), incuber avec le conjugué HRPO. iv) Après une dernière série de lavages, ajouter le substrat chromogénique. L orthophénylènediamine (OPD) doit être utilisée comme substrat de la peroxydase pour le développement final de la réaction. Employer du tampon 0,15 M de citrate phosphate, ph 5,0, avec 0,5 mg/ml d OPD et 0,02 % de H 2 O 2. La réaction est arrêtée après 5 min par addition de 50 µl de H 2 SO 4 1 M. v) L absorbance est lue à 492 nm. Les échantillons positifs sont ceux montrant une différence > 3 dans l absorbance, entre les puits recouverts avec du sérum RHDV-positif et ceux recouverts avec du sérum négatif. Habituellement, à la dilution 1/30, les échantillons positifs récoltés de lapins présentant la forme classique aiguë de la RHD donnent une valeur d absorbance > 0,8, tandis que la valeur des échantillons négatifs, à la dilution 1/5, varie de 0,1 à 0,25. Pour le diagnostic de l EBHSV, il est possible d utiliser cet ELISA sandwich RHDV-spécifique, mais, du fait de la forte différence antigénique existant entre les 2 virus, il y a un risque d obtenir des résultats faux négatifs. De plus, l adoption d une technique d ELISA sandwich spécifique à l EBHSV utilisant autant un Manuel terrestre de l OIE

6 sérum de lièvre anti-ebhsv positif à haut titre, ou réagissant avec des AcMs RHDV (5, 8), ou des AcMs EBHSV spécifiques, à la place de sérum de lapin, est fortement recommandée (8). d) Immunomarquage Des tissus fixés dans du formol tamponné à 10 % et incorporés dans de la paraffine peuvent être immunomarqués en utilisant une méthode avec de la peroxydase à complexe avidine-biotine (ABC). Les coupes sont d abord déparaffinées dans du xylène et de l alcool, contre-marquées avec de l hématoxyline pendant 1 min et rincée avec de l eau du robinet. Elles sont ensuite mises dans un bain de méthanol contenant de l H 2 O 2 3 % et lavées avec du PBS, 3 fois, pendant 5 min à chaque lavage. Pour limiter le bruit de fond dû aux liaisons non spécifiques des anticorps, les échantillons sont incubés avec du sérum normal de lapin pendant 1 h à température ambiante avant addition de biotine. Les coupes sont incubées toute la nuit dans une chambre humide à température ambiante avec du sérum biotinylé anti-rhdv de lapin ou des AcMs, puis sont lavées comme décrit auparavant et incubées encore pendant 30 min à 37 C avec une peroxydase ABC. Les coupes sont ensuite lavées 3 fois. De l amino-éthyl-carbazole est utilisé comme substrat. Enfin, les coupes sont rincées à l eau du robinet et montées (25). Un intense marquage des noyaux et un marquage cytoplasmique diffus des cellules nécrotiques du foie, principalement dans les régions périportales, sont caractéristiques et spécifiques. Un marquage positif des macrophages et des cellules de Kupffer est aussi observé, tout comme des réactions hépatocellulaires. Des réactions positives sont aussi détectées dans les macrophages des poumons, de la rate et des nœuds lymphatiques, ainsi que dans les cellules rénales mésangiales (25). Des cryosections de tissus fixées dans du méthanol peuvent être directement immunomarquées par incubation pendant 1 h avec du sérum anti-rhdv de lapin conjugué à la fluorescéine ou des AcMs. De la fluorescence spécifique peu être détectée dans le foie, la rate et les glomérules rénaux. e) Épreuve Western Blot Lorsque les autres tests tels que l HA ou l ELISA donnent des résultats douteux (faible positivité) ou que les échantillons sont suspectés contenir des particules s-rhdv, l analyse par une épreuve de Western Blot est utile pour poser le diagnostic final. Les échantillons sont préparés comme décrit précédemment, et sont par la suite traités de manière à concentrer les particules virales (10 fois) par ultracentrifugation ( g pendant 90 min) à travers un coussin de sucrose à 20 % (w/w). Le surnageant ainsi que le culot peuvent être examinés pour détecter, respectivement, la sous-unité 6S du RHDV (5) et la protéine structurale VP60 dénaturée du RHDV ou un de ses fragments de protéolyse, dont la taille peut varier de 50 à 28 kda. Un échantillon témoin positif et un négatif devraient être systématiquement utilisés. Les protéines peuvent être mises en évidence avec des anticorps polyclonaux ou des AcMs. Si des AcMs sont utilisés, ils pourraient reconnaître des épitopes continus. Les AcMs spécifiques identifiant un épitope interne ou caché pourraient être également utilisés pour détecter l EBHSV. Un sérum hyperimmun anti-rhdv de lapin est moins efficace que des AcMs afin de reconnaître le même modèle de bande (6). Les protéines sont dénaturées durant 2 min à 100 C en présence de Tris 60 mm, ph 6,8, de sodium dodécyl sulfate (SDS) 2 %, de béta-mercapto-éthanol 2 %, et de glycérol 5 %, séparées sur du SDS/PAGE 10 % (gel d électrophorèse en polyacrylamide), et ensuite transférées par électroblotting à des membranes de nitrocellulose ou de PVDF (fluorure de polyvinylidène), dans du Tris 25 mm, de la glycine 