I CADRE D ETUDE II - SOUCHES BACTERIENNES III MATERIEL

Transcription

1 54 I CADRE D ETUDE Ce Travail a été effectué à l Unité de Recherche et de Biotechnologie Microbienne du Laboratoire de Bactériologie-Virologie de l Hôpital Aristide Le Dantec. II - SOUCHES BACTERIENNES Nous avons utilisé des souches de contrôle de staphylocoques, de streptocoques, d entérobactéries ainsi que des isolats de contrôle de Mycoplasmes urogénitaux. III MATERIEL III.1. MATERIEL POUR LA PREPARATION DES MILIEUX - Agitateur magnétique - Balance de précision - ph-mètre - Seringues - Filtre de 0,2 µm de diamètre - Micropipettes de 100 et 200 µl - Embouts stériles ; - Flacons en verre avec bouchon à vis de 5, 100 et 150 ml - Tubes stériles à bouchon de 2,5 et 5 ml - Erlen-meyer - Bain-marie - Autoclave.

2 55 III.2. MATERIEL POUR LE CONTROLE DE QUALITE III Matériel léger - Microplaques de 20 ou 96 puits avec couvercle - Micropipettes de 100 µl et 200 µl - 1 bécher rempli d eau de javel - 1 plateau (inoxydable de préférence) - 1 papier buvard - 1 étalon de Mac Farland d échelle 1 (*) - Anse de platine - Emballage plastique - Lame porte-objets - Boîtes de Pétri - Générateur de CO 2 ou bougie. III Matériel lourd - Bec bunsen - Etuve - Four à micro-ondes - Hygromètre - Appareil de scellage - Dessiccateur sous vide à air renouvelé - Microscope optique - Jarre d incubation (*) : Etalon de Mac Farland varie : - pour les Streptocoques : l étalon de Mac Farland est d échelle 4 - pour les Entérobactéries : l étalon de Mac Farland est d échelle 0,5.

3 56 II1.3. MATERIEL POUR LA CONSERVATION DES SOUCHES - Cryotubes à billes - Tubes à visse - Tube nunc - Ecouvillons - Portoirs.

4 57 IV LES STAPHYLOCOQUES IV.1. REACTIFS IV.1.1. Réactifs pour enrichissement et isolement - BTS : Bouillon Trypticase Soja -Gélose MH : Müller Hinton - Gélose trypticase - soja - Sang de cheval IV.1.2. Réactifs pour l identification IV Substrats pour identification - Glucides : Glucose, Mannitol, Xylose, Saccharose, Glycérol, Mannose, Lactose, Rafinose. - MEVAG STREPTO/STAPH - Milieu de FALKOW - Milieu urée - tryptophane - Milieu de Clark et Lubs (VP) - Milieu à l ONPG - Milieu pour la recherche de la nitrate réductase. IV Réactifs de révélation - Potasse à 10 % - Créatinine à 1 % - Alpha-naphtol - Acide sulfanilique à 8 g/l - Acide naphtylamine à 5 g/l.

5 58 IV.1.3. Réactif pour la conservation des souches - Bouillon cœur cervelle + 10 % de glycérol - Lait écrémé + 10 % de glycérol - Gélose MH : Muller Hinton - Billes en tube. IV.2. - METHODOLOGIE IV.2.1. Préparation des différents milieux IV Milieux d enrichissement et d isolement Bouillon Trypticase-Soja C est le milieu de régénération des souches conservées à +4 C ou 70 C.. Formule Réactifs Quantité - Trypticase soja 15 g - Eau distillée 500 ml Autoclaver à 121 C pendant 15 mn. Répartir dans les tubes à visse. Gélose au sang ordinaire : G.S.O. C est le milieu d isolement des Staphylocoques ; il permet d obtenir des colonies de taille plus importante. Milieu de base Réactifs Quantité - Gélose Agar 8,5g - Trypticase soja 15g - Eau distillée 500 ml Autoclaver le mélange à 121 C pendant 15 minutes. Laisser refroidir.

6 59 Milieu complet Réactifs Quantité - Milieu de base 500 ml - Sang de cheval 12,5 ml Au milieu de base refroidi, on ajoute du sang de cheval. Le mélange est homogénéisé puis réparti dans des boîtes de pétri à raison de 4 ml pour les boîtes de 8 cm de diamètre et 8 ml pour les boîtes de 16 cm de diamètre. N.B. : Ce milieu est aussi utilisé pour l isolement des streptocoques (page.). IV Milieux d identification de la microméthode Micro CSB STAPHYLOCOQUE IV Milieux liquides Préparation Les sucres Glucides Stérilisation Température et Durée Glucose 10 % Tréhalose 10 % Mannitol 10 % Xylose 10 % Saccharose 10 % Glycérol 10 % Mannose 10 % Lactose 10 % Raffinose 10 % Autoclavage Autoclavage Autoclavage Filtration Tyndalisation ou Filtration Autoclavage Autoclavage Tyndalisation ou Filtration Autoclavage 110 C 10 min. 110 C 10 min. 110 C 10 min. 60 C 30 min. x 3 jours 115 C 30 min. 110 C 10 min. 60 C 30 min. x 3 jours 110 C 10 min.

7 60 MEVAG STREPTO/STAPH Il s agit d une base de culture au rouge de phénol, commercialisée sous forme de poudre déshydratée, servant à la différenciation de cultures pures basées sur la réaction de fermentation. Formule approximative par litre Réactifs Quantité - Extrait pancréatique de caséine 10,0g - Chlorure de sodium 5,0g - Rouge de phénol 0,018g Mode d emploi Suspendre 15g de poudre dans un litre d eau distillée. Autoclaver le mélange à 118 C pendant 15 minutes. Autres milieux d identification Milieu de FALKOW C est le milieu de base pour la recherche des décarboxylases. Le milieu de FALKOW est commercialisé sous forme déshydratée. Formule Réactifs Quantité - Extrait de levure 0,6g - Glucose 0,2g - NaCl 1g - Rouge de phénol 0,03g - Acide Amine (L-ornithine ou L-arginine) 1g - Eau distillée qsp 100 ml Le milieu ainsi préparé doit être autoclavé à 120 C pendant 15 minutes et son ph ajusté à 6,3 6,4.

8 61 Milieu Urée - Tryptophane Il permet la recherche de l uréase. Formule Réactifs Quantité - L-tryptophane 0,6g - Phosphate monopotassique 0,2g - Phosphate dipotassique 0,2g - NaCl 1g - Eau distillée 100 ml Stérilisation par filtration. Milieu de CLARK et LUBS (VP) Le but de son utilisation est la mise en évidence de la production d acétoïne. Formule Réactifs Quantité - Peptone trypsique ou polypeptane 2,1g - Pyruvate de sodium 1,84g - Phosphate dipotassique 1,5g - Fumarate disodique 0,6g - Glucose 1,5g - Eau distillée 100 ml Ajuster le mélange à ph 7 et filtrer. Milieu à l ONPG Il concourt à la caractérisation de la β-galactosidase. Les disques d ONPG ont été immergées dans une solution de lactose à 10 % puis le milieu obtenu a été homogénéisé pour favoriser l élution des disques.

