LA FECONDATION gamètes zygote embryon interaction gamétique Complexe cumulo-ovocytaire corona radiata cumulus oophorus pavillon ampoule

Transcription

1 LA FECONDATION Dr Nathalie Sermondade Service d Histologie- Embryologie- Cytogéné8que- Biologie de la Reproduc8on- CECOS Hôpital Jean Verdier, Bondy I- Définition II- Phénomènes préparatoires à la rencontre des gamètes A- Collecte et transport de l ovocyte dans les trompes B- Trajet du spz dans les voies génitales féminines III- Interaction gamétique D- Liaison secondaire à la ZP E- Traversée de la ZP F- Fusion des membranes plasmiques G- Activation de l ovocyte et formation des PN IV- Premier cycle cellulaire embryonnaire Définition de la fécondation Les gamètes matures : 2 cellules très différentes Fusion de deux cellules matures haploïdes, les gamètes, en une cellule unique diploïde et totipotente, le zygote, qui formera ensuite un embryon par divisions mitotiques multiples Au niveau cellulaire, dialogue moléculaire entre les deux gamètes = interaction gamétique I- Définition II- Phénomènes préparatoires à la rencontre des gamètes A- Collecte et transport de l ovocyte dans les trompes B- Trajet du spz dans les voies génitales féminines III- Interaction gamétique D- Liaison secondaire à la ZP E- Traversée de la ZP F- Fusion des membranes plasmiques G- Activation de l ovocyte et formation des PN IV- Premier cycle cellulaire embryonnaire A- Collecte et transport de l ovocyte dans les trompes Complexe cumulo-ovocytaire = ovocyte mature entouré par les cellules folliculaires formant la corona radiata et le cumulus oophorus Capté par les franges ou fimbriae du pavillon de la trompe Véhiculé vers l ampoule grâce aux cils et à la motricité tubaire Séjour d environ 72 h (faible activité contractile tubaire en post-ovulatoire, cf progestérone, et jonction isthmoampullaire fermée au niveau de l isthme) 1

2 B- Le trajet du spermatozoïde dans les voies génitales féminines Pas un simple transit Action des différents milieux du tractus génital féminin (glaire cervicale, liquide utérin, liquide tubaire) : - éliminer le liquide séminal - filtrer les cellules germinales immatures, les spermatozoïdes morts ou immobiles, les leucocytes, les bactéries - sélectionner les spermatozoïdes (mobilité, morphologie) - contrôler leur nombre - les «capaciter» 1. Le vagin T=0 après rapport Après éjaculation, dépôt au fond du vagin au contact du col de 40 à 600 millions de spermatozoïdes Coagulation de l éjaculat puis liquéfaction du coagulum en minutes Suspension dans le plasma séminal, essentiellement composé du produit des glandes annexes : vésicules séminales (60%) et prostate (30%). 2. Traversée du col utérin et glaire cervicale T = 30 minutes Hydrogel = système fibrillaire fait de longues chaînes glycoprotéiques réunies par des ponts disulfures. En période pré-ovulatoire, contact des spermatozoïdes avec la glaire cervicale = mucus abondant et fluide produit par glandes cervicales Seulement environ 1% des spermatozoïdes (3 M) traversent la glaire cervicale en se déplaçant à contre-courant 1ère barrière physiologique Libérations successives de spermatozoïdes depuis les cryptes cervicales en direction de l utérus 1er lieu de stockage En phase préovulatoire (oestrogènes), les fibres orientées parallèlement à l axe du canal cervical, forment un filet à mailles larges (30 µm) qui : - guide les spermatozoïdes - sélectionne les mobiles à trajet progressif linéaire - les isole du plasma séminal. Les spermatozoïdes qui n ont pas pénétré la glaire sont rapidement détruits par l acidité vaginale Après ovulation (progestérone), la production de glaire diminue et elle devient impénétrable aux spermatozoïdes du fait de mailles rétrécies, enchevêtrées (3 à 4 µm) 3. Traversée de l utérus et sphincter utéro-tubaire Col utérin ampoule tubaire = 30 minutes 4. Traversée des trompes utérines T = plusieurs heures après RS Spermatozoïdes présents dans l utérus dès les minutes suivant le RS (mobilité propre, cellules ciliées de l endomètre, contractions utérines) Sphincters utéro-tubaires contrôle leur pénétration dans la trompe 2 e barrière physiologique Environ spermatozoïdes pénètrent dans les trompes Isthme tubaire : ralentissement et immobilisation puis libération par vagues d une dizaine 2 e lieu de stockage Traversée de la trompe dans toute sa longueur jusqu à la cavité péritonéale (motricité tubaire et cellules ciliées) Liquide tubaire = sécrétion des cellules glandulaires + transsudation plasmatique + liquide folliculaire 2