192 mm ph 8,3 et du méthanol 20 % (v/v) à 1,5 A pendant 1 h avec refroidissement ou à 0,15 A toute la nuit. Après le transfert, les membranes sont saturées pendant 30 à 60 min avec de l albumine sérique bovine (BSA) 2 %, dissoute dans du tampon phosphate, ph 7,4, et incubées pendant 2 h à température ambiante avec le sérum approprié dilué dans du tampon phosphate, ph 7,4, et de la BSA 1 %. Les filtres sont lavés complètement avec du PBS et sont incubés pendant 1 h avec des immunoglobulines anti-espèce marquées à la phosphatase alcaline à une dilution prédéterminée par titrage. Finalement, les filtres sont encore lavés et le substrat chromogène (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate nitro blue tétrazolium) est ajouté. Les échantillons positifs et le témoin positif produiront un modèle identique à celui des protéines de poids moléculaire, respectivement de 60 kda (la protéine structurale simple de RHDV) ou 41 à 28 kda (le fragment de la VP60 associé à la transition de RHDV vers s-rhdv), lorsque l on examine le culot et 6 kda (sous-unité) lorsque l on examine le surnageant. L analyse par Western Blot peut aussi être utilisée pour identifier l EBHSV. Le protocole du test est identique. Le modèle de bandes protéiques, détectées en employant un sérum polyclonal anti-ebhsv ou 1050 Manuel terrestre de l OIE 2005

7 des AcMs anti-rhdv croisant, est similaire. Cependant, le pourcentage d échantillons montrant de la dégradation virale est plus grand et donc des fragments de poids moléculaire inférieur, provenant de la protéine structurale VP60, sont souvent observés. f) Méthodes de reconnaissance des acides nucléiques L application de la RT-PCR pour la détection d acides nucléiques RHDV-spécifiques a été décrite par plusieurs auteurs (14, 17). Cette méthode est appliquée sur des échantillons d organes, d urine, de fèces et de sérum en utilisant différentes amorces oligonucléotidiques dérivées de la région génomique codant la capside (région N-terminale). L ADNc obtenu de la réaction de RT est habituellement amplifié comme décrit par Baginski et al. (1). Pour révéler le produit de PCR, le milieu de réaction d amplification d ADN est chargé sur un gel d agarose pour électrophorèse. Si besoin, la spécificité du produit de PCR peut être déterminée par séquençage ou par transfert du gel d agarose à un filtre en nylon qui peut être finalement hybridé avec des sondes marquées plus internes, et examiné par autoradiographie. Une méthode similaire de RT-PCR a été utilisée pour identifier un RCV non pathogène (4). Plusieurs amorces, spécifiques pour le gène de la polymérase du RHDV et complémentaires à des gènes de la protéine VP60 et de l ORF2, sont utilisées et les fragments amplifiés sont analysables par Southern Blot. La RT-PCR semble être une méthode extrêmement sensible pour la détection du RHDV, et est 10 4 fois plus sensible que l ELISA (17). Elle n est pas strictement nécessaire pour le diagnostic de routine mais est plus appropriée pour les études d épidémiologie moléculaire, pour étudier les stades les plus précoces de l infection et la pathogénie du RHDV et pour détecter les virions chez les jeunes animaux (< 40 jours), chez des hôtes non spécifiques (autres vertébrés) et chez des vecteurs (moustiques et mouches). Une technique d hybridation in situ utilisant autant des sondes ADN sens et antisens a été développée pour rechercher la présence de RHDV dans des échantillons de tissus (13). Cette méthode est très sensible et peut être utilisée pour le diagnostic précoce de RHD puisqu il donne des résultats positifs dès 6 à 8 h après l infection. Cependant, elle est coûteuse et difficile à effectuer, et est donc principalement indiquée pour les études de recherche. 2. Épreuves sérologiques L infection par le RHDV peut être diagnostiquée par une détection de la réponse spécifique en anticorps. La réponse humorale ayant une grande importance dans la protection de l animal face à la RHD, la détermination du titre en anticorps spécifiques après vaccination ou chez les animaux convalescents est prédictive de la capacité d un lapin à résister à l infection par le RHDV. Des données épidémiologiques suggèrent l existence d une souche «apathogène» antigéniquement proche du RHDV. En fait, la présence d anticorps «naturellement acquis» qui confèrent une protection complète contre une infection par un RHDV virulent a été observée dans des colonies où aucune épizootie n avait été rapportée ou de vaccination réalisée (24). L existence de calicivirus non pathogènes fournit une explication probable aux anomalies précoces trouvées au cours d études sérologiques chez les populations de lapins dans les pays européens aussi bien qu en Australie et en Nouvelle-Zélande. Trois techniques de base sont appliquées pour le diagnostic sérologique du RHDV : l inhibition d hémagglutination (IH) (19), l ELISA indirect (I-ELISA) et le c-elisa (8). Chacune de ces méthodes a des avantages et des inconvénients. En tenant compte de la disponibilité en réactifs et de la complexité technique pour effectuer ces tests, l IH est la méthode la plus commode, suivie par le I-ELISA et le c-elisa, respectivement. D un autre coté, les 2 ELISA sont plus rapides et plus faciles que l HI, particulièrement lorsqu un grand nombre d échantillons sont testés. La spécificité du c-elisa est nettement plus grande que celle atteinte avec les 2 autres méthodes (8). Pour une meilleure interprétation sérologique et un meilleur classement du statut immunologique des lapins, une combinaison de techniques ELISA distinguant les réponses en anticorps IgA, IgM, et IgG est également disponible. Une méthode alternative c-elisa a été décrite (10). a) Inhibition de l hémagglutination Antigène : l antigène est préparé en utilisant des foies de lapins infectés prélevés rapidement après leur mort. Le foie est homogénéisé dans du PBS 10 % (w/v), ph 6,4, et clarifié par 2 centrifugations consécutives à faible vitesse (500 g pendant 20 min et g pendant 30 min). Le surnageant, prélevé des tubes de telle sorte à éviter la couche superficielle des lipides, est filtré à travers une membrane à pores de 0,22 µm, titré par HA, et enfin réparti en aliquots, qui sont stockés à 70 C. Échantillons de sérum : avant d être testés, les sérums sont inactivés par incubation à 56 C pendant 30 min. Les sérums sont ensuite traités avec du kaolin 25 % (dilution finale du sérum : 1/10) à 25 C pendant 20 min et centrifugés. Ceci est suivi par un second traitement au kaolin, également à 25 C pendant 20 min, cette fois avec un volume de 1/10 de GR humains de groupe O agglutinés à 50 %. Ceux-ci sont collectés frais, gardés toute une nuit dans de la solution d Alsever et lavés dans du PBS 0,85 %, ph 6,5. Les sérums sont clarifiés par centrifugation. Manuel terrestre de l OIE

8 Protocole i) Placer 50 µl de sérum dans le premier puits d une plaque de microtitrage et faire des dilutions doubles dans les puits 2 à 8 en utilisant du PBS et de la BSA 0,05 %. ii) iii) iv) Ajouter 25 µl d antigène RHDV contenant 8 unités HA à chaque puits et incuber la plaque à 25 C pendant 30 à 60 min. Ajouter 25 µl de globules rouges de groupe O à une concentration de 2 à 3 % à chaque puits et laisser reposer à 25 C pendant 30 à 60 min. Titrer l antigène avec chaque test pour vérifier que 8 HA/25 µl ont été utilisés et inclure des sérums témoins positif et négatif. Le titre du sérum est la dernière dilution montrant une inhibition de HA. Le seuil positif des titres sériques est corrélé au titre des sérums témoins négatifs ; cela varie habituellement de 1/20 à 1/80. En raison de la difficulté pratique d obtenir et de conserver des globules rouges humains de groupe O et le risque de travailler avec ceux-ci et du fait de la difficulté d obtenir des résultats confirmés, ce test tend à être remplacé par un ELISA. b) ELISA de compétition Antigène : une souche standard internationale n est pas encore disponible ; néanmoins, comme un seul sérotype a été identifié jusqu ici à travers le monde, des résultats fiables peuvent être obtenus par différents laboratoires utilisant chacun son propre virus standard. Même les anticorps induits par les variants identifiés de RHDV sont reconnus par la méthode standard décrite ici. De plus, le test peut aussi facilement détecter les anticorps venant d une infection de lapins avec le RCV non pathogène, du fait de sa haute corrélation génétique avec le RHDV (6, 7). L antigène peut être préparé comme décrit auparavant pour l IH (section B.2.a.), en prenant comme précaution de le conserver à 20 C dans du glycérol à 50 % (v/v) pour éviter le gel. Si nécessaire, le virus peut être inactivé avant l addition de glycérol, en utilisant de l éthylènimine binaire (BEI) à 33 C pendant 24 h. L antigène peut être prétitré par ELISA et après être utilisé comme agent limitant : par exemple la dilution correspondant 60 à 70 % de la taille plateau (valeur d absorbance à 492 nm dans la gamme 1,1 1,3). Sérum anti-rhdv : des sérums spécifiques polyclonaux ayant de hauts titres anti-rhdv peuvent être obtenus de différentes manières. 2 voies actuellement utilisées sont décrites ci-dessous : i) des lapins sont infectés avec un extrait à 10 % de foie RHDV-positif dilué au 1/100 dans du PBS pour obtenir des sérums de convalescence (21 à 25 jours) contenant un haut niveau d IgG anti-rhdv. Comme le taux de mortalité lié au RHDV est haut, il est nécessaire d infecter au moins 10 à 15 lapins séronégatifs ou d infecter des lapins qui ne sont que partiellement protégés (par exemple 4 à 8 lapins infectés dans les 3 à 7 jours post-vaccination. Une prise de sang doit être réalisée sur les lapins qui survivent à l infection 21 à 25 jours post-infection et une autre 10 à 15 jours plus tard pour obtenir des sérums hyperimmuns contre le RHDV. ii) le RHDV est purifié à partir des foies des lapins infectés expérimentalement qui meurent d une forme aiguë de la maladie (entre 28 et 40 h après l infection), en utilisant une des méthodes qui ont été publiées (5, 8, 9, 20, 22). Après, le RHDV purifié peut être utilisé pour immuniser des moutons ou des chèvres en accord avec des protocoles classiques utilisant un adjuvant huileux. La même procédure peut aussi être utilisée pour inoculer des lapins si le virus purifié est inactivé avant l inoculation. Les AcMs anti-rhdv pourraient être utilisés à la place du sérum polyclonal. La purification d IgG de lapin et leur conjugaison à l HRPO peuvent être réalisées suivant les protocoles standards. L anticorps conjugué est titré par un ELISA sandwich en présence ou en absence d antigène de RHDV (foie de lapin négatif). Il est ensuite utilisé à la plus haute dilution montrant un maximum (haut plateau) d absorbance (si le sérum avait un bon titre anti-rhdv, la valeur du conjugué HRPO devrait se situer entre 1/1 000 et 1/3 000). Sérums témoins : le sérum négatif est prélevé sur lapins entièrement sensibles à l infection par le RHDV. Le sérum positif est soit un sérum convalescent dilué au 1/100 dans un sérum négatif ou un sérum récolté sur un animal vacciné Manuel terrestre de l OIE 2005

9 Protocole (exemple) i) Le sérum de lapin anti-rhdv dilué à un titre prédéterminé, par exemple 1/5 000 dans du tampon carbonate/bicarbonate 0,1 M, ph 9,6, est adsorbé sur une microplaque ELISA de haute capacité d adsorption (par exemple une immunoplaque Nunc Maxisorb) à 4 C toute une nuit ; ii) Laver la plaque 3 fois pendant 3 à 5 min chaque fois dans du PBS ph 7,4, avec du Tween 80 à 0,05 % (PBST). Lorsque les plaques ne sont pas utilisées immédiatement, elles peuvent être conservées, fermées dans un sac en plastique, pendant au moins 3 mois à 20 C ; iii) Distribuer 25 µl de PBST avec 1 % d extrait de levure (PBSTY) ou 1 % de BSA (PBST-BSA) dans chaque puits nécessaire de la plaque (voir ci-dessous). Ajouter 7 µl du premier échantillon de sérum aux 2 premiers puits (A1 et B1), 7 µl du second sérum aux 2 seconds puits (C1 et D1), et continuer avec le 3 e (E1 et F1) et le 4 e (G1 et H1) sérum, et compléter ainsi la première colonne. Si des données qualitatives sont nécessaires (positives /négatives), répéter l opération dans la seconde colonne avec les échantillons de sérum de 5 à 8, et dans la 3 e colonne avec les échantillons de 9 à 12, et ainsi de suite. Si le titre du sérum nécessite d être déterminé, ce sérum peut être dilué par la suite. Agiter la plaque, et utiliser une micropipette à 8 voies pour transférer 7 µl des puits de la colonne 1 vers les puits de la colonne 2. Cela correspond à une dilution 4 fois du sérum. Cette dernière opération peut être répétée 1 fois (titre 1/160), 2 fois (titre 1/640) ; ou 4 fois (titre 1/10,240). Même dans le cas de testage de sérum pour des données qualitatives (une seule dilution), ou pour obtenir un titre final (plusieurs dilutions), compléter les 12 puits restants libres de chaque plaque avec les sérums témoins. Ajouter 7 µl de sérums positifs aux puits G6 et H6, et 7 µl de sérums négatifs aux puits G9 et H9, ensuite les diluer 1 ou 2 fois (1/40 à 1/160) ; iv) Ajouter 25 µl par puits d antigène suspendu dans du PBSTY à tous les puits de la plaque, à une dilution double de la dilution décidée, comme décrit dans la section «antigène» (voir la première partie de la description de la méthode ELISA) ; v) Incuber la plaque à 37 C sur une plateforme oscillante pendant 50 min ; vi) Laver la plaque comme décrit dans l étape ii) ; vii) Ajouter 50 µl par puits d IgG anti-rhdv de lapins conjugués avec l'hrpo à la dilution décidée, comme décrit ci-dessus dans la section «sérum anti-rhdv» (voir la première partie de la description de ce test ELISA) ; viii) Incuber la plaque à 37 C sur une plateforme oscillante pendant 50 min, et laver comme décrit à l étape ii) en ajoutant un quatrième lavage de 3 min ; ix) Utiliser 50 µl par puits d OPD comme donneur d hydrogène dans les conditions suivantes : 0,5 mg/ml d OPD dans 0,1 M de tampon phosphate/citrate, ph 5, et 0,02 % de H 2 O 2. Arrêter la réaction après 5 min par addition de 50 µl par puits de H 2 SO 4 1 M ; x) Lire la plaque avec un spectrophotomètre en utilisant un filtre de 492 nm. Le titre du sérum correspond à la dilution donnant une valeur d absorbance égale à 50 % (±10) de la valeur pour le sérum négatif à la dilution 1/160 (valeur de référence). Le sérum est considéré comme négatif lorsque la valeur d absorbance de la première dilution (1/10) diminue d au moins 20 % par rapport à la valeur de référence, tandis qu il est considéré positif lorsque la valeur d absorbance diminue d au moins 30 % ou plus. Lorsque la valeur d absorbance de la dilution 1/10 diminue entre 20 % et 30 % de la valeur de référence, le sérum est considéré comme douteux. Un large éventail de titres peut être détecté, et ceci selon la provenance de l échantillon. Les sérums positifs varient de 1/640 à 1/(10,240) chez les lapins convalescents, de 1/80 à 1/640 chez les lapins vaccinés et de 1/10 à 1/160 en cas d infection non pathogène. La connaissance de l origine des échantillons laisse le choix de réaliser le test sur une ou plusieurs dilutions. Tester seulement la première dilution donne un résultat positif ou négatif. Le titre est établi en testant toutes les dilutions, jusqu à la sixième. En raison des différences antigéniques significatives existant entre le RHDV et le EBHSV (8, 27), les techniques sérologiques décrites ci-dessus, qui utilisent le RHDV comme antigène, ne sont pas recommandées pour le diagnostic sérologique de l EBHS. Malgré cela, une méthode ELISA directe pourrait être employée pour la détection des sérums de lièvres positifs et négatifs pour l EBHSV ; en fait, l adsorption du RHDV dans la phase solide d une plaque d ELISA expose à des réactions antigéniques croisées. Alternativement, un c-elisa spécifique pour l EBHSV peut être développé de manière similaire, en utilisant des réactifs spécifiques (antigènes et antisérums) préparés comme décrit ci-dessus pour le RHDV. c) ELISA d isotypes (iso-elisas) Ces ELISAs permettent la détection et le titrage des isotypes IgA, IgM et IgG (7). Le titre des isotypes est critique pour l interprétation en sérologie de terrain dans 4 domaines courants : les anticorps croisants, la Manuel terrestre de l OIE

10 résistance des jeunes lapins, les anticorps maternels, les anticorps chez des lapins précédemment infectés (12). Pour détecter les IgG RHDV-spécifiques, un AcM RHDV-spécifique est adsorbé sur une plaque Maxisorp à une concentration de 2 µg/ml par une méthode décrite plus haut pour le sérum polyclonal dans le c-elisa (voir section B.2.b., étape de procédure de test i). Le virus est ajouté aux plaques à une concentration double de celle utilisée dans le c-elisa et après incubation et lavage, les sérums sont ajoutés et dilués en série 4 fois en partant de la dilution 1/40. Un AcM IgG anti-lapin conjugué HRPO est utilisé pour détecter des IgG liées au virus. L étape finale pour les iso-elisas pour IgG, IgM et IgA est l addition d OPD et de H 2 SO 4 comme pour le c-elisa. Pour détecter les isotypes IgM et IgA, les phases de la réaction de l ELISA sont inversées de façon à éviter la compétition avec les IgG, qui est habituellement l isotype prédominant. L AcM IgG anti-lapin ou l IgA anti-lapin est adsorbé aux puits et ensuite les sérums sont dilués comme décrit plus haut. L incubation avec l antigène suit et l AcM HRPO-conjugué est ensuite utilisé pour détecter le RHDV lié aux plaques. Les sérums sont considérés être positifs si la valeur d OD 492 (densité optique) à la dilution 1/40 est plus importante de 0,2 unités de DO (2 déviations standard) que la valeur du sérum témoin négatif. Le titre de chaque sérum est pris comme la dernière dilution donnant une valeur positive. Etant donné que les tests iso-elisa ne suivent pas une méthodologie identique, des titres équivalents n impliquent pas que les isotypes soient présents en quantités identiques. C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Dans tous les pays où la RHD est enzootique, le contrôle indirect de la maladie est réalisé par la vaccination en employant le type approprié de vaccin un vaccin qui est préparé à partir d une suspension clarifiée de foie de lapins expérimentalement infectés, et qui est par la suite inactivée et adjuvée. Les méthodes d inactivation (formol, béta-proprionolactone et autres substances) et les adjuvants utilisés (huile minérale incomplète ou hydroxyde d aluminium), peuvent varier suivant le protocole utilisé par les différents producteurs. Dans les 10 dernières années, plusieurs études ont été effectuées pour faire exprimer la protéine de capside du RHDV par Escherichia coli, par le virus de la vaccine, et par un virus de la myxomatose atténué (MV). Malgré cela, il a été démontré par différents auteurs qu une protéine de capside recombinante, VP60, exprimée dans le système d expression baculovirus/cellules Sf9, s assemblait avec d autres pour former des virus-like particles (VLPs) qui sont structurellement et antigéniquement identiques aux virions de la RHD. Alors que la protéine de fusion exprimée en E. coli est hautement insoluble et faiblement immunogène, une immunisation active peut être réalisée avec des VLPs obtenues dans le système baculovirus en utilisant un vaccin recombinant, le MV et un canarypox, administré soit par voie orale soit par voie intramusculaire. En particulier, des lapins vaccinés avec un MV recombinant exprimant la protéine de capside du RHDV ont été protégés contre la maladie hémorragique mortelle et des épreuves virulentes avec le MV. Le virus recombinant résultant était aussi capable de se propager par voie horizontale et d induire une protection en cas de contact des animaux, et donc de fournir une opportunité de protéger une population de lapins sauvages (26). Pareillement, l immunogénicité de VLPs administrées oralement comme alternative à l immunisation parentérale offre une voie économique et pratique pour administrer un vaccin pour l immunisation de masse d animaux sauvages. Plus récemment, la protéine structurale VP60 a été exprimée en plante transgénique, soit avec un nouveau vecteur basé sur le poxvirus de la prune (PPV-NK), soit par des plantes de pommes de terre sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ou d un promoteur 35S modifié. Dans les 2 cas, l immunisation de lapins avec des extraits de plantes de Nicotiana clavelandii infectées avec des chimères PPV-NK VP60 ainsi qu avec des extraits de feuilles de pommes de terre portant ce promoteur 35S modifié, respectivement, induisait une réponse immune efficace qui protégeait les animaux contre une épreuve létale avec le RHDV. Cependant, à l heure actuelle, des vaccins recombinants ne sont pas encore enregistrés ni disponibles dans le commerce. En France, un vaccin (Dercunimix, Mérial) a récemment été enregistré et commercialisé, celui-ci est une combinaison d un vaccin traditionnel de RHD inactivé dérivé de foie et un vaccin de virus de la myxomatose vivant atténué. Le programme habituel est d administrer le virus inactivé 2 fois à intervalle de minimum 2 semaines. Normalement, une dose de 1 ml est inoculée par voie sous-cutanée dans la région du cou. Dans les unités sans antécédent de maladie, où l anamnèse pour la RHD est négative, il est envisageable de ne vacciner que les individus destinés à la reproduction ; la première injection est faite vers 2 à 3 mois. Une revaccination annuelle est fortement recommandée pour assurer un bon niveau de protection, même si des données expérimentales indiquent que la protection perdure habituellement assez longtemps (plus de 1 an). La vaccination des animaux 1054 Manuel terrestre de l OIE 2005

11 de boucherie n est pas nécessaire si la maladie ne s est pas produite dans l élevage. Après une épizootie de RHD, même si une hygiène stricte et des mesures sanitaires, incluant le lavage et la désinfection, un traitement sûr les carcasses et un vide sanitaire, ont été adoptées, il est fortement recommandé de vacciner les animaux de boucherie à l âge de 40 jours, parce que l incidence de réinfection est très forte. Il est seulement envisageable d arrêter la vaccination des animaux de boucherie après plusieurs cycles de production. De façon à vérifier la persistance de RHD contagieuse à l intérieur de l unité, un nombre variable de lapins, en commençant avec un petit groupe d animaux sentinelles, pourraient ne pas être vaccinés. Les animaux vaccinés produisent rapidement une forte immunité contre l infection par le RHDV, la vaccination est donc considérée efficace pour protéger des lapins non-exposés et elle sera utilisée en premier lieu dans les élevages de lapins après qu une épizootie de la maladie ait été diagnostiquée ; une fois que la RHD a été confirmée chez des lapins malades ou morts, les animaux restant en bonne santé sont immédiatement vaccinés. L administration de sérum immun est aussi efficace pour produire une protection rapide, de courte durée, contre l infection par le RHDV. Les vaccins devraient être stockés entre 2 et 8 C et ne devraient pas être congelés, ni exposés à la lumière du jour ni à de hautes températures. 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Le lot de semence pour la production de vaccins inactivés sur tissus est constitué d homogénats de foies infectés obtenus par passages successifs chez des lapins qui ont été inoculés avec une suspension virale de RHD partiellement purifiée. Le dernier est obtenu en centrifugeant à g pendant 20 min à 4 C une suspension 1/5 de foie (v/v) dans du PBS. Le surnageant qui en résulte est traité toute une nuit à 4 C avec du polyéthylène glycol (PEG 6000) à 8 % (v/v). Le culot est resuspendu à une dilution 1/10 dans du PBS, et ensuite centrifugé à g pendant 2 h à 4 C à travers un coussin à 20 % de sucrose. Le culot est resuspendu dans du PBS (1/100 du volume de départ). Cette suspension virale est ensuite caractérisée par examen au microscope électronique en coloration négative, par détermination de sa réactivité en ELISA, et de sa capacité d HA à température ambiante en élution lente (le titre HA vis-à-vis de globules rouges humains du groupe O est supérieur à 1/1 280). Le lot de semence est titré avant usage et devrait contenir au moins 10 5 DL 50. Il devrait être conservé au congélateur ( 70 C) ou lyophilisé. b) Méthode de culture À l heure actuelle, la réplication du RHDV ne peut être obtenue que chez des animaux sensibles. Les lapins utilisés pour l inoculation sont sélectionnés à partir de lignées réputées sensibles à la maladie par le biais de dosages sérologiques périodiques. Les animaux (âgés d au moins 4 mois) doivent être maintenus en quarantaine stricte dès leur arrivée, dans une aire séparée et être élevés dans des conditions de santé satisfaisantes (voir la partie consacrée aux animaux de laboratoire dans le Chapitre I.1.6., «La biosécurité au laboratoire de microbiologie vétérinaire»). La propagation de la semence et la production de groupes vaccinés relèvent du même protocole que l infection expérimentale, incluant une injection intramusculaire d une dose d au moins 100 DL 50. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale Le lot de semence utilisé pour la production du vaccin doit être exempt de toute contamination par d autres virus, bactéries, mycoplasmes et champignons. Le lot de semence est contrôlé par inoculation directe à des lapins sensibles suivie d une évaluation des signes cliniques au cours de l infection expérimentale. Un lot de semence souhaitable devrait causer la mort chez 70 à 80 % des lapins dans les 24 à 72 h suivant l inoculation, avec les lésions caractéristiques de RHD dans les organes internes. Pour valider le test, un examen rapide et histopathologique de tous les lapins devrait être réalisé dans le but d exclure toute maladie intercurrente. 2. Méthode de fabrication Suivant l inoculation de lapins sensibles, le foie et la rate des lapins morts dans les 24 à 72 h après inoculation sont récoltés. Les organes sont hachés dans 1/10 (w/v) de PBS stérile, ph 7,2 à 7,4, et le mélange est homogénéisé pendant 10 min dans un mélangeur en environnement réfrigéré. Le mélange est ensuite traité avec du chloroforme 2 % (18 h à 4 C), suivi d une centrifugation à g pendant 1 h à 4 C. Le surnageant est récolté par pompage continu à haute pression et est plus tard inactivé. La suspension virale est analysée par le test d HA et par ELISA (voir section C.3.) et, une fois que le nombre d unités HA provenant du titrage initial est connu, du PBS stérile supplémentaire est ajouté en volume suffisant de façon à fournir, après inactivation et adsorption avec un adjuvant, une concentration de 640 à HA unités/dose dans le produit commercial. Manuel terrestre de l OIE

12 Différents agents se sont révélés efficaces pour supprimer l infectivité virale. Les plus fréquemment utilisés sont le formol et la béta-proprionolactone, qui sont employés à différentes concentrations et différentes températures, pendant des périodes variables et en combinaison. Durant l inactivation, il est envisageable d agiter le fluide en continu. L hydroxyde d aluminium, l adjuvant incomplet de Freund ou une autre émulsion huileuse est ensuite incorporé dans le vaccin comme adjuvant. Un agent de conservation, le thiomersal (merthiolate), est finalement ajouté à la dilution de 1/ (v/v) avant la répartition dans les fioles. 3. Contrôles en cours de fabrication Contenu en antigène : le titre du virus de la RHD est déterminé avant inactivation par calcul du titre HA, qui doit être supérieur à 1/1280, et par la réactivité en ELISA. Les 2 valeurs sont ensuite déterminées une nouvelle fois après inactivation et adsorption avec l adjuvant. L EM par coloration négative confirme l identité du RHDV. Stérilité : les organes sont testés pour l absence de bactéries viables, de virus, de champignons ou de mycoplasmes par le même protocole que pour le virus souche. La solution de PBS et le gel d hydroxyde d aluminium sont stérilisés par autoclavage, l émulsion huileuse est stérilisée par chauffage à 160 C pendant 1 h. Inactivation : avant l incorporation de l adjuvant, il faut prouver que l agent inactivant et le processus d inactivation inactivent le virus selon les conditions de fabrication. Ainsi, un test est pratiqué sur chaque étape aussi bien que sur le produit final. 5 lapins sont inoculés avec une dose de 2 ml de la suspension et 5 lapins non vaccinés sont gardés comme contrôles. Après 10 jours, une inactivation adéquate et l absence d effets secondaires sont démontrées par l absence de signes cliniques et par des gains de poids similaires dans les 2 groupes. À la fin des épreuves, les animaux sont sacrifiés et des extraits de foie sont testés par HA, ELISA et EM. 4. Contrôles de lots Des tests de stérilité, de sûreté et d activité devraient être réalisés sur chaque série de vaccin ; des tests de durée d immunité devraient aussi être effectués lorsqu on utilise une série type de vaccins, et des test de stabilité devraient être effectués sur 3 séries. a) Stérilité Chaque lot de vaccin doit être testé pour l absence de bactéries viables, de virus, de champignons ou de mycoplasmes en accord avec le même protocole que celui recommandé pour tester le lot de semence. b) Innocuité Dix lapins sont inoculés par la voie recommandée avec 3 fois la dose vaccinale. Les lapins sont observés pendant 3 semaines. Des réactions locales ou générales anormales ne doivent pas se développer. c) Activité Dix adultes séronégatifs âgés d au moins 4 mois sont vaccinés avec une dose complète du vaccin administrée par la voie recommandée. 