9 62 Milieu pour la recherche de la nitrate réductase Il s agit d un bouillon nutritif nitraté. Le bouillon nutritif a la formule suivante : Formule Réactifs Quantité - Peptone 0,5g - Extrait de viande 0,3g - Eau distillée 100 ml Ajuster à ph 7 et ajouter 2g de nitrate de sodium. Dissoudre et autoclaver à 121 C pendant 15 minutes. NB : avec du bouillon nutritif déshydraté, il suffit de dissoudre 1,6g de milieu sec dans 100 ml d eau distillée pour préparer le bouillon. Réactifs de révélation Potasse à 10 % (VP1) - potasse 10g - eau distillée 100 ml Créatinine à 1 % (VP2) - créatinine 1g - eau distillée 100 ml Alpha-naphtol (VP3) - naphtol 1g - éthanol 70 C 100 ml Acide sulfanilique à 8 g/l (GRIESS I) - acide sulfanilique 0,8g - éthanol 95 C 100 ml

10 63 Alpha-naphtylamine à 5 g/l (GRIESS II) - alpha naphtylamine 0,5g - éthanol 100 ml Contrôle de qualité des milieux liquides Une fois qu un lot de milieux liquides a été préparé, il est nécessaire de s assurer de la stérilité et de l efficacité de ces différents milieux. Test de stérilité Il est basé sur la mise en évidence de l absence de souillures des milieux liquides préalablement préparés. Technique Nous avons utilisé des tubes à hémolyse. Nous avons prélevé 2 ml de chaque milieu liquide et nous l avons introduit dans un tube donné. Sur chaque tube, nous avons mentionné le nom du substrat introduit. Nous avons ajouté 1 ml d eau physiologique stérile dans les tubes contenant les milieux allant de URE à NIT. Dans les tubes allant de Glu à RAF, nous avons ajouté 1 ml de MEVAG STREPTO/STAPH. Les tubes ont été fermés avec du coton et incubé à l étuve à 37 C pendant 24H. Interprétation et résultats Les milieux sont considérés comme stériles en l absence de : - trouble du milieu - virage de l indicateur coloré - coloration du milieu après ajout de réactifs de révélation pour les cupules concernées.

11 64 Test d efficacité Ainsi, lorsqu un milieu liquide a été considéré comme stérile, elle fait l objet d une étude en ce qui concerne sa capacité à donner un résultat positif avec une souche dont le caractère correspondant est positif et à donner un résultat négatif si ce caractère est négatif pour une autre souche donnée. De ce fait, pour chaque caractère biochimique (milieu liquide), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. Technique Nous avons réalisé une subculture de chaque souche de contrôle sur gélose au sang 24 à 48 heures. A partir des colonies prélevées avec soin de la gélose, nous avons réalisé pour chaque souche de contrôle un inoculum dont la turbidité est ajustée à celle de l échelle 1 de l étalon standard de Mac Farland, en délayant les colonies dans de l eau distillée stérile. Nous avons distribué les milieux liquides dans les microcupules. Nous avons préparé deux plaques ; l un pour les contrôles positifs et l autre pour les contrôles négatifs. Nous avons ensemencé les cupules de URE à NIT avec l inoculum de la souche de contrôle correspondant (100 µl). Pour la cupule allant de Glu à RAF, l inoculum de la souche de contrôle correspondant a été mélangé avec le MEVAG STREPTO/STAPH, puis nous avons ensemencé les cupules avec le MEVAG ainsi inoculé (100 µl). Nous avons ensuite fermé les cupules ADH, ODC, URE et tous les sucres avec 2 gouttes d huile de paraffine. Nos plaques de contrôle ont été incubées à 37 C sur un plateau recouvert de papier buvard imbibé d eau. La lecture se fait 24H après l incubation.

12 65 Tableau XII : Plan des plaques pour contrôle CSB des Staphylocoques Plaque des contrôles positifs URE Staphyloccus xylosus ADH Streptococcus pyogenes ODC Proteus mirabilis VP Enterococcus faecalis ONPG Staphylococcus xylosus NIT Staphylococcus aureus GLU Staphylococcus aureus TRE Streptococcus epidermitis MAN Streptotoccus pneumoniae XYL Staphylococcus xylosus SAC Staphylococcus haemolyticus GLY Staphylococcus aureus MNE Staphylococcus aureus LAC Streptococcus pneumoniae RAF Staphylococcus lentus Plaque des contrôles négatifs URE Staphylococcus haemolyticus ADH Enterococcus avium ODC Staphylococcus aureus VP Streptococcus pneumoniae ONPG Staphylococcus aureus NIT Staphylococcus cohnii GLU Micrococcus sp TRE Micrococcus sp MAN Staphylococcus aureus XYL Micrococcus sp SAC Micrococcus sp GLY Staphylococcus epidermitis MNE Micrococcus sp LAC Staphylococcus haemolyticus RAF

13 66 Résultats La lecture se fait suivant le tableau de lecture de la microméthode Micro CSB Staphylocoques. IV Milieux déshydratés Préparation Les milieux déshydratés ont été préparés, après avoir obtenu et contrôlé la stérilité et l efficacité des milieux liquides. Distribution des milieux Nous avons réparti les milieux liquides préalablement préparés dans les puits des microplaques, à raison de 100 µl par substrats (milieux). Nous avons fait la distribution selon le dispositif suivant : Plaques de 20 puits URE ADH ODC VP ONPG NIT GLu TRE MAN XYL SAC GLy MNE LAC RAF Déshydratation des milieux Après répartition dans les microcupules, nous avons déshydraté les milieux liquides au four à micro-ondes en présence de dessiccateur. La température est de 37 C pendant 48 heures. Contrôle de qualité Une fois qu un lot de milieux déshydratés a été préparé, il est nécessaire de s assurer de la stérilité et de l efficacité de ces lots de milieux.

14 67 Test de stérilité Il est basé sur la mise en évidence de l absence de souillures des milieux préalablement déshydratés. Technique Nous avons sur une microplaque, les différents milieux déshydratés. Les cupules renfermant les milieux allant de URE à NIT ont été inoculés avec de l eau physiologique stérile et les cupules renfermant les milieux allant de GLU à RAF avec le MEVAG STREPTO/STAPH. Nous avons recouvert la plaque d un parafilm et incubé à l étuve à 37 C pendant 24H sur plateau recouvert de papier buvard imbibé d eau. Tableau XIII : Plan contrôle de stérilité des microplaques CSB Staphylocoques URE Eau physiologique stérile NIT Eau physiologique stérile ADH Eau physiologique stérile GLU MEVAG ODC Eau physiologique stérile TRE MEVAG VAP Eau physiologique stérile MAN MEVAG ONPG Eau physiologique stérile XYL MEVAG SAC MEVAG GLY MEVAG MNE MEVAG LAC MEVAG RAF MEVAG Test d efficacité Ainsi, lorsqu un milieu déshydraté a été considéré comme stérile, elle fait l objet d une étude en ce qui concerne sa capacité à donner un résultat positif avec une souche dont le caractère correspondant est positif et à donner un résultat négatif si ce caractère est négatif pour une autre souche donnée. Le test permet de voir si le milieu ne s est pas dégradé au cours de la déshydratation.