3 5. Au contact du complexe cumulo-ovocytaire (CCO) Nombre de spermatozoïdes dans le tractus génital féminin Après ovulation, environ 100 spermatozoïdes sélectionnés dans l ampoule Au contact du CCO Possible attraction des spermatozoïdes par le CCO par molécules chémo attractives du liquide folliculaire? 1. Définition Transformation éphémère et réversible du spz éjaculé jusqu alors non fécondant Le spz mature n est pas fécondant lorsqu il est éjaculé Il est protégé lors de son stockage dans la queue de l épididyme et de son trajet dans VG mâles = «dé-capacitation» Modifications nécessaires à l acquisition de la fécondance subies dans les voies génitales femelles 2. Mécanismes successifs et facteurs de capacitation a- Enlèvement des protéines de revêtement = protéines de décapacitation Protéines acquises dans l épididyme ou provenant des glandes annexes, empêchent capacitation prématurée Les glycosaminoglycanes (GAGs) des voies génitales femelles fixent les protéines de revêtement qui possèdent un récepteur pour ces GAGs. L albumine et l acidité du milieu utérin (ph 6,5) permettent le détachement d autres protéines de surface non liées à la membrane par des liaisons covalentes. b- Enlèvement du cholestérol libre intercalé entre les chaînes de phospholipides Enlèvement du cholestérol libre par des accepteurs (albumine, lipoprotéines HDL et LDL) présents dans les sécrétions utérines et tubaires Augmentation de la fluidité de la membrane par mobilité des PL membranaires Pénétration massive de Ca++ Liaison du calcium à la phosphatidylsérine Déstabilisation de la phosphatidyléthanolamine qui quitte la bicouche lipidique et forme des micelles c- Élimination des résidus glucidiques L élimination des résidus glucidiques par des enzymes des voies génitales remanie les chaînes oligosaccharidiques des protéines de structure intermembranaires. 3

4 La capacitation entraîne une déstabilisation de la 3. Conséquences de la capacitation membrane plasmique dont les conséquences seront : le démasquage des récepteurs spermatiques permettant la reconnaissance et la fixation à la zone pellucide, la mobilisation des protéines (région périacrosomique) et la perméabilité au calcium, préparant à la réaction acrosomique et à la fusion, une hyper-activation du mouvement du spermatozoïde. Acrosome GalT ZP3 ßγ α ZP3 ZP3 4. Différences in vivo/in vitro Élimination du plasma séminal nécessaire pour permettre la capacitation In vivo : au cours du passage de la glaire cervicale, puis dans l utérus et les trompes. D autant plus courte qu on approche de l ovulation (oestrogènes). In vitro : lavage (centrifugation douce) ou migration ascendante dans un milieu contenant GAGS et accepteurs de cholestérol L influx de calcium augmente l activité adénylatecyclase, avec hydrolyse d ATP et élévation du taux d AMPc dans le spermatozoïde. La nage progressive linéaire devient circulaire. Période du cycle menstruel pendant laquelle un rapport sexuel peut être fécondant et suivi d une grossesse Dépend de la date d ovulation et de la durée de survie des gamètes Spermatozoïdes : 3 à 4 jours dans les cryptes de la glaire cervicale Ovocyte : peut être fécondé jusqu à 24 heures après son ovulation Au total : ne dépasse pas 5 jours J10-J15 I- Définition II- Phénomènes préparatoires à la rencontre des gamètes A- Collecte et transport de l ovocyte dans les trompes B- Trajet du spz dans les voies génitales féminines III- Interaction gamétique D- Liaison secondaire à la ZP E- Traversée de la ZP F- Fusion des membranes plasmiques G- Activation de l ovocyte et formation des PN IV- Premier cycle cellulaire embryonnaire - Ovocyte et spz se rencontrent dans l ampoule tubaire. - Interaction gamétique = phénomènes cellulaires aboutissant à la fécondation - 7 étapