Spectroscopie résolue en temps Détermination de durée de vie de fluorophores par déconvolution temporelle

Transcription

1 Séminaire GDR Monalisa - Ocobre 2003 Specroscopie résolue en emps Déerminaion de durée de vie de fluorophores par déconvoluion emporelle Roland REDON - Equipe ISO

2 FLUORESCENCE Emission de phoons de longueurs d'onde λ supérieures à la longueur d'onde d'exciaion λ e Evoluion emporelle du specre d'émission F(λ,) Analyse specroscopique Analyse emporelle

3 EVOLUTION TEMPORELLE L'évoluion emporelle de la fluorescence es déerminée par l'équaion différenielle : dn() d = 1 τ N() + e() e() : exciaion lumineuse, N() : nombre de molécules exciées, τ : durée de vie de la fluorescence.

4 ANALYSE TEMPORELLE Les echniques de mesure Echanillonnage Sroboscopie Compage de phoons Déecion de phase Specroscopie résolue en emps

5 ECHANTILLONNAGE Echanillonnage sur un signal Exciaion : laser impulsionnel Déeceur : phoodiode, ube PM Echanillonneur : oscilloscope, boxcar

6 STROBOSCOPIE Echanillonnage sur plusieurs signaux Source impulsionnelle rès sable

7 ECHANTILLONNAGE Phoodiode e oscilloscope numérique (300 MHz) Inégraion de oues les longueurs d'onde Impuls ion las e r Fluorescence de la chlorophylle Mesure effecuée par G. Faour e M. Riper (juin 96) Temps (ns)

8 COMPTAGE DE PHOTONS Fluorescence de faible inensié Phoon déecé 6 = 6. + ε Incrémen de la mémoire 6 Source impulsionnelle rès sable

9 DETECTION DE PHASE Exciaion coninue modulée en ampliude φ e() = A + Bsin( ω) a A B b N() N() = a + bsin( ω φ) e() an φ = ωτ Fréquence de modulaion : ~10 MHz Durée de vie τ : ~1ns Très bonne précision sur τ

10 SPECTROSCOPIE RESOLUE EN TEMPS TRES : Time Resolved Emission Specroscopy Combine la specroscopie d'émission e l'analyse emporelle du phénomène de fluorescence.

11 DISPOSITIF EXPERIMENTAL Cellule de mesure Déeceur inensifié Specromère Fibre opique UV V IR LASER Console OMA PC

12 DECROISSANCE EXPONENTIELLE Exciaion : impulsion à = 0, c'es-à-dire δ() Fluorescence : exponenielle décroissane f() = H().e τ δ() f()

13 CONVOLUTION TEMPORELLE e() e(1) δ( 1) e( 2 ) δ( 2 ) 1 2 e( 3 ) δ( 3 ) 3 e( 1 )H( 1 )e ( τ 1 ) o() e( 2 )H( 2 )e ( τ 2 ) e( 3 )H( 3 )e ( τ 3 ) o() = k e( k )H( k ) e τ k

14 e() CONVOLUTION TEMPORELLE o() o() o() = = k + e( k )H( e(' )H( k ) ' )e e τ ' τ k d' f : réponse impulsionnelle de la molécule o() = (e f )()

15 Signal de synchronisaion CHRONOLOGIE Impulsion laser 500 ns Fluorescence Pore (inensificaion) Reard Largeur Fluorescence inégrée Pour une longueur d onde λ donnée

16 Signal de synchronisaion CHRONOLOGIE Impulsion laser 500 ns Fluorescence Pore (inensificaion) Fluorescence inégrée Pour une longueur d onde λ donnée

17 Signal de synchronisaion CHRONOLOGIE Impulsion laser 500 ns Fluorescence Pore (inensificaion) Fluorescence inégrée Pour une longueur d onde λ donnée

18 Signal de synchronisaion CHRONOLOGIE Impulsion laser 500 ns Fluorescence Pore (inensificaion) Fluorescence inégrée Pour une longueur d onde λ donnée

19 Signal de synchronisaion CHRONOLOGIE Impulsion laser 500 ns Fluorescence Pore (inensificaion) Fluorescence inégrée Pour une longueur d onde λ donnée

20 Signal de synchronisaion CHRONOLOGIE Impulsion laser 500 ns Fluorescence Pore (inensificaion) Fluorescence inégrée Pour une longueur d onde λ donnée

21 REPONSE IMPULSIONNELLE Signal de synchronisaion Impulsion laser 500 ns Impulsion inégrée Jier Tou signal de fluorescence es convolué par la réponse impulsionnelle du sysème d'acquisiion. La forme de la réponse impulsionnelle dépend de la largeur de la pore d'inensificaion e de la disribuion du jier.

22 2 x REPONSE IMPULSIONNELLE Pore : 100 ns Coups Temps (ns)

23 2 x 105 REPONSE IMPULSIONNELLE Insabilié 1.4 Coups Temps (ns)

24 DECONVOLUTION TEMPORELLE 4 x 10 6 Taux de décroissance : (ns) Signal synhéique Signal mesuré 2.5 Coups Te mps (ns )

25 TRAITEMENT NUMERIQUE On modifie la valeur du paramère τ par dichoomie jusqu à ce que le signal synhéique coïncide avec le signal mesuré. Lorsqu on aein l écar minimal, on obien la durée de vie de la fluorescence. PREMIERS RESULTATS Fluorescéine Durée de vie calculée : 5,58 ns Durée de vie réelle : 5,1 ns Sulfae de quinine Durée de vie calculée : 20 ns Durée de vie réelle : 19,5 ns

26 QUELQUES RESULTATS Durée de vie de la fluorescéine : 5,1 ns ± 0,03 Durée de vie mesurée : 5,58 ns Durée de vie du sulfae de quinine : 19,5 ns Durée de vie mesurée : 20 ns