15 68 De ce fait, pour chaque caractère biochimique (milieu), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. Technique Nous avons eu recours à la même technique que celle utilisée pour les milieux liquides. Remarque : la différence est que les cupules renferment des substrats déshydratés. Résultats Ils sont présentés sous forme de tableau et ont été identiques à ceux obtenus avec les milieux liquides. IV.2.2. Identification des souches bactériennes IV Isolement En vue d'obtenir des colonies des germes à identifier, les souches conservées à +4C ou 70 C ont été régénérées dans un bouillon trypticase soja (BTS), puis ensemencées sur une gélose trypticase soja enrichie par 5 % de sang de cheval (GSO). L incubation se fait à l étuve à 37 C + 5 % de CO 2 pendant 24 heures. IV Identification Examen macroscopique des colonies Les staphylocoques donnent sur gélose au sang ordinaire, des colonies de grande taille, lisses, entourées fréquemment d une zone claire d hémolyse totale de type bêta. Examen microscopique A partir d'une colonie, nous avons confectionné un frottis que nous avons ensuite coloré au Gram.

16 69 L'observation microscopique à l objectif à immersion montre des diplocoques Gram positif, disposés en petits amas ou grappes. Test à la catalase Principe La catalase est une enzyme qui hydrolyse le peroxyde d'hydrogène (3%) en eau plus de l oxygéne. Technique A partir de colonies prélevées avec soin de la gélose, nous avons réalisé un frottis. Nous y avons déposé quelques gouttes de peroxyde d'hydrogène à 3% et recherché immédiatement une libération d'oxygène se matérialisant par la production de bulles. Interprétation - Réaction positive : une production de bulles indique la présence de catalase. - Réaction négative : une absence de bulles signe un test négatif. Résultats - Les Staphylocoques sont catalase positive, à l exception de S. saccharolyticus et S. aureus anaerobius qui sont catalase négative. Limites de la réaction et précautions à prendre Le test de la catalase ne doit pas être réalisé sur des colonies vieilles de plus de 24 heures ; ces dernières peuvent donner des réactions faussement négatives, puisque l'enzyme ne se retrouve que dans des cultures viables. Il faut prendre garde à ne pas prélever de la gélose lors du transfert des colonies de la boîte de Pétri à la lame, car les globules rouges renferment de la catalase.

17 70 Identification par le test API 20 STAPH API 20 STREP est un système d identification du genre Staphylococcus comportant des tests biochimiques standardisés et miniaturisés. Principe Les différents tests de la galerie se présentent sous forme déshydratée. Leur reconstitution se fait lors de l addition à chaque tube, d API STAPH Medium ensemencé avec la souche à étudier. Celle-ci doit être cultivée au préalable sur une gélose au sang ordinaire. L incubation se fait à C durant heures. La lecture et l interprétation sont réalisées à partir du catalogue Analytique API STAPH ou d un logiciel d identification. Composition des milieux et réactifs APi STAPH Médium 6 ml Réactif VP1 Réactif VP2 Réactif NiT1 Réactif NiT2 Réactif ZYM A Réactif ZYM B 8 ml Extrait de levure Bactopeptone Chlorure de sodium Oligoéléments Eau déminéralisée ph 7,0 7,4 Hydroxyde de potassium H 2 O α-naphtol Ethanol Acide sulfanilique Acide acétique H 2 O N,N-diméthyl-1-naphtylamine Acide acétique H 2 O Trib-hydroxyméthyl-aminoéthane Acide chlorhydrique à 37 % Laurylsulfate de Na H 2 O Fast Blue BB 2-méthoxyéthanol qsp 0,5g 10g 5g 10 ml 1000 ml 40g 100 ml 6g 100 ml 0,4g 30g 70 ml 0,6g 30g 70 ml 25g 11 ml 10g 100 ml 0,35g 100 ml

18 71 Mode opératoire Préparation de la galerie - Nous avons réparti 5 ml d eau distillée dans les boîtes d incubation puis nous y avons placé la galerie. Préparation de l inoculum Après avoir ouvert une pré-culture sur GSO 18-24H à 37 C, nous avons prélevé à l aide d un écouvillon, des colonies isolées de cette culture. Une suspension bactérienne homogène d opacité égale à 0,5 de Mc FARLAND a été préparé avec une ampoule d API STAPH Médium. Inoculation de la galerie A l aide d une pipette, nous avons rempli les tubes de la galerie avec API STAPH Médium ensemencé. Nous avons créé une anaérobiose dans les tests ADH et URE en remplissant leur cupule d huile de paraffine (2 gouttes) pour former un ménisque convexe. La boîte d incubation a été refermée et placée à l étuve à C pendant heures. Lecture de la galerie Nous avons lu les réactions conformément au tableau de lecture en ajoutant une goutte de chacun des réactifs suivants : - test VP : VP1 et VP2 ; attendre 10 mn ; - test NiT : NiT 1 et NiT 2 ; - test PAL : ZYM A et ZYM B. Identification Elle est réalisée à l aide du catalogue Analytique et du logiciel d identification.

19 72 Tableau XIV : Lecture de la galerie API STAPH Tests GLU FRU MNE MAL LAC TRE MAN XLT MEL Substrats D-glucose D-fructose D-mannose D-maltose D-lactose (origine bovine) D-tréhalose D-mannitol Xylitol D-mélibiose QTE (mg/cup.) 1,56 1,4 1,4 1,4 1,4 1,32 1,36 1,4 1,32 Réactions/Enzymes (Témoin positif (D-glucose) Acidification (D-fructose) Acidification (D-mannose) Acidification (D-maltose) Acidification (D-lactose) Acidification (D-trehalose) Acidification (D-mannito) Acidification (D-xylitol) Acidification (D-melbiose) RÉSULTATS Négatif Rose Positif Jaune Nitrate de 0,08 Réduction des nitrates NIT 1 + NIT 2/10 min. NIT potassium en nitrites Incolorerose Rouge pâle ZYM A + ZYM B/10 min PAL β-glucuronidase 0,0244 Phosphatase alcaline Vert pâlejaune Rose RAF XYL SAC MDG D-raffinose D-xylose D-saccharose Méthyl- α-dglucopyranoside 1,56 1,4 1,32 1,26 Acidification (Rafinose) Acidification (Xylose) Acidification (Saccharose) Acidification (Méthyl- α-dglucopyranoside) Rouge Jaune NAG Production d acétyl méthyl- VP 1 + VP 2/10 min. VP Sodium pyruvate 1,904 carbinol (Voges Proskauer) Vert pâlejaune Rose N-acétylglucosamine 1,28 ADH L-arginine 1,904 Arginine dihydrolase Jaune URE Urée 0,76 Uréase Jaune Acidification (N-acétylglucosamine) Orangerouge Rougeviolet - Les tests MNE et XLT peuvent être oranges lorsqu ils sont entourés ou précédés de tests positifs. On doit alors les considérer comme négatifs.

20 73 IV.2.3. La Microméthode d identification System Micro CSB STAPHYLOCOQUE Il s agit d une méthode miniaturisée permettant la mise en évidence d activités enzymatiques, de la fermentation des sucres. Avec 15 tests biochimiques, il permet de faire un diagnostic d espèces des staphylocoques. Principe La Micro CSB Staphylocoques consiste à utiliser des plaques constituées de 20 microcupules contenant des substrats sous forme déshydratée destinées à la mise en évidence d activité enzymatique ou d assimilation de différents substrats. Les puits (microcupules) sont inoculés avec une suspension de bactéries (inoculum) qui reconstitue le milieu. Les réactions produites pendant la période d incubation se traduit par des virages colorés, spontanés ou révélés par l addition de réactifs. Mode opératoire Préparation de l inoculum Les souches conservées à 70 C dans un bouillon cœur cervelle + 10 % de glycérol sont régénérées dans un bouillon trypticase soja à 37 C avant d être repiquées sur gélose au sang ordinaire sous 5 % de CO 2 pendant 24 heures à 37 C. La suspension bactérienne est préparée en délayant des colonies bien isolées dans de l eau physiologique (1 ml) par écouvillonnage. La turbidité de la suspension est ajustée à l échelle 1 de l étalon standard de Mac FARLAND.

21 74 Ensemencement et incubation - Distribuer 100 µl d inoculum bactérien par microcupule de URE à NIT. - Verser le reste de la suspension bactérienne dans 1 ml de base de culture rouge de phénol (bouillon au rouge de phénol) et mélanger.. - Ensemencer les cupules de GLU à RAF avec le bouillon rouge de phénol ainsi inoculé (3 à 4 gouttes), environ 100 µl par cupule. - Recouvrir les puits destinés à la recherche d uréase et des décarboxylases avec 2 gouttes d huile de paraffine afin de maintenir l anaérobiose nécessaire aux réactions. - Incuber à 37 C sur un plateau recouvert de papier buvard imbibé d eau. - Lire après 4 heures, puis après 18 heures d incubation. Lecture et interprétation La lecture repose sur le changement de la coloration initiale des différents milieux. Pour la plupart des milieux, la lecture s est faite directement, par contre pour d autres, elle a nécessité l addition de réactifs. La lecture des caractères est faite sur une fiche de lecture (cf tableau de lecture). L identification est rendue possible grâce à l utilisation du tableau d identification (cf tableau d identification).

22 75 Tableau XV : Lecture plaques Micro CSB Staphylocoques Tests Substrats Réactions / Enzymes Réactifs à ajouter Résultats positifs Résultats négatifs URE ADH ODC Urée Uréase Rose framboise Arginine Arginine dihydrolase Rouge Ornithine Ornithine décarboxylase Rose-rouge Orange Jaune Jaune VP Glucose + pyruvate Production d'acétoïne ONPG ONPG Bêtagalactosidase NIT GLU TRE MAN XYL SAC GLY MNE LAC RAF Nitrate de potassium Glucose Tréhalose Mannitol Xylose Nitrate réductase 1 goutte de KOH 1goutte de créatinine 1 goutte de α-naphtol 1 goutte d acide sulfanilique 1 goutte α-naphtylamine Rose- Rouge Rouge Noir Incolore Incolore Incolore Saccharose Fermentation Jaune Rouge Glycérol Mannose Lactose Raffinose

23 76 V LES STREPTOCOQUES V.1. REACTIFS V.1.1. Réactifs pour enrichissement et isolement - BGT : Bouillon Glucose Tamponné -Gélose MH : Müller Hinton - Gélose trypticase - soja - Sang de cheval - Gentamicine - Acide nalidixique. V.1.2. Réactifs pour enrichissement et isolement V Substrats pour identification - Glucides : L-arabinose, Mannitol, Sorbitol, Tréhalose, Raffinose, Sorbose, Inuline, Lactose, Ribose, Amidon - MEVAG STREPTO/STAPH - Milieu de Clark et Lubs (VP) - Milieu de FALKOW - Bouillon hypersalé : BHS - Esculine. V Réactifs de révélation - Créatinine à 1 % (VP2) - Potasse à 10 % (VP1) Réactifs pour la conservation des souches (cf. page 58)

24 77 V.2. - METHODOLOGIE V.2.1. Préparation des différents milieux V Milieux d enrichissement et d isolement Bouillon Trypticase-Soja (cf page 58) Gélose au sang cuit + Gentamicine C est le milieu d isolement de Streptococcus pneumoniae. Milieu de base Réactifs Quantité - Gélose 8,5g - Trypticase soja 15g - Eau distillée 500 ml Autoclaver le mélange à 121 C pendant 15 minutes. Milieu complet Réactifs Quantité - Milieu de base 500 ml - Sang de cheval 12,5 ml - Gentamicine 6 ml Mélanger à chaud et répartir le mélange obtenu dans les boîtes de pétri. Gélose au sang ordinaire : GSO (cf page 58)

25 78 V Milieux d identification de la microméthode Micro CSB STREPTOCOQUE V Milieux liquides Préparation Les sucres Glucides Stérilisation Température et Durée Arabinose 10 % Mannitol 10 % Sorbitol 10 % Tréhalose 10 % Raffinose 10 % Sorbose 10 % Inuline 5% Lactose 10 % Amidon 2,5% Glycérol 10 % Tindalisation ou Filtration Autoclavage Autoclavage Autoclavage Autoclavage Autoclavage Autoclavage Tyndalisation ou Filtration Autoclavage Autoclavage 60 C 30 min. x 3 jours 110 C 10 min. 110 C 10 min. 110 C 10 min. 110 C 10 min. 110 C 10 min. 110 C 10 min. 60 C 30 min. x 3 jours 115 C 30 min. 115 C 30 min. MEVAG STREPTO/STAPH (cf page 60) Autres milieux d identification Milieu de CLARK et LUBS (Voges Proskauer) (cf page 61) Milieu pour la mise en évidence de l attaque de l esculine Formule Réactifs Quantité - Peptone 20 g/l - Citrate de fer ammoniacal 2 g/l - Glucose 2 g/l Ajuster le ph du mélange à 7,4. Stériliser à 110 C pendant 30 minutes. Milieu de FALKOW (cf page 60)

26 79 Bouillon hypersalé Formule Réactifs Quantité - Bouillon MH ou infusion de coeur 5g - NaCl 13g - Glucose 0,2g - BCP (1,6 %) 200 µl - Eau distillée 100 ml Ajuster le ph à 7 7,2. Stérilisation par autoclavage à 121 C pendant 20 minutes. Réactifs de révélation Créatinine à 1 % (VP2) - Créatinine 1g - Eau distillée 100 ml Potasse à 10 % (VP1) - KOH 10g - Eau distillée 100 ml Contrôle de qualité des milieux liquides Le contrôle de ces milieux est basé sur les tests de stérilité et d efficacité. Test de stérilité (cf page 63) - Nous avons ajouté 1 ml d eau physiologique stérile dans les tubes contenant les milieux VP, ESC, ADH, BHS. - Dans les tubes contenant les sucres, nous avons ajouté 1 ml de MEVAG STREPTO/STAPH.

