Les protéines. structure primaire : suite ordonnée de résidus d acides aminés liés par des liaisons peptidiques (= séquence).

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Amaury Alfred Malenfant
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1 Les protéines I Définitions et caractéristiques Les protéines sont des macromolécules biologiques constituées d une ou plusieurs chaînes d acides aminés. structure primaire : suite ordonnée de résidus d acides aminés liés par des liaisons peptidiques (= séquence). structure secondaire : conformation spatiale répétitive régulière de segments de la chaîne protéique (hélice, feuillet ). structure tertiaire : conformation biologiquement active (dite native) d une chaîne polypeptidique repliée en une structure tridimensionnelle. structure quaternaire : structure dans l espace adoptée par l association d au moins deux chaînes polypeptidiques distinctes en un multimère protéique. C. Lacombe 1 I Définitions et caractéristiques Les différentes structures des protéines Structure primaire Structure secondaire -Ala-Glu-Val-Thr-Asp-Pro-Gly- -AEVTDPG- Hélice Feuillet Structure tertiaire Structure quaternaire Domaine C. Lacombe 2 1

2 I Définitions et caractéristiques Une protéine est caractérisée par : le nombre de résidus d acides aminés qui la composent la nature des résidus l ordre de succession des résidus Ceux-ci sont reliés par la liaison peptidique La masse moléculaire des protéines s exprime en Da (daltons) et varie d 5000 Da pour les plus petites à Da pour les plus grosses. Un résidu d acide aminé ayant une masse moléculaire d 120 Da, on peut facilement évaluer le nombre d acides aminés formant une protéine à partir de la masse moléculaire de celle-ci. C. Lacombe 3 II - Structure primaire Liaison peptidique R 1 R 2 R 1 R 2 CH CH CH CH 3HN C - 3HN C - 3HN C NH C - Exemple : Résidu aminoterminal CH 3 CH 2 H CH 2 SH Liaison peptidique CH NH C CH NH C - 3HN C CH NH C CH 2 Ala 1 Ser 2 Cys 3 Gly 4 Alanyl 1 Séryl 2 Cystéinyl 3 Glycine 4 ASCG Résidu carboxyterminal C. Lacombe 4 2

3 Précipitation fractionnée (sulfate d ammonium) Compétition ions/protéines pour solvatation Centrifugation Il s agit principalement d ultracentrifugation (vitesse de rotation > tours par minute) Ultracentrifugation en zone Les protéines sont séparées selon leur coefficient de sédimentation dans une solution de centrifugation. La distance de migration dans un temps donné est fonction du PM et de la forme de la protéine. La solution de centrifugation est souvent un gradient de saccharose C. Lacombe 6 3

4 Chromatographies o Définition de la chromatographie : technique qui tend à séparer des molécules d'un mélange en fonction de leur différence d'adsorption (d'affinité, ou de solubilité) entre une phase stationnaire (immobile) et une phase mobile (qui les entraîne). o Chromatographie de partage (ou chromatographie sur couche mince) Migration de la phase mobile organique par capillarité sur un support poreux hydrophile. Plus les molécules sont hydrophobes, plus elles se laissent entraîner par la phase mobile. o Chromatographie par perméation de gel (tamis moléculaire) Grain de polymère Les grosses molécules ne peuvent pénétrer dans les mailles du réseau Les petites molécules diffusent dans la phase liquide contenue dans les mailles Les molécules les plus grosses sont éluées en premier 4

5 o Chromatographie sur résine échangeuse d ions Les molécules chargées s adsorbent réversiblement sur l échangeur d ions et sont relarguées de la résine en modifiant la composition ionique du solvant (force ionique ou ph) - S 3 Na - S 3 Na 2 ( 3 HN CHR CH) Particule de résine - S 3 3HN CHR CH S 3-3HN CHR CH 2 Na La Dialyse La dialyse est le transfert de molécules qui s établit spontanément, sous l influence de la différence des potentiels chimiques de cette molécule, des deux côtés de la membrane. Les grosses molécules ne peuvent traverser la membrane Membrane semiperméable Les petites molécules peuvent traverser la membrane 5

6 L électrophorèse o L électrophorèse sur couche mince Les ions de l échantillon migrent vers les électrodes de signes opposés. - - Cathode ligne de dépôt Anode L électrophorèse o L électrophorèse sur gel Dépôt de l'échantillon Cathode Plaques de verre (ou de plastique) entre lesquelles est coulé le gel Anode 6

7 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) (2) Le SDS (Sodium Docécyl Sulfate) dénature les protéines et les charge négativement PM kda - Le gel va ralentir la migration des grosses molécules : séparation des molécules en fonction de leur masse, les petites migrent plus loin dans le gel (plus près de l anode) C. Lacombe 13 Électrophorèse bidimensionnelle : un gel de polyacrylamide sur lequel a été réalisé une isoélectrofocalisation (IEF) est déposé au-dessus d un gel de polyacrylamide-sds (SDS-PAGE). Les protéines sont ainsi séparées dans la première dimension en fonction de leur phi et dans la deuxième dimension en fonction de leur PM. I : IEF Extrémité basique Extrémité acide phi II : SDS-PAGE C. Lacombe 14 phi PM 7

8 Protéolyse o Bromure de cyanogène (BrCN) provoque la rupture de la liaison peptidique après Met... NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C.. Ri CH 2 CH 2 S CH 3 Méthionine Ri 2... NH - CH - C - NH - CH - C Ri H 2 C CH 2 Homosérinelactone Ri2 NH - CH - C.. 3 C. Lacombe 15 Protéolyse o Trypsine hydrolyse la liaison peptidique côté C de Lys (K) et Arg (R) o Chymotrypsine hydrolyse la liaison peptidique côté C de Tyr (Y), Phe (F) et Trp (W) o La protéase V8 de Streptococcus aureus hydrolyse la liaison peptidique côté C de Asp (D) et Glu (E) (seulement de Glu dans certaines conditions de tampon) C. Lacombe 16 8

9 Séparation des peptides o Chromatographies o Électrophorèses o Finger-print (électrophorèse à ph 6,4 suivie d'une chromatographie dans un sens perpendiculaire, réalisée à l'aide d'une phase mobile organique) C. Lacombe 17 Analyse de chaque peptide! o Hydrolyse acide totale : HCl 6N, 24 heures, 100 C rupture de toutes les liaisons peptidiques MAIS destruction du Trp (W) et transformation Asn (N) Asp (D) et Gln (Q) Glu (E) par hydrolyse de la fonction amide o Détermination de la composition en acides aminés chromatographie par échange d ions et coloration à la ninhydrine C. Lacombe 18 9

10 A 570 nm D T S E G V Y F H K A M I L R Chromatographie par échange d ions C NH 3 A 440nm P C. Lacombe 19 rdre de sortie des acides aminés avec un tampon de ph ph Réaction d un acide aminé avec la ninhydrine (Schéma simplifié) H 3HN CH CH 2 ninhydrine R H Pourpre de Ruhemann* = 570 nm NH RCH C 2 * Dans le cas de la proline, le composé coloré absorbe à 440 nm C. Lacombe 20 10

11 = Détermination de l extrémité N-terminale * aminopeptidase : hydrolyse sélectivement la première liaison peptidique (puis la deuxième, etc) * réaction d Edman (qui permet un séquençage) N S C Phénylisothiocyanate (PITC) NH 2 N H - C CH H R1 Phénylthiohydanthoïne Acide aminé Phénylthiocarbamyl AA (PTH-Aa identifié par chomatographie) Détermination de l extrémité C-terminale * carboxypeptidase : hydrolyse sélectivement la dernière liaison 21 peptidique (puis l avant-dernière etc) S C C NH CH R1 N C S C NH CH R1 Rupture des ponts disulfures - oxydation par l acide performique CH - CH 2 - S - S - CH 2 - CH H - C - - H Pont disulfure acide performique 2 CH - CH 2 - S 3 - Acide cystéique Inconvénients : les résidus Met sont oxydés (en méthionine sulfone) et le Trp est détruit C. Lacombe 22 11

12 Rupture des ponts disulfures - réduction par le -mercaptoéthanol CH - CH 2 - S - S - CH 2 - CH 2 HS - CH 2 - CH 2 - H Pont disulfure -mercaptoéthanol S - CH 2 - H 2 CH - CH 2 - SH S - CH 2 - H Cystéine C. Lacombe 23 Rupture des ponts disulfures - réduction par le dithiothréitol CH - CH 2 - S - S - CH 2 - CH HSCH 2 - (CHH) 2 - CH 2 SH Pont disulfure dithiothréitol H S 2 CH - CH 2 - SH Cystéine S H C. Lacombe 24 12

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