Régulation du Glypican-3 par de nouveaux MicroARNs dans le Carcinome Hépatocellulaire

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1 Régulation du Glypican-3 par de nouveaux MicroARNs dans le Carcinome Hépatocellulaire Flora Cartier Sous la direction de Christophe Grosset Laboratoire de Physiopathologie du Cancer du Foie INSERM U1053 Université de Bordeaux Directeur: Jean Rosenbaum 24 septembre 2014

2 Nous déclarons aucun conflit d intérêt Régulation du Glypican-3 par de nouveaux MicroARNs dans le Carcinome Hépatocellulaire 24/09/14 2

3 Contexte scientifique Régulation des gènes par les micro-arns dans le cancer du foie chez l enfant et l adulte Carcinome hépatocellulaire (CHC) Le plus fréquent de tous les cancers primitifs chez l adulte Incidence mondiale annuelle: nouveaux cas/an Foie pathologique (cirrhose) Principales étiologies: VHB, VHC, alcool, diabète, obésité Mauvais pronostic 15% de survie après 5 ans 24/09/14 3

4 Le Glypican-3 (GPC3): une cible thérapeutique d intérêt Plusieurs anticorps anti-gpc3 en cours d essai précliniques et cliniques Protéine extramembranaire : Famille des protéoglycanes à sulfates d héparane Surexpression chez 72 % des patients atteints d un CHC Cytoplasme Marqueur diagnostique et pronostique Corécepteur: Activation de la voie Wnt/βcaténine (Midorikawa Y et al, 2003, Filmus J et al, 2013) Noyau Carcinogenèse hépatique 21/03/14 4

5 Les microarns: Des régulateurs post-transcriptionnels de l expression génique Les micro-arns: petits ARNs non codants ( 20 nucléotides) Régulateurs généralement négatifs de l expression génique Dégradation de l ARN messager Inhibition de la traduction Coiffe 5 RISC (RNA-induced silencing complex) 3 AAAAA Expression fortement altérée dans le cancer: OncomiRs: mir-21 Suppresseurs de tumeur: Let-7, mir-34a Noyau 24/09/14 5

6 Objectif de notre étude: Identification des microarns régulateurs de l expression du GPC3 mir-1271 (Maurel M et al, 2013, Hepatology) Rôle dans la carcinogenèse hépatique 24/09/14 6

7 1712 Principe du crible fonctionnel: Dual Fluorescence FunReg Crible 1 aire : Sélection de 30 microarns (Fold change GFP/Tomato - 0,5 et 0,5) 30 microarns Elimination de 10 faux positifs Crible 2 aire Spécificité de ciblage des 20 candidats 24/09/14 7

8 Effet des micrornas sélectionnés sur l expression endogène du GPC3 mirnas designation Effect /Probable site of interaction Membrane expression by Flow cytometry (% of effect) Total expression by Western blot (% of effect) N=4 Mann Whithney test, mean of percentage inhibition, *p 0.05, **p 0.01, p GPC3 mir-a -/ 3 UTR - 0,50-0,60 mir-e -/ 5 UTR - 0,50-0,36 mir-f - /3 UTR - 0,35-0,5 mir-g - /3 UTR - 0,35-0,3 * mir-d mir-b - /3 and 5 UTR - /3 and 5 UTR - 0,27 * - 0,30 * - 0,07 NS - 0,34 * mir-h - /3 UTR - 0,26 * -0,35 * mir-i - /3 UTR + 0,15 NS + 0,70 mir-c - /5 UTR - 0,22 NS -0,32 * mir-j - /3 UTR + 0,65 + 0,30 * mir-k + /3 UTR + 0,09 NS - 0,20 NS mir-l + /3 UTR - 0,20 NS - 0, 2 NS mir-m + /3 UTR 0 NS 0 NS mir-n - /3 UTR -0,09 NS 0 NS mir-o - /3 UTR - 0,10 NS -0,26 NS mir-p - /3 UTR 0 NS - 0,03 NS Si-GPC3 mir-q - /3 UTR 0 NS + 0,08 NS Si-ctl mir-a mir-e mir-f mir-g mir-j mir-b mir-h mir-c mir-d mir-r -/3 UTR - 0,05 NS -0,2 NS 24/09/14 8 mir-i Quantification par rapport à la quantité de protéines totales

9 4 micrornas sont moins exprimés dans le foie tumoral/péritumoral 19 patients atteints d un CHC mir-a Tissu tumoral Tissu péri-tumoral mir-b Mann Whitney test, mean + SD,*p 0,05, **p 0,01 p 0, (copy/µg total RNA) (copies/µg total RNA) mir-c NTL NTL Tumor ** Tumor (copies/µg total RNA) (copies/µg total RNA) NTL NTL umor umor (copies/µg total RNA) NTL mir-d 24/09/14 9 (copies/µg total RNA) NTL Tumor * Tumor (copies/µg total RNA) (copies/µg total RNA) NTL NTL umor umor