27 80 Test d efficacité (cf page64) L étalon standard de Mac Farland est d échelle 4. Tableau XVI : Plan des plaques pour contrôle d efficacité CSB Streptocoques Plaque des contrôles positifs VP Enterococcus faecalis ESC Enterococcus faecalis ADH Streptococcus pyogenes BHS Enterococcus faecalis ARA Enterococcus avium MAN Streptococcus pneumoniae SOR Enterococcus avium TRE Enterococcus faecalis RAF Klebsiella pneumoniae SOS Enterococcus faecalis INU Streptococcus pneumoniae LAC Streptococcus pneumoniae RIB Enterococcus faecalis AMD Enterococcus faecalis Gly Enterococcus faecalis Plaque des contrôles négatifs VP Streptococcus pneumoniae ESC Streptococcus agalactiae ADH Enterococcus avium BHS Streptococcus pyogenes ARA Streptococcus pyogenes MAN Micrococcus sp SOR Streptococcus pyogenes TRE Micrococcus sp RAF Streptococcus pyogenes SOS Enterococcus avium INU Enterococcus faecalis LAC Enterococcus faecalis RIB Streptococcus pyogenes AMD Enterococcus avium Gly Enterococcus avium Résultats Micro CSB ENTERO. La lecture se fait suivant le tableau de lecture de la microméthode

28 81 V Milieux déshydratés Préparation Les milieux déshydratés ont été préparés, après avoir obtenu et contrôlé les milieux liquides. Distribution des milieux Nous avons réparti les milieux liquides préalablement préparés dans les puits des microplaques, à raison de 100 µl par substrats (milieux). Nous avons fait la distribution selon le dispositif suivant : Plaques de 20 puits VP ESC ADH BHS ARA MAN SOR TRE RAF SOS INU LAC RIB AMD Gly Déshydratation des milieux (cf page 66) Contrôle de qualité Les tests de stérilité et d efficacité ont été réalisés suivant les techniques décrites avec les milieux déshydratés Micro CSB Staphylocoques. Test de stérilité (cf page 67)

29 82 Tableau XVII : Plan contrôle de stérilité des Microplaques CSB Streptocoques VP Eau physiologique stérile ESC Eau physiologique stérile ADH Eau physiologique stérile BHS Eau physiologique stérile ARA MEVAG MAN MEVAG SOR MEVAG TRE MEVAG RAF MEVAG SOS MEVAG INU MEVAG LAC MEVAG RIB MEVAG AMD MEVAG GLy MEVAG Test d efficacité (cf. page 67) V.2.2. Identification des souches bactériennes V Isolement En vue d'obtenir des colonies des germes à identifier, les prélèvements ont été ensemencés sur les milieux suivants : - GSO pour les streptocoques ; - GSC+Gentamicine à 6 mg/ml pour les pneumocoques ; - puis incubés à 37 C + 5 % CO 2 pendant : 24H pour milieu GSO 48 H pour milieu GSC + Gentamicine. V Identification Examen macroscopique des colonies Les Streptocoques donnent sur gélose au sang cuit, des colonies lisses entourées d une d hémolyse qui varie suivant l espèce :

30 83 - les Streptocoques pyogenes (S. pyogenes, S. agalactiae, S. equi) ont une hémolyse complète de type bêta ; - les Streptocoques oraux (S. sanguis, S. mitis, S. milleri) et ceux du groupe D (S. bovis, S. equinus) sont non hémolytiques. Tandis que les Pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) donnent sur gélose au sang cuit, de petites colonies mucoïdes ou à dépression centrale, transparentes, rondes et développant une hémolyse de type alpha (alpha viridans). Examen microscopique A partir d'une colonie, nous avons confectionné un frottis que nous avons ensuite coloré au Gram. L'observation microscopique à l'objectif à immersion montre des diplocoques Gram positif, en flamme de bougie, capsulés. Il s'agit là d'une morphologie généralement caractéristique du pneumocoque. Les streptocoques se présentant, quant à eux, sous forme de cocci Gram positif disposés en chaînettes. Test à la catalase (cf page 69) N.B. : - Les streptocoques sont catalase négative. Identification par API 20 STREPTO API 20 STREP est un système standardisé associant 20 tests biochimiques qui présentent un grand pouvoir discriminant. Il permet de faire un diagnostic de groupe ou d espèce pour la plupart des streptocoques rencontrés en bactériologie médicale. Principe La galerie API 20 STREP comporte 20 microtubes contenant les substrats déshydratés pour la mise en évidence d activité enzymatique ou de fermentation de sucres.

31 84 Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, réalisée à partir d une culture pure, qui réhydrate les substrats. Les réactions produites pendant la période d incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l addition de réactifs. Les tests de fermentation sont inoculés avec un milieu enrichi qui réhydrate les sucres. La fermentation des carbohydrates entraîne une acidification se traduisant par un virage spontané de l indicateur coloré. La lecture de ces réactions se fait à l aide du tableau de lecture et l identification obtenue à l aide d un logiciel d identification. Composition des milieux et réactifs Suspension Médium 2 ml Api GP Médium 2 ml Réactif NIN 5 ml Réactif VP1 5 ml Réactif VP2 Réactif ZYM A 8 ml Réactif ZYM B 8 ml Eau déminéralisée Cystine Tryptone Chlorure de sodium Sulfite de sodium Rouge de phénol Eau déminéralisée ph 7,8 Ninhydrine 2-méthoxy éthanol Hydroxyde de potassium H 2 O α-naphtol Ethanol qsp Trib-hydroxyméthyl-aminoéthane Acide chlorhydrique à 37 % Laurylsulfate de Na H 2 O Fast Blue BB 2-méthoxyéthanol 0,5g 20g 5g 0,5g 0,17g 1000 ml 7g 100 ml 40g 100 ml 6g 100 ml 25g 11 ml 10g 100 ml 0,35g 100 ml

32 85 Mode opératoire Sélection des colonies Après isolement et vérification de l appartenance de la souche à identifier au genre Streptococcus : - nous avons prélevé une colonie bien isolée et nous l avons mise en suspension dans 0,3 ml d eau stérile ; - nous avons ensuite inondé une boîte de gélose Columbia au sang de mouton avec cette suspension ; - la boîte a été incubée heures à C en anaérobiose. Préparation de la galerie - Réunir fond et couvercle d une boîte d incubation et répartir environ 5 ml d eau distillée dans les alvéoles pour créer une atmosphère huide. : - Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boîte. - Sortir la galerie de son emballage individuel. - Placer la galerie dans la boîte d incubation. Préparation de l inoculum Après avoir ouvert une ampoule de suspension Medium, nous avons à l aide d un écouvillon, prélevé toute la culture préalablement préparée afin de réaliser une suspension très dense (opacité supérieure à 4 de Mc FARLAND). Inoculation de la galerie - Dans la première moitié de la galerie (tests VP à ADH), nous avons réparti la suspension précédente en évitant la formation de bulles : *pour les tests VP à LAP : environ 100 µl dans chaque cupule ; *pour les tests ADH : remplir uniquement le tube.

33 86 - Dans la deuxième moitié de la galerie (tests RiB à GLYG : * nous avons ouvert une ampoule d APiGP Medium et y avons transféré le reste de la suspension, soit environ 0,5 ml ; * nous avons réparti cette nouvelle suspension dans les tubes uniquement. - Nous avons rempli les cupules des tests soulignés ADH à GLYG avec de l huile de paraffine en formant un ménisque convexe puis refermé la boîte d incubation. Lecture de la galerie Après 4 heures d incubation, nous avons ajouté les réactifs : * test VP : 1 goutte de VP1 et VP2 * test HiP : 2 gouttes de NIN * test PYRA, α-gal, β-gur, β-gal, PAL, LAP : 1 goutte de ZYM A et ZYM B. Après 10 mn, la lecture est effectuée en se référant au tableau de lecture.

34 87 Tableau XVIII : Lecture de la galerie API Streptocoques RESULTATS Tests Substrats Réactions /Enzymes Négatif Positif VP1 + VP2/jusqu à 10 mn VP pyruvate Production d'acétoïne Rose-Rouge Incolore NIN/jusqu à 10 mn HiP Hippurate Hydrolyse Incolore/Bleu pâle Bleu foncé/violet ESC Esculine β-glucosidase PYRA Pyrrolidonyl-2- naphtyl amide Pyrrolidonyl arylamidase 4H 24H 4H 24H Incolore jaunepâle Incolore jaunepâle gris-clair Noir gris noir ZYM A + ZYB B / 10 mn (PYRA à LAP) Incolore ou orange très pâle Orange α-gal 6 Bromo-2- naphtyl α-d galactopyranoside β-galactosidase Incolore Violet β-gur Naphtol AS-BI β-d-glucuromatoside β-glucuronidase Incolore Bleu β-gal 2-Naphtyl β-dgalactopyranoside β-galactosidase Incolore ou violet très pâle Violet PAL 2-naphtyl phosphate Phosphatase lcaline LAP L-leucine-2- naphtylamide Leucine arylamidase Incolore orange ADH Arginine Arginine dihydrolase Jaune Rouge RiB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD Ribose L-arabinose Mannitol Sorbitol Lactose Tréhalose Inuline Raffinose Amidon Acidification Rouge Orange / Rouge 4H 24H 4H 24H Orange / jaune GLYC Glycogène Acidification Rouge ou Orange Jaune franc Jaune

35 88 V.2.3. La Microméthode d identification System Micro CSG STREPTOCOQUES Il s agit d une méthode miniaturisée permettant la mise en évidence d activités enzymatiques, de la fermentation des sucres et de la croissance en milieu hostile. Avec 15 tests biochimiques, il permet de faire un diagnostic de groupe ou d espèces de streptocoques (non groupables). Principe Les galeries CSB Streptocoques permettent la mise en évidence d'activités enzymatiques ou d'assimilation de substrats carbonés en milieu approprié (fermentation) ou hostile. Ces microplaques renfermant des substrats déshydratés sont ensemencées avec un inoculum qui reconstitue le milieu. Après incubation, la lecture des réactions est effectuée directement (virage de l indicateur coloré utilisé) ou après addition de réactifs de révélation. Mode opératoire Préparation de l inoculum Les souches conservées à 70 C dans un bouillon cœur cervelle + 10 % de glycérol sont régénérées dans un bouillon trypticase soja à 37 C pendant 24 heures avant d être repiquées sur gélose au sang ordinaire sous 5 % de CO 2 pendant 24 heures à 37 C pour les streptocoques et, sur gélose au sang cuit + gentamycine sous 5 % de CO 2 pendant 48 heures à 37 C pour les pneumocoques. La suspension bactérienne est préparée en délayant des colonies bien isolées dans 1 ml d eau physiologique par écouvillonnage.

36 89 La turbidité de la suspension est ajustée à l échelle 4 de l étalon standard de Mac Farland. Ensemencement et incubation - Nous avons distribué 100 µl d inoculum bactérien par microcupule de VP à BHS. - Nous avons versé le reste de la suspension bactérienne dans 1 ml de MEVAG STREPTO/STAPH. - Nous avons ensemencé les cupules de ARA à GLY avec le MEVAG STREPTO/STAPH ainsi inoculé (3 à 4 gouttes). - Les cupules ADH et tous les sucres sont fermés avec 2 gouttes d huile de paraffine. - Les plaques sont incubées à 37 C sur un plateau recouvert de papier buvard imbibé d eau pendant 24H. Lecture et interprétation La lecture repose sur le changement de la coloration initiale des différents milieux. Pour la plupart des milieux, la lecture s est faite directement, par contre pour d autres, elle a nécessité l addition de réactifs. La lecture des caractères est faite sur une fiche de lecture et l identification est rendue possible grâce à l utilisation du tableau d identification.

37 90 Tableau XIX : Lecture plaques Micro CSB Streptocoques Tests VP Substrats Glucose + pyruvate Production d acétoine Réactions /Enzymes Réactifs à ajouter 1 goutte de KOH 1 goutte de créatinine 1 goutte de naphtol Résultats positifs Rose - Rouge Résultats négatifs Incolore ESC Esculine β-glucosidase Noir Incolore ADH Arginine Arginine dihydrolase Rouge Jaune BHS Glucose Croissance en milieu hypersalé ARA L-Arabinose Jaune Violet MAN SOR TRE RAF Mannitol Sorbitol Trehalose Raffinose SOS Sorbose Fermentation Jaune Rouge INU LAC RIB AMD GLY Inuline Lactose Ribose Amidon Glycérol

38 91 VI LES ENTEROBACTERIES VI.1. REACTIFS VI.1.1. Réactifs pour enrichissement et isolement - BGT: Bouillon Glucosé Tamponné - BTS : Bouillon Tryticase Soja - Gélose EMB : Eosine bleu de méthylène VI.1.2. Réactifs pour l identification par la microméthode Micro CSB ENTERO VI Substrats pour identification - Sucres : Lactose, Glucose, Mannitol, Saccharose, Sorbitol, Rhamnose, Adonitol, Dulcitol, Inositol. - Milieu pour la recherche des décarboxylases : Milieu de FALKOW - Lysine décarboxylase : LDC - Ornithine décarboxylase : ODC - Arginine dihydrolase : ADC - Milieu urée - tryptophane - Milieu de CLARK et LUBS : VP - Bouillon au citrate de Simmons - Bouillon au citrate de Christensen - Bouillon au malonate - Solution ONPG - Milieu pour la recherche de la nitrate réductase. VI Réactifs de révélation - Créatinine à 1 % (VP2) - Potasse à 10 % (VP1)

39 92 - Alpha-naphtol (VP2) - Perchlorure de fer au 1/3 - Réactifs de KOVACS. VI Réactifs pour la conservation des souches bactériennes (cf page58) VI.2. - METHODOLOGIE VI.2.1. Préparation des différents milieux VI Milieux d enrichissement et d isolement des souches Bouillon Trypticase-Soja (cf page 58) Milieu Gélose EMB C est le milieu d isolement des entérobactéries ; il permet d obtenir des colonies de taille plus importante. Il est présenté sous forme de poudre déshydratée. Formule Réactifs Quantité - Gélose EMB 18,25g - Eau distillée 500 ml Porter à ébullition le mélange jusqu à dissolution complète. Stériliser par autoclavage à 121 C pendant 15 minutes. Refroidir à 60 C et agiter le milieu de façon à oxyder le bleu de méthylène (le milieu devient bleu) et à dissoudre le précipité qui est un constituant important du milieu. Répartir dans les boîtes de pétri.

