RECOMMANDATIONS TECHNIQUES DETAILLEES POUR LA REALISATION DU FIBROTEST ET DU FIBROMAX

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1 ANNEXE 1 RECOMMANDATIONS TECHNIQUES DETAILLEES POUR LA REALISATION DU FIBROTEST ET DU FIBROMAX FibroTest et ActiTest permettent d évaluer respectivement l étendue de la fibrose et l importance de l activité nécroticoinflammatoire du foie. Actuellement, ils sont considérés comme une alternative à la biopsie hépatique chez les patients atteints d hépatite C chronique (1)(2). Le FibroTest et l ActiTest sont calculés à partir des résultats des dosages de six paramètres biochimiques. Les algorithmes de calcul, établis et validés au cours de diverses études cliniques, sont aujourd hui brevetés. Les dosages des paramètres du FibroTest et de l ActiTest ont été réalisés selon des méthodes analytiques standardisées par rapport aux méthodes de références et/ou étalons de référence. Le FibroMAX associe en plus du FibroTest, le SteatoTest et selon les facteurs de risque : - l ActiTest pour les patients atteints d hépatites virales chroniques C et B, - le NashTest pour les patients atteints de stéatose métabolique (surpoids, diabète, hyperlipidémie) - et l AshTest pour les patients atteints de stéatose inflammatoire alcoolique (hépatique alcoolique aigüe). Les biologistes des laboratoires d analyses médicales souhaitant calculer des FibroTests et/ou des FibroMAX à partir des résultats biologiques dont ils disposent, sont tenus de prendre connaissance des conditions à respecter pour la réalisation des différentes analyses: précautions liées au prélèvement lui même, méthodes d analyses, calibration, critères de fiabilité des dosages. Les recommandations analytiques sont décrites dans ce document. Les différentes analyses biologiques Le FibroTest associe 5 paramètres biochimiques - alpha2-macroglobuline - haptoglobine - apolipoprotéine A1 - GGT (gamma glutamyltranspeptidase) - bilirubine totale L ActiTest associe les mêmes paramètres plus l ALAT (alanine aminotransférase). Si l ActiTest n est pas prescrit, la valeur par défaut à saisir pour l ALAT est Les résultats des dosages sont ajustés en fonction de l âge et du sexe et permettent le calcul du FibroTest et de l ActiTest (1)(2). 1/17

2 Le FibroMAX associe les paramètres du FibroTest et de l ActiTest plus 4 paramètres supplémentaires : - ASAT, - Cholestérol, - Triglycérides, - Glycémie à jeun. Les résultats des dosages sont ajustés en fonction de l âge, du sexe, du poids et de la taille et permettent le calcul du FibroMAX. 2/17

3 A - ETAPE PRE-ANALYTIQUE : CONDITIONS A RESPECTER Milieu biologique, modalité de recueil Les analyses sont réalisées sur sérum ou plasma. Le sang est recueilli chez un patient de préférence à jeun, sur un tube sec de 5 ou 7 ml. L échantillon sanguin est centrifugé dans les 2 heures suivant le prélèvement. Les conditions de centrifugation, vitesse et durée, doivent être conformes aux recommandations du fournisseur des tubes de prélèvements. Conditions de conservation et de transport, prétraitement avant analyse Les dosages des 6 paramètres biochimiques se font de préférence sur le sérum frais ou décanté et conservé 72 heures au maximum à +2 C / +8 C, à l abri de la lumière (protection de la bilirubine). Le dosage des protéines spécifiques (alpha2-macroglobuline, haptoglobine, et apolipoprotéine A1) peut être réalisé sur le sérum conservé à +2 C /+8 C pendant 5 jours. Dans le cas ou les paramètres ne pourraient être dosés dans le délai requis le sérum doit être congelé d emblée à -80 C. Les prélèvements congelés ne doivent pas être décongelés plus d une fois. Après décongélation à la température du laboratoire, les sérums doivent être centrifugés 10 minutes à 1500g. Interférences La lipémie et l hémolyse interfèrent sur les dosages. Il est toujours possible de diluer les sérums déjà centrifugés et légèrement lipémiques selon les conditions des méthodes standardisées. Tout sérum lactescent et/ou hémolysé doit être rejeté. 3/17