10 Ces 4 micrornas sont sous exprimés dans le foie tumoral/foie NT Foies non tumoraux N=20 CHC N=98 Relative expression of mir-4510 A NT mir-a CHC Relative expression of mir-203a-3p B NT mir-b * CHC Relative expression of mir-548aa C NT mir-c * CHC Relative expression of mir-548v D NT mir-d 24/09/14 10 * CHC

11 Effet de ces microarns sur la prolifération des cellules tumorales Huh-7 J0: Transfection des microarns dans les cellules Huh-7 J1- J3- J6: Mesure de la prolifération cellulaire Si control (si-ctl) Absorbance (492nm) Cell growth ** * si-ctl si-gpc3 mir-34a-5p Si-GPC3 200µm µm 200µm µm 0.0 Day 1 Day 3 Day 6 mir-34a-5p N=5 Two way ANOVA test, Bonferroni post test, *p 0,05, p µm µm 24/09/14 11

12 Effet de ces microarns sur la prolifération des cellules tumorales Huh-7 mir-a Absorbance (492nm) mir-4510 ** Day 1 Day 3 Day 6 si-ctl si-gpc3 mir-4510 mir-a N=5 200µm Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,01, p mir-b mir-203a-3p Absorbance (492nm) ** Day 1 Day 3 Day 6 si-ctl si-gpc3 mir-203a-3p mir-b N=5 200µm Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,05, p /09/14 12

13 Effet de ces microarns sur la prolifération des cellules tumorales Huh-7 mir-c Absorbance (492nm) mir-548aa ** Day 1 Day 3 Day 6 si-ctl si-gpc3 mir-548aa mir-c N=5 200µm Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,01, p mir-d Absorbance (492nm) mir-548v ** ** si-ctl si-gpc3 mir-548v mir-d 200µm 0.0 Day 1 Day 3 Day 6 N=5 Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,01, p /09/14 13

14 Effet des microarns sur l apoptose des cellules tumorales Huh-7 Etude de l activité des caspases 3/7 Marquage Annexine V- 7AAD Luminescence (RLU, Blank Subtracted) Caspase activity N=4 One way ANOVA test, Bonferroni post test, p /09/14 14 si-ctl si-gpc3 mir-4510 mir-203a mir-548aa mir-548v Percentage of apoptotic cells (%) si-ctl si-gpc3 Total apoptosis mir-4510 mir-203a mir-548aa mir-548v

15 CONCLUSION mirnas designation Effect /Probable site of interaction Membrane expression by Flow cytometry (% of effect) Total expression by Western blot (% of effect) Tumoral/Peri tumoral (19 patients) HCC (98)/ Heathy donors(20) Proliferation Apoptosis mir-a -/ 3 UTR - 0,50-0,60 YES mir-b - /3 and 5 UTR - 0,07 NS - 0,34 * NO mir-c - /5 UTR - 0,22 NS -0,32 * NO mir-d - /3 and 5 UTR - 0,27 * - 0,30 * NO 4 nouveaux microarns régulent l expression du GPC3 et sont sous-exprimés dans les tumeurs Ces 4 microarns inhibent la prolifération cellulaire mir-a induit l apoptose des cellules tumorales mir-1271 (Maurel M et al, 2013, Hepatology) La dérégulation de ces 5 microarns pourraient participer à la surexpression du GPC3 dans les tumeurs. 24/09/14 15

16 PERSPECTIVES Quel est le rôle des 4 microarns dans la carcinogenèse hépatique? Sénescence? Cycle cellulaire? Quel est le mode d action de mir-a? mir-a est prédit pour interagir avec l ARNm du GPC3 via sa région 3 NT mutation Quel est l effet de mir-a dans la croissance des cellules tumorales Huh-7 in vivo? Modèle de la CAM (membrane chorioallantoïdienne de poulet) 24/09/14 16

17 MERCI DE VOTRE ATTENTION Merci pour votre attention Laboratoire Physiopathologie du cancer du Foie, INSERM U1053 Jean Rosenbaum Remerciements: Equipe Cancer du foie: Christophe Grosset Sarah Lesjean Francis Sagliocco Emilie Indersie Martin Hagedorn Katarzyna Hooks Collaborateurs: INSERM U674 INSERM, Paris Jessica Zucman-Rossi Gabrielle Couchy Emilie Gelabale

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