2 autres groupes de 5 animaux chacun sont vaccinés avec 1/4 et 1/16 de la dose complète, respectivement. Un quatrième groupe de 10 lapins non vaccinés est maintenu comme témoin. Tous les animaux sont éprouvés à 4 semaines après vaccination par inoculation intramusculaire d une dose de RHDV contenant au moins 100 DL 50 ou présentant un titre HA supérieur à 1/ Aucun lapin vacciné ne devrait montrer de signes d infection, tandis que le taux de mortalité parmi les animaux témoins devrait être supérieur à 70 %. La réponse en anticorps de chaque animal vacciné est ensuite déterminée en référence avec les antisérums standards titrés ; le niveau moyen en anticorps ne devrait pas être significativement inférieur au niveau enregistré dans le test de protection effectué en utilisant comme vaccin le lot de semence inactivée. d) Durée d immunité Les données reportées dans la littérature indiquent une durée d immunité à long terme induite par une seule vaccination (supérieure à 15 mois). Malgré cela, il est envisageable de pratiquer le test suivant : 20 lapins vaccinés 1 fois sont répartis en 4 groupes et sont testés sérologiquement à intervalle de 1 mois sur une période de 1 an. Chaque groupe est inoculé avec un RHDV virulent à 3, 6, 9 mois ou 1 an après vaccination (voir section C.4.c.). L épreuve virulente devrait produire une augmentation de la séroconversion, qui est directement reliée au temps qui s est écoulé depuis la vaccination. L absence de signes cliniques et de mortalité prouve que le RHDV ne s est pas multiplié. e) Stabilité Il faut démontrer que le vaccin passe le test d activité de lots 3 mois au-delà de sa durée de conservation Manuel terrestre de l OIE 2005

13 f) Agents de conservation Un agent de conservation est normalement requis pour un vaccin dans des flacons multidoses (voir Section C.2.). Sa persistance durant la durée de conservation devrait être vérifiée. g) Précautions d'emploi et mise en garde Lorsque des vaccins en suspension huileuse sont préparés, les personnes pratiquant la vaccination devraient être averties des risques et des conséquences d une auto-injection, qui doit être traitée en urgence comme une blessure par pistolet graisseur. 5. Contrôles du produit fini Les tests d innocuité, d efficacité et de stérilité du produit final doivent être réalisés après la mise en flacon et l empaquetage. Ainsi, il est important que ces 2 dernières étapes de fabrication soient réalisées selon de bonnes procédures standardisées. Les tests sont conduits en prélevant des échantillons d un nombre statistiquement déterminé de flacons multidoses du vaccin pris au hasard (20 ou 100 doses). a) Innocuité Voir Section C.4.b. b) Activité Voir Section C.4.c. c) Stérilité Voir Section C.4.a. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. BAGINSKI I., CHEMIN I., BOUFFARD P., HANTZ O. & TREPO C. (1991). Detection of polyadenilated RNA in hepatitis B virus infected peripheral blood mononuclear cells by polymerase chain reaction. J. Infect. Dis., 161, BARBIERI I., LAVAZZA A., BROCCHI E., KONIG M. & CAPUCCI L. (1997). Morphological, structural and antigenic modifications of rabbit haemorrhagic disease virus in the course of the disease. Proceedings of the 1st Symposium on Calicivirus of the European Society of Veterinary Virology (ESVV), Reading, UK, September 1996, CAPUCCI L., CHASEY D., LAVAZZA A. & WESTCOTT D. (1996). Preliminary characterisation of a nonhaemaggiutinating strain of rabbit haemorrhagic disease virus from the United Kingdom. J. Vet. Med. [B], 43, CAPUCCI L., FALLACARA F., GRAZIOLI S., LAVAZZA A., PACCIARINI M.L. & BROCCHI E. (1998). A further step in the evolution of rabbit hemorrhagic disease virus: the appearance of the first consistent antigenic variant. Virus Res., 58, CAPUCCI L., FRIGOLI G., RONSHOLT L., LAVAZZA A., BROCCHI E. & ROSSI C. (1995). Antigenicity of the rabbit hemorrhagic disease virus studied by its reactivity with monoclonal antibodies. Virus Res., 37, CAPUCCI L., FUSI P., LAVAZZA A., PACCIARINI M.L. & ROSSI C. (1996). Detection and preliminary characterization of a new rabbit calicivirus related to rabbit hemorrhagic disease virus but nonpathogenic. J. Virol., 70, CAPUCCI L., NARDIN A. & LAVAZZA A. (1997). Seroconversion in an industrial unit of rabbits infected with a nonpathogenic rabbit haemorrhagic disease-like virus. Vet. Rec., 140, CAPUCCI L., SCICLUNA M.T. & LAVAZZA A. (1991). Diagnosis of viral haemorrhagic disease of rabbits and European brown hare syndrome. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 10, CAPUCCI L., SCICLUNA M.T., LAVAZZA A. & BROCCHI E. (1990). Purificazione e caratterizzazione dell agente eziologico della malattia emorragica virale del coniglio. Sel. Vet., 31, COLLINS B.J., WHITE J.R., LENGUAS C., BOYD V. & WESTBURY H.A. (1995). A competition ELISA for the detection of antibodies to rabbit haemorrhagic disease virus. Vet. Microbiol., 43, Manuel terrestre de l OIE

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