4 B - METHODES ANALYTIQUES UTILISEES POUR LES DOSAGES DU FIBROTEST ET DE L ACTITEST (1)(2) Les performances des méthodes de dosage des paramètres du FibroTest et de l ActiTest ont été vérifiées sur les automates et dans les conditions ci dessous listées. Elles garantissent la qualité des résultats FibroTest. Dosages des protéines spécifiques Méthodes immunonéphélémétriques : Dosages de l alpha2-macroglobuline, de l haptoglobine, de l apolipoprotéine A1 Automates BN2 et BNProspec (Société Dade Behring). Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne Dade Behring et contrôle de qualité externe. Automate Immage (Société Beckman Coulter) [voir Remarque C]. Nouvel antisérum du fournisseur pour l alpha2-macroglobuline et ajustement spécifique [voir Remarque C] pour le résultat d apolipoprotéine A1. Contrôle de qualité interne et externe. Méthodes immunoturbidimétriques : Dosages de l alpha2-macroglobuline Automates Modular et Integra (Société Roche ). Réactifs Diagam [voir Remarque D] ou réactifs Dako Cytomation (Elitech France) avec ajustement spécifique [voir Remarque B] pour les résultats de l alpha2-macroglobuline. Automates AU400, AU600, AU640 et AU 2700 (Société Olympus). Réactifs Dako Cytomation (Elitech France). Automates Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime (Société Thermo Fisher Scientific). Réactifs Diagam [voir Remarque D] ou réactifs Dako Cytomation (Elitech France). Automates T20, T20XT, T30, T60 Nouvelle Génération (Société ). Réactifs Diagam [voir Remarque D] ou réactifs Dako Cytomation (Elitech France). Automate Architect c8000 (Société Abbott). Réactifs Diagam. [voir Remarque D]. Automate Advia (Société ). Réactifs Diagam [voir Remarque D] ou réactifs Dako Cytomation (Elitech France). Dosages de l haptoglobine et de l apolipoprotéinea1 Automates Integra 400 et Modular (Société Roche ). Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne Roche Diagnostic et contrôle de qualité externe. Automates RxL et ArX (Société Dade Behring) [voir Remarque A]. Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne Dade Behring et contrôle de qualité externe. Automates AU400, AU600, AU640 et AU 2700 (Société Olympus) [voir Remarque E]. Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne Olympus et contrôle de qualité externe. Automates Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime (Société Thermo Fisher Scientific). Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne Thermo Fisher Scientifc et contrôle de qualité externe. 4/17

5 Automates T20, T20XT, T30, T60 Nouvelle Génération (Société ). Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne et contrôle de qualité externe. Automate Architect c8000 (Société Abbott). Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne Abbott et contrôle de qualité externe. Automate Advia (Société ). [voir Remarque F]. Réactifs commercialisés par le fournisseur de l automate. Contrôle de qualité interne et contrôle de qualité externe. Les méthodes de dosage de l alpha2-macroglobuline et de l haptoglobine sont standardisées par rapport au matériau de référence CRM 470, certifié par le Bureau communautaire de référence à Bruxelles (CR) et sélectionné par l IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) et CAP (College of American Pathologists) (3)(4). Le dosage de l apolipoprotéine A1 est standardisé par rapport à la préparation de référence WHO- IFCC SP1-01 (World Health Organization International Federation of Clinical Chemistry SP1-01) (5). Mesure des activités de la GGT, de l ALAT et de l ASAT Afin de sécuriser la transférabilité des résultats des activités enzymatiques (GGT, ALAT, ASAT) entre le système analytique utilisé pour la validation des FibroTests et les autres systèmes analytiques, il est nécessaire de calibrer à l aide du CFAS (valeur IFCC pour ASAT, ALAT et GGT utiliser la valeur GGT liquide, standardisation par rapport à la méthode IFCC). Automates Hitachi 917, Modular, Integra 400 (Société Roche Diagnostic). Réactifs commercialisés par le fournisseur des automates. Les mesures des activités enzymatique à 37 C sont initialement calibrées à l aide du CFAS (Calibrator For Automated Systems Société Roche Diagnostic) (6)(7). Pour la GGT : méthode en méthode IFCC (8). Pour l ALAT : méthode enzymatique en méthode de référence décrite par l IFCC et avec du phosphate de pyridoxal (9). Contrôle de qualité interne Roche et contrôle externe ASQUALAB. Automates RxL, ArX, XPAND (Société Dade-Behring). Réactifs commercialisés par le fournisseur des automates. Automates AU400, AU600, AU640 et AU 2700 (Société Olympus). Réactifs commercialisés par le fournisseur des automates. [Remarque E] Automates Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime (Société Thermo Fisher Scientific). Réactifs commercialisés par le fournisseur des automates. Automates T20, T20XT, T30, T60 Nouvelle Génération (Société ). Réactifs commercialisés par le fournisseur des automates. Automate Architect c8000 (Société Abbott). Réactifs commercialisés par le fournisseur des automates. Calibration Cfas Roche pour GGT, ALT, AST. Automate Advia (Société ). Réactifs commercialisés par le fournisseur des automates. 5/17

6 Remarques : Pour la GGT : méthode enzymatique en méthode de référence décrite par l IFCC. Pour l ALAT : méthode enzymatique en méthode de référence décrite par l IFCC et avec du phosphate de pyridoxal (9). Afin de sécuriser la transférabilité des résultats des activités enzymatiques (GGT, ALAT, ASAT) entre le système analytique utilisé pour la validation des FibroTests et les autres sytèmes analytiques, il est nécessaire : - soit de calibrer à l aide du CFAS (valeur IFCC pour ASAT et ALAT et valeur Szasz pour GGT), - soit d inclure ce calibrateur dans la série des échantillons à analyser afin de déterminer, si besoin, un facteur permettant de corriger les résultats. Les activités enzymatiques de la GGT, de l ALAT et de l ASAT sont exprimées en Unités Internationales par litre (). Dosage de la bilirubine totale Automates Hitachi 917, Integra 400 et Modular (Société Roche Diagnostic). Réactifs commercialisés par la Société Roche. Méthodes de dosage : diazoréactions -selon Jendrassik Grof (10) pour l Hitachi 917, selon Malloy- Evelyn (11) pour l Integra 400, selon Wahlefeld (12) pour le Modular. Les différentes méthodes ont été initialement calibrées avec le C.F.A.S Roche. Contrôle de qualité interne Roche et contrôle externe ASQUALAB. Automates RxL, ArX et XPAND (Société Dade-Behring). Méthodes de dosage : diazoréactions selon la Méthode de Doumas modifiée. Contrôler auprès des fournisseurs que la traçabilité aux systèmes de référence des résultats des automates a été établie. Automates AU400, AU600, AU640 et AU 2700 (Société Olympus). Méthodes de dosage : diazoréactions (DPD) Contrôler auprès des fournisseurs que la traçabilité aux systèmes de référence des résultats des automates a été établie. Automates Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime (Société Thermo Fisher Scientific). Méthodes de dosage : diazoréactions (DPD) Contrôler auprès des fournisseurs que la traçabilité aux systèmes de référence des résultats des automates a été établie. Automates T20, T20XT, T30, T60 Nouvelle Génération (Société ). Méthodes de dosage : diazoréactions (DPD) Contrôler auprès des fournisseurs que la traçabilité aux systèmes de référence des résultats des automates a été établie. Automate Architect c8000 (Société Abbott). Méthodes de dosage : diazoréactions (accélérateur surfactant non décrit par le fournisseur) Contrôler auprès des fournisseurs que la traçabilité aux systèmes de référence des résultats des automates a été établie. 6/17

7 Automate Advia (Société ). Méthodes de dosage : diazoréactions (DPD) Contrôler auprès des fournisseurs que la traçabilité aux systèmes de référence des résultats des automates a été établie. Les résultats sont exprimés en micromoles par litre. Tableau 1 : Méthodes d analyse préconisées pour les dosages du FibroTest et du FibroMax(1)(2). Cette liste est provisoire. Des études sont en cours pour l étendre à des automates et réactifs proposés par d autres fournisseurs. Les CV de reproductibilité doivent être inférieur à 5 % pour tous les paramètres. Paramètres Automates Réactifs Matériau ou méthode de référence Méthodes Analytiques Unités Alpha-2 macroglobuline BN2 BN-Prospec Modular Dade-Behring CRM 470 Néphélémétrie Diagam ou Dako Cytomation Elitech France CRM 470 Pas de facteur pour Diagam [Remarque D] Facteur à 0,84 pour Dako [Remarque B] Intégra canal utilitaire Diagam ou Dako Cytomation Elitech France CRM 470 Pas de facteur pour Diagam [Remarque D] Facteur à 0,87 pour Dako [Remarque B] Immage Beckman CRM 470 Néphélémétrie [Remarque C] AU400, AU600, AU640 AU2700 Dako Cytomation Elitech France CRM 470 7/17

8 Paramètres Automates Réactifs Matériau ou méthode de référence Méthodes Analytiques Unités Alpha-2 macroglobuline (suite) Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime Diagam ou Dako Cytomation Elitech France CRM 470 Pas de facteur pour Diagam [Remarque D] T20, T20XT, T30, T60, T60 Nouvelle Génération Diagam ou Dako Cytomation Elitech France CRM 470 Pas de facteur pour Diagam [Remarque D] Haptoglobine Architect c8000 Diagam CRM 470 Pas de facteur [Remarque D] Advia Diagam CRM 470 Pas de facteur [Remarque D] BN2 Dade-Behring CRM 470 Néphélémétrie BN-Prospec RxL ArX Modular Dade-Behring CRM 470 Roche Modular Diagam CRM 470 [Remarque D] Integra Roche Immage Beckman CRM 470 Néphélémétrie [Remarque C] AU400, AU600, Olympus CRM 470 AU640 [Remarque E] AU2700 Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime Thermo Fisher Scientific CRM 470 T20, T20XT, T30, T60, T60 Nouvelle Génération CRM 470 Architect c8000 Abbott CRM 470 8/17

9 Paramètres Automates Réactifs Matériau ou méthode de référence Méthodes Analytiques Unités Haptoglobine (suite) Advia CRM 470 ApolipoprotéineA1 BN2 BN-Prospec Dade-Behring WHO-IFCC SP1-01 Néphélémétrie Néphélémétrie RxL ArX Dade-Behring WHO-IFCC SP1-01 Modular Integra Roche Ou Diagam WHO-IFCC SP1-01 Pas de facteur [Remarque D] Immage Beckman Coulter WHO-IFCC SP1-01 Néphélémétrie [Remarque C] AU400, AU600, AU640 AU2700 Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime Olympus WHO-IFCC SP1-01 [Remarque E] Thermo Fisher Scientific WHO-IFCC SP1-01 T20, T20XT, T30, T60, T60 Nouvelle Génération WHO-IFCC SP1-01 Advia WHO-IFCC SP1-01 Facteur correctif [Remarque F] Architect c8000 Abbott WHO-IFCC SP1-01 Gamma-GT Hitachi 917 Modular Integra Roche Méthode en conformité avec la méthode IFCC (8). Méthode en méthode IFCC (8). 9/17

10 Paramètres Automates Réactifs Matériau ou méthode de référence Méthodes Analytiques Unités Gamma-GT (suite) RxL ArX Dade-Behring IFCC (4). Méthode en méthode IFCC XPAND AU400, AU600, AU640 AU2700 Olympus IFCC (4). Méthode en méthode IFCC Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime Thermo Fisher Scientific IFCC (4). Méthode en méthode IFCC T20, T20XT, T30, T60, T60 Nouvelle Génération IFCC (4). Méthode en méthode IFCC Architect c8000 Abbott IFCC (4). Advia Méthode en méthode IFCC Calibration Cfas Roche Méthode IFCC modifiée. Méthode en méthode IFCC Bilirubine Totale Hitachi 917 Modular Integra Roche Technique de référence de Doumas (13). Standard de référence par le SRM Diazoréactions: Jendrassik Grof (10) modifiée par Wahlefeld (12); Malloy- Evelyn (11) µmol/l RxL ArX Dade-Behring Technique de référence de Doumas (13). Méthode de Doumas modifiée µmol/l XPAND 10/17