40 93 VI Milieux de la microméthode d identification Micro CSB ENTEROBACTERIES VI Milieux liquides Préparation Les sucres Glucides Stérilisation Température et Durée Lactose 10 % Tyndalisation ou Filtration 60 C 30 min. x 3j Glucose 10 % Autoclavage 110 C 10 min. Mannitol 10 % Autoclavage 110 C 10 min. Saccharose 10 % Tyndalisation ou Filtration 60 C 30 min x 3j Sorbitol 10 % Autoclavage 110 C 10 min. Rhamnose 10 % Autoclavage 110 C 10 min. Adonitol 5 % Autoclavage 110 C 10 min. Dulcitol 2% Autoclavage 110 C 10 min. Inositol 5 % Autoclavage 110 C 10 min. MEVAG des Entérobactéries Il s agit d une base de culture pourpre, commercialisée sous forme de poudre déshydratée, servant à la différenciation de cultures pures basées sur la réaction de fermentation. Formule approximative par litre - Peptone de protéase n 2 10,0g - Extrait de Bœuf 1,0g - Chlorure de sodium 5g - Bromocrésol pourpre (BCP) 0,02g Mode d emploi Mettre 16g de poudre en suspension dans 1 litre d eau purifié. Autoclaver le mélange à 118 C pendant 15 minutes.

41 94 Autres milieux d identification Milieu de FALKOW (cf page 60) Milieu Urée Tryptophane (cf page 61) Milieu de CLARK et LUBS (VOGES PROSKAUER) (cf page 61) Milieu pour la mise en évidence de la gélatine Préparation de la gélatine - Gélatine 15g - Eau distillée 500 ml La solution est chauffée au bain-marie bouillant jusqu à la dissolution complète, refroidie à 45 C ensuite, on ajoute en mélangeant, activement 4g de charbon de bois en poudre fine. Le moulage se fait dans les moules de 0,5 cm sur une surface horizontale puis porté une demi-heure à la glacière. Démouler et faire séjourner les plaques pendant 24 heures dans la solution de formol suivant : - Formol de commerce à 40 % 1 volume - Eau distillée 69 volumes Découper ensuite en petits fragments de 0,5 cm de côté qui sont rincés à l eau courante pendant heures pour éliminer le formol. Les cubes lavés sont introduits dans des flacons contenant de l eau distillée pour être tyndalisés 1 heure à 60 C, 3 jours de suite.

42 95 Milieu au citrate de Simmons Formule Réactifs Quantité - Sulfate de magnésium 0,04g - Phosphate mono-ammonique 0,02g - Phosphate dipotassique 0,2g - Citrate trisodique 0,4g - NaCl 1g - Bleu de bromothymol 0,016g - Eau distillée 100 ml Dissoudre le mélange à chaud. Ajuster le ph à 7. Autoclaver à 120 C pendant 20 minutes. Milieu pour la recherche de H 2 S et l indole (SI) Formule Réactifs Quantité - Peptone de caséine 6g - Peptone de viande 1,98g - Tryptophane 0,9g - Citrate ferrique ammoniacal 0,06g - Thiosulfate de sodium 0,06g Ajuster le ph à 7,5. Autoclaver à 120 C pendant 15 minutes. Milieu au malonate et à la phénylalanine (MAL-PDA) C est une base de culture permettant la différenciation des entérobactéries utilisant le malonate. Il est commercialisé sous forme de poudre déshydratée.

43 96 Formule approximative par litre Réactifs Quantité - Extrait de levure 1g - Sulfate d ammonium 2g - Phosphate dipotassique 0,6g - Phosphate mono-ammoniaque 0,4g - Chlorure de sodium 2g - Malonate de sodium 3g - Dextrose 0,25g - Bleu de bromothymol 0,025g Mode d emploi Dissoudre 9,3g de poudre dans 1 litre d eau distillée, et agiter jusqu à dissolution complète. Ajuster le ph à 6,7 ± 0,2. Autoclaver à 121 C 124 C pendant 15 minutes. Milieu à l ONPG (cf page 61) Réactif de révélation Potasse à 10 % (VP1) - potasse 10g - eau distillée 100 ml Créatinine à 1 % (VP2) - créatinine 1g - eau distillée 100 ml Alpha-naphtol (VP3) - naphtol 1 6g - éthanol 60 C 100 ml

44 97 Perchlorure de fer au 1/3 - perchlorure de fer officinal 10 ml - eau distillée 20 ml Réactif de KOVACS - P-diméthylamino-benzaldéhyde 5g - Alcool amylique 75 ml - HCl pur 25 ml Dissoudre l aldéhyde dans l alcool au bain-marie à 60 C. Refroidir et ajouter l acide goutte à goutte en maintenant le récipient dans la glace. Conserver à 4 C en flacon ambré. Contrôle de qualité des milieux liquides Les tests étudiés pour ce contrôle sont ceux de la stérilité et de l efficacité. Test de stérilité (cf page 63) N.B. : L eau physiologique est mise dans les tubes allant de LDC à ONPG. Le MEVAG ENTERO est introduit dans les tubes allant de LAC à INO. Test d efficacité (cf page 64) N.B. : Le milieu de culture est la gélose EMB. L inoculum est ensemencé dans les cupules allant de LDC à ONPG. Pour les cupules allant de LAC à INO, l inoculum est ensemencé après mélange avec le MEVAG ENTERO.

45 98 Tableau XX : Plan des plaques pour contrôle d efficacité CSB LDC E. coli GEL Proteus mirabilis ODC Enterobacter cloacae CS MEVAG Entérobacter cloacae ENTEROBACTERIES Plaque des contrôles positifs ADH Enterobacter cloacae CC E. coli URE Klebsiella pneumoniae SH 2 Salmonella typhi IND E. coli VP Klebsiella pneumoniae MAL Klebsiella pneumoniae PDA Proteus vulgaris ONPG E. coli SOR Enterobacter cloacae LAC E. coli RMA E. coli GLU E. coli ADO E. coli MAN E. coli DUL Klebsiella pneumoniae SAC Shigella flexneri INO Klebsiella pneumoniae Plaque des contrôles négatifs LDC Enterobacter cloacae GEL E. coli ONPG Shigella flexneri ODC Klebsiella pneumoniae CS E. coli LAC Shigella flexneri ADH E. coli CC Klebsiella pneumoniae GLU Pseudomonas aeruginosa URE E. coli H 2 S E. coli IND Klebsiella pneumoniae MAN Shigella flexneri VP E. coli MAL E. coli PDA E. coli SAC Shigella flexneri SOR Shigella flexneri RMA Shigella flexneri ADO Salmonella typhi DUL E. coli INO Salmonella typhi Résultats La lecture se fait suivant le tableau de lecture de la microméthode MicroCSB Entérobactéries.