11 Paramètres Automates Réactifs Matériau ou méthode de référence Méthodes Analytiques Unités Bilirubine Totale (suite) AU400, AU600, AU640 AU2700 Olympus Technique de référence de Doumas (13). Standard de référence par le SRM Diazoréactions (DPD) µmol/l Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime Thermo Fisher Scientific Malloy Evelyn Diazoréactions (DPD) µmol/l T20, T20XT, T30, T60, T60 Nouvelle Génération Malloy Evelyn Diazoréactions (DPD) µmol/l Architect c8000 Abbott NIST SRM 916a Diazoréactions µmol/l Advia Oxydation par le VANADATE Méthode de référence AACC µmol/l ALAT Hitachi 917 Modular Integra Roche IFCC avec du phosphate de pyridoxal (9). Méthode enzymatique en méthode de référence IFCC. RxL, ArX, XPAND AU400, AU600, AU640 AU2700 Konelab 20, 20XT, 30, 60, Prime Dade-Behring Olympus Thermo Fisher Scientific IFCC avec du phosphate de pyridoxal (9). IFCC avec du phosphate de pyridoxal (9). IFCC avec du phosphate de pyridoxal (9). Méthode enzymatique en méthode de référence IFCC. Méthode enzymatique en méthode de référence IFCC. Méthode enzymatique en méthode de référence IFCC. 11/17

12 Paramètres Automates Réactifs Matériau ou méthode de référence Méthodes Analytiques Unités ALAT (suite) T20, T20XT, T30, T60, T60 Nouvelle Génération IFCC avec du phosphate de pyridoxal (9). Architect c8000 Abbott IFCC avec du phosphate de pyridoxal (9). Advia IFCC modifiée avec du phosphate de pyridoxal (9). Méthode enzymatique en méthode de référence IFCC. Méthode enzymatique en méthode de référence IFCC. Calibration Cfas Roche Méthode enzymatique en méthode de référence IFCC. ASAT Tableau 2 : Méthodes d analyses préconisées pour les dosages complémentaires du FibroMAX. Paramètres Matériau ou méthode de référence IFCC avec du phosphate de pyridoxal Méthodes Analytiques Méthode enzymatique en conformité avec la méthode de référence IFCC. (Calibration initiale avec Cfas Roche pour l Architect c8000 de Abbott) CHOLESTEROL TOTAL Test colorimètrique (20) Méthode enzymatique standardisée par hydrolyse enzymatique des esters de cholesterol suivie d une réaction de Trinder TRIGLYCERIDES Test colorimètrique (20) Méthode enzymatique standardisée par hydrolyse enzymatique des esters de cholesterol suivie d une réaction de Trinder Unités mmol/l mmol/l GLUCOSE Test UV (21) à l hexokinase mmol/l 12/17

13 CRM: Certified Reference Material for 14 serum proteins, Bureau Communautaire de référence à Bruxelles (BCR), International Federation of Clinical Chemistry (IFCC), College of American Pathologists-(CAP); SRM: Standard Reference Material; CFAS (Roche ): Calibrator For Automated Systems; WHO-IFCC SP1-01 : World Health Organization and International Reference Material. Pour les automates déjà en place dans les laboratoires, s assurer auprès des fournisseurs que la traçabilité des résultats aux systèmes de référence a été vérifiée, en accord avec les Directions Européennes DIVD mises en place pour la fin Si des corrections sont à apporter à la programmation des tests, bien s assurer auprès des fournisseurs qu elles ont été faites sur l automate utilisé. Remarque A : Une étude sur 150 patients atteints d hépatite C chronique a permis de valider le FibroTest sur les automates de la Gamme Dimension (Haptoglobine, Apolipoprotéine A1, GGT, ALAT, Bilirubine totale). Prendre contact avec la Société Dade Behring (tél. : ) pour obtenir le rapport de l étude (18). Remarque B : Une étude comportant 146 patients a permis de valider le dosage turbidimétrique de l alpha2- macroglobuline et le FibroTest sur automate Roche (19). Une différence d environ 15 % entre la néphélémétrie et la turbidimétrie pour ce dosage a été observée. Dans le cadre du FibroTest, l introduction d un facteur de correction de 0,84 pour Modular et 0,87 pour Cobas Intégra est nécessaire pour assurer la concordance des résultats entre le système pris comme référence (néphélémétrie Behring) et le système DakoCytomation-Roche (turbidimétrie). Ces facteurs de correction ont été établis dans des conditions analytiques très strictes. Le biologiste désireux de réaliser le dosage de l'alpha2-macroglobuline dans le cadre du FibroTest sur automate Roche, devra se conformer aux recommandations suivantes: Utiliser les réactifs, calibrateur et contrôles DakoCytomation. Se conformer aux instructions de la fiche technique d'adaptation sur l'automate fournie par le distributeur du réactif pour l'analyseur Modular P et par Roche pour les analyseurs Cobas Intégra. Introduire dans chaque série de dosage les deux contrôles de niveaux différents proposés par DakoCytomation. (distribués par ELITECH France) Les valeurs trouvées des contrôles doivent être impérativement comprises entre plus ou moins 5 % de la valeur cible annoncée par le fabricant. Valider la série, puis appliquer le facteur de correction. TEL ROCHE : ou TEL DAKOCYTOMATION distribué par J2L ELITECH : /17

14 Remarque C : Différentes études comparatives des résultats des protéines de FT- AT (alpha2-macroglobuline, apolipoprotéinea1, haptoglobine) ont été réalisées entre les néphélémètres Immage de la Société Beckman Coulter et les néphélémètres BN2 et BNProspec de la Société Dade Behring. Les résultats de ces études ont conduits à des modifications concernant le dosage d alpha2- macroglobuline (nouvel antisérum) afin d obtenir des résultats similaires à ceux obtenus dans le laboratoire ayant validé le FibroTest. A l état actuel, les résultats d apolipoprotéinea1 obtenus sur automate Immage nécessitent d être corrigés par un facteur établi au cours de deux études différentes. Contacter la Société Beckman Coulter (Mme Isabelle PELISSOLO, Téléphone : ) pour plus d information sur les réactifs à utiliser pour l Alpha2-Macroglobuline et le facteur à appliquer pour les résultats d ApolipoprotéineA1. Remarque D : Les réactifs de la Société Diagam ont été évalués sur les automates Modular (Société Roche ) pour les dosages turbidimétriques des protéines du FibroTest (alpha2- macroglobuline, haptoglobine, apolipoprotéinea1). Leur application est désormais disponible pour différents automates et les résultats des dosages ne nécéssitent pas de facteur de correction. Contacter la Société Diagam (Mr Ameryckx téléphone : ) Remarque E : Une étude sur 150 patients atteints d hépatite C chronique a permis de valider le FibroTest sur les automates de la Gamme Olympus (Haptoglobine, Apolipoprotéine A1, GGT, ALAT, Bilirubine totale). Contacter la Société Olympus Remarque F : En ce qui concerne l Apolipoprotéine A1 sur Advia (référence ) un facteur correctif de doit être appliqué aux résultats d Apolipoprotéine A1. Contacter la Société Siemens Healthcare (Service Technique : ) 14/17

15 C- REFERENCES 1- Imbert- Bismut F, Ratziu V, Pieroni L, Charlotte F, Benhamou Y, Poynard T. Biochemical markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus infection : a prospective study. Lancet, 2001, 357, 9262, Poynard T, Imbert- Bismut F, Ratziu V, Chevret S, Jardel C, Moussali J. Biochemical markers of liver fibrosis in patients infected by hepatitis C virus : longitudinal validation in a randomized trial. J. Viral. Hepat, 2002, 9, Bienvenu J, Doche C, Later R, Manceaux J.C, Pontet E, Pressac M, Vassault A, Dumont G. Améliorations apportées par le matériau de référence CRM 470 dans la standardisation du dosage des protéines sériques. Ann. Bio. Clin, 1997, 55, Dati F, Schumann G, Thomas L, Aguzzi F, Baudner S, Bienvenu J, Blaabjerg O, Blirup- Jensen S, Carlstrom A, Petersen PH, Johnson AM, Milford- Ward A, Ritchie RF, Svendsen PJ, Whicher J. Consensus of a group of professional societies and diagnostic companies for interim reference ranges for 14 proteins in serum based on the standardization against the IFCC/BCR/CAP Reference Material (CRM 470). International Federation of Clinical Chemistry. Community Bureau of Reference of the commission of the European Communities. College of American Pathologists. Eur. J. Clin.Chem.Clin.Biochem, 1996, 34, (6), Albers J.J, Marcovina S.M, and H. KennedyInternational Federation of Clinical Chemistry Standardization Project for Measurement of Apolipoproteins A1 and B. II Evaluation and Selection of Candidate Reference Materials. Clin. Chem., 1992, 38, 5, Myara A, Ferard G, Guéchot J, Imbert- Bismut F, Lasnier E, Piton A, Voitot H, Dhumeaux D. Calibration to achieve standardization in enzymology, example of ALT. Clin. Chem. Lab. Med.,2001,39, Special Supplement pp S1-S Groupe de Travail SFBC ( Lessinger J.M, Doffoel S, Ferard G, Grafmeyer D, Schiele F, Vassault A, Vialle A) -Assurance de Qualité en Enzymologie Clinique- et Hépatites- (Myara A, Guéchot J, Imbert- Bismut F, Lasnier E, Piton A, Voitot H). Le calibrage en enzymologie clinique : principe, conditions d application et résultats. Ann Biol Clin, 2002, 60, Schumann G et al. IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of γ-glutamyl-transferase. Clin Chem Lab Med 2002 ; 40(7) : Bergmeyer HU, Horder M, Rej R. Approved recommendation (1985) on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzyms. Part 3. IFCC method for alanineaminotransférase. J. Clin. Chem. Biochem, 1986, 24, Jendrassik Grof. Vereinfachte Photometrische Methoden zur Bestimmung des Blutbilirubins. Biochem Z, 1938, 297, Malloy HT, Evelyn KA. The determination of bilirubin with photoelectric colorimeter J. Biol. Chem, 1937, 19, /17

16 12- Wahlefeld AW, Herz G, Bernt E. Modification of the Malloy- Evelyn method for a simple, reliable determination of total bilirubin in serum. Scand. J. Clin. Lab. Invest, 1972, 29, supp 26,. Abstract Doumas BT, Perry BN, Sasse EA et al. Standardization in bilirubin assays : Evaluation of selected methods and stability of bilirubin solutions. Clin. Chem, 1973, 19, Halfon P, Imbert-Bismut F, Messous D, Antoniotti G, Benchetrit D, Cart-Lamy P, Delaporte G, Doutheau D, Klump T, Sala M, Thibaud D, Trepo E, Robert P. Myers RP, Poynard T. A prospective assessment of the inter-laboratory variability of biochemical markers of fibrosis (FibroTest) and activity (ActiTest) in patients with chronic liver disease Comp Hepatol 2002; 2: Imbert-Bismut F, Messous D, Thibaut V, Myers RB, Piton A, Thabut D, Devers L, Hainque B, Mercadier A, Poynard T. Intralaboratory analytical variability of biochemical markers of fibrosis (FibroTest) and activity (ActiTest) and reference ranges in healthy blood donors. Clin Chem Lab Med 2004; 42: Rosenthal-Allieri MA, Peritore M, Tran A, Halfon P, Benzakena S, Bernada A. Analytical variability of the FibroTest proteins. Clin Biochem 2005; 38; Rosenthal-Allieri MA, Tran A, Halfon P, Peritore ML, Imbert-Bismut F, Munteanu M, Messous D, Poynard T, Bernard A. Inter-technique variability of FibroTest-ActiTest proteins assays in chronic hepatitis C patients. Gastroenterol Clin Biol 2005; 29: 902. (Abstract). 18- Imbert-Bismut F, Messous D, Raoult A, Poynard T, Bertrand JJ, Marie PA, Louis V, Audy C, Thouy JM, Hainque B, Piton A. Results transferability on RXL, ARX, X-Pand, BN2 (Dade Behring) and modular DP (Roche ) analysers: application to component assays of FibroTest and ActiTest. Ann Biol Clin 2005; 63: Piton A, Messous D, Imbert-Bismut F, Berges J, Munteanu M, Poynard T, Hainque B. Alpha 2 macroglobulin immunoturbidimetric assays (DakoCytomation reagents) on Roche Diagnostic analysers (Modular P, Cobas Integra). Application to FibroTest-ActiTest (FT-AT). Ann Biol Clin 2005; 63: Trinder P. Ann Clin Biochem.1969 ;6 : Peterson JL and young DS. Anal Biochemistry 1958;23:301 16/17

17 PRECAUTIONS D EMPLOI DU FIBROTEST ANNEXE 2 Compte tenu des différents facteurs de risque de faux positifs et de faux négatifs les précautions suivantes doivent être signalées aux utilisateurs : Respecter les recommandations analytiques pour l utilisation des automates et des réactifs. Différer la prescription en cas de situation transitoire favorisant une modification des composants de FibroTest : o Hémolyse aiguë (Accès palustre, médicaments entraînant une hémolyse comme la ribavirine, l azathioprine) susceptible de diminuer l haptoglobine et d augmenter la bilirubine non conjuguée. o Hépatite aiguë quelle qu en soit la cause, médicamenteuse, virale (surinfection par virus HAV, HBV, EBV), ou auto-immune. La nécrose hépatique massive, entraîne une augmentation majeure des transaminases et de la bilirubine totale. o Inflammation aiguë comme une infection bactérienne ou virale aiguë concomitante : infection broncho-pulmonaire ou urinaire. L augmentation importante de l haptoglobine peut entraîner des faux négatifs. o Cholestase extra-hépatique, comme une lithiase biliaire. Demander l avis d un spécialiste des maladies du foie pour l interprétation lors de situation chronique où les composants peuvent être modifiés : o Hémolyse chronique en particulier chez les patients ayant une valve cardiaque. o Maladie de Gilbert, où FibroTest et ActiTest doivent être calculés, en utilisant la valeur médiane de la bilirubine totale (10µmol/l). o Les inhibiteurs de protéases utilisés dans l infection VIH peuvent augmenter la bilirubine non conjuguée (Indinavir, Atazanavir) ou les GGT et ALAT (Ritonavir) L interprétation de FibroTest a été validée chez les transplantés rénaux Chez les patients avec insuffisance rénale ou en dialyse, le FibroTest a une valeur diagnostique acceptable, moindre par rapport aux transplantés. De nouvelles études sont nécessaires. D une façon générale l existence de valeurs extrêmes de l un des six composants doit entraîner une prudence dans l interprétation des résultats, en particulier : o Haptoglobine inférieure à 0,12 g/l, où une hémolyse doit être éliminée o Haptoglobine supérieure à 3.2 g/l, où une inflammation aiguë doit être éliminée o Transaminases supérieures à 622 UI/L où une hépatite aiguë doit être éliminée o Bilirubine supérieure à 30 micromoles/l et GGT inférieure à 50 UI/L où une maladie de Gilbert doit être suspectée. o Alpha2-macroglobuline supérieure à 5.0. En cas de discordance entre le résultat d une biopsie et d un FibroTest, il est conseillé d en discuter avec un spécialiste des maladies du foie. Les causes de ces discordances peuvent être dues à un défaut du FibroTest précédemment énuméré ou à un défaut de la biopsie. La biopsie du foie, même dans les conditions de qualité (un seul fragment, taille d au moins 15 mm et nombre d espaces portes au moins égal à 5), a une variabilité intrinsèque (entre 2 biopsies du même foie) importante : variabilité d au moins un stade de fibrose dans 33% des cas et d au moins un grade d activité dans 24% des cas. Une étude prospective a montré que des discordances importantes, d au moins 2 stades et deux grades entre FibroTest ActiTest et la biopsie, pratiqués le même jour ont été observées chez 28.7% et était attribués à la biopsie dans 18.1% des cas. 17/17

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