46 99 VI Milieux déshydratés Préparation Les milieux déshydratés ont été préparés après avoir obtenu et contrôlé la stérilité et l efficacité des milieux liquides. Distribution des milieux Nous avons réparti les milieux liquides préalablement préparés dans les puits des microplaques, à raison de 100 µl par substrats (milieux). Nous avons fait la distribution selon le dispositif suivant : Plaques de 20 puits LDC ODC ADH URE VP GEL CS CC SH 2 IND MAL PDA ONPG LAC GLU MAN SAC SOR RAM ADO DUL INO Déshydratation des milieux (cf page 66)

47 100 Contrôle de qualité Test de stérilité (cf page 67) Tableau XXI : Plan contrôle de stérilité des Microplaques CSB Entérobactéries LDC Eau physiologique stérile ODC Eau physiologique stérile ADH Eau physiologique stérile URE Eau physiologique stérile VP Eau physiologique stérile GEL Eau physiologique stérile ONPG Eau physiologique stérile SOR MEVAG CS Eau physiologique stérile LAC MEVAG RMA MEVAG CC Eau physiologique stérile GLU MEVAG ADO MEVAG SH 2 IND Eau physiologique stérile MAN MEVAG DUL MEVAG MAL PDA Eau physiologique stérile SAC MEVAG INO MEVAG Test d efficacité (cf page67) VI.2.2. Identification des souches bactériennes VI Isolement En vue d'obtenir des colonies des germes à identifier, les souches conservées à +4C ou 70 C ont été régénérées dans un bouillon trypticase soja (BTS) puis ensemencés sur une gélose EMB. L incubation se fait à l étuve à 37 C pendant 24 heures. VI Identification Examen macroscopique Les entérobactéries donnent sur milieu gélosé EMB, des colonies habituellement lisses, brillantes, de structure homogène (type «smooth» ou S).

48 101 Les colonies des bactéries du genre Klebsiella sont elles mucoïdes, plus grandes que les colonies S avec une tendance à la confluence. Examen microscopique A partir d'une colonie, nous avons confectionné un frottis que nous avons ensuite coloré au Gram. L'observation microscopique à l'objectif à immersion montre des bacilles à Gram négatif asporulés, immobiles ou mobiles par leur ciliature péritriche. Test à l oxydase Principe Sous l action d un cytochrome oxydase, le di-méthyl-paraphénylène diamine, incolore, est transformé en une semi-quinone violacée qui s oxyde rapidement pour donner un composé noirâtre. Technique Nous avons préparé une suspension épaisse de bactéries dans 0,5 ml d eau physiologique. Nous y avons rajouté le disque. Interprétation Une réaction positive se manifeste au bout de 30 à 60 secondes par la coloration violette de la suspension, persistant pendant 15 minutes environ. Résultats Les souches d entérobactéries sont oxydase négative. Remarque : Ne pas utiliser pour prélever les colonies à tester des anses métalliques chargés d oxydase qui pourraient être responsables d un résultat faussement positif.

49 102 Test API 20 ENTERO Le test API 20E est un système qui permet de faire le diagnostic d espèces des Entérobactéries, utilisant 21 tests biochimiques standardisés et miniaturisés. Principe La galerie API 20E comporte 20 microtubes contenant des substrats déshydratés. Les microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue le milieu. Les réactions produites pendant la période d incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à l aide du tableau de lecture et l identification est obtenue à l aide d un logiciel d identification. Composition des milieux et réactifs NaCl 0,85 % Médium 5 ml Chlorure de sodium Eau déminéralisée 8,5g 100 ml Suspension Médium 5 ml Eau déminéralisée Réactif TDA (5 ml) Perchlorure de fer H 2 O qsp 3,4g 100 ml Réactif JAMES Composant J2183 HCl 1N qsp 3,4g 100 ml Réactif VP1 Hydroxyde de potassium H 2 O 40g 100 ml Réactif VP2 α- naphtol éthanol 6g 100 ml Réactif NiT1 Acide sulfanilique Acide acétique H 2 O 0,4g 30g 70 ml Réactif NiT2 N,N-diméthyl-1-naphtylamine Acide acétique H 2 O 0,6g 30g 70 ml

50 103 Mode opératoire Préparation de la galerie Nous avons réparti 5 ml d eau distillée dans les boîtes d incubation pour créer une atmosphère humide, puis nous y avons placé la galerie. Préparation de l inoculum Après avoir ouvert une pré-culture sur gélose EMB 24H à 37 C, nous avons prélevé à l aide d une anse de platine, une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé. Nous avons préparé une suspension bactérienne avec une ampoule de suspension Médium. Inoculation de la galerie A l aide d une pipette, nous avons rempli les tubes et cupules des tests CIT, VP et GEL. Nous avons ensuite rempli les tubes (et non les cupules) des autres tests. Nous avons créé une anaérobiose dans les tests ADH, LDC, ODC, H 2 S, URE en remplissant leur cupule d huile de paraffine. La boîte d incubation a été refermée avec son couvercle et placée à l étuve à 37 C pendant heures. Lecture de la galerie Après 18 24H, nous avons lu les réactions conformément au tableau de lecture. Si trois tests ou plus (test Glu + ou -) sont positifs, révéler les tests nécessitant l addition de réactifs. - test TDA : ajouter une goutte de réactifs + AD : couleur marron-rougeâtre réaction positive

51 104 - test IND : ajouter une goutte de réactif JAMES : couleur diffuse réaction positive - test VP : ajouter une goutte des réactifs VP1 et VP2, attendre 10 mn couleur rose au rouge réaction positive - test NO2 : ajouter une goutte des réactifs NiT 1 et NiT 2 dans le tube Glu. Attendre 2 à 5 mn. couleur rouge réaction positive une coloration jaune réaction positive Elle peut être due à la production d azote : ajouter 2 à 3 mg de réactif Zn des cupule Glu. Après 5 minutes : tube jaune réaction positive couleur orange-rouge réaction négative Si le nombre de tests positifs (y compris le test Glu) est inférieur à 3, ne pas ajouter les réactifs. Inoculer 2 ampoules d API OF Médium pour vérifier ce métabolisme du glucose. Ensemencer un milieu de Mac CONKEY ; Vérifier la mobilité : inoculer une ampoule d API médium ou observer entre lame et lamelle au microscope Incuber la galerie 24 heures de plus. Ajouter les réactifs comme indiqué précédemment. Identification L identification est obtenue à l aide du logiciel d identification.

52 105 Tableau XXII: Lecture de la galerie API 20 ENTERO RESULTATS Tests Substrats Réactions/Enzymes Négatif Positif ONPG O-nitro-phényl-β-Dgalactopyranoside β-d-galactopyranoside Incolore LDC Lysine Lysine décarboxylase Jaune vert à gris bleuté ODC Ornithine Ornithine décarboxylase Jaune vert à gris-bleuté Jaune pâle à jaune vif Bleu à bleuviolet Bleu à bleuviolet URE Urée Uréase Jaune Rose-violet CIT Citrate de sodium Utilisation Jaune à jaune-vert Vert à bleu PPA Phénylalanine Phénylalanine désaminase Incolore Brun/orange MNT Malonate Utilisation jaune Vert à bleu ESC Esculine β-glucosidase incolore Gris à noir ARA XYL ADO RHA CEL MEL SAC TRE RAF GLU Arabinose Xylose Adonitol Rhamnose Cellobiose Melibiose Saccharose Trehalose Raffinose Glucose Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Bleu Bleu Bleu Bleu Bleu Bleu Bleu Bleu Bleu Bleu IND Tryptophane Vert pâle-jaune VP Pyruvate Vert pâle-jaune OX (voir notice du test oxydase JAMES/immédiat Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Vert à jaune Rose VP 1 + VP2 / 5-10 min Rose (voir notice du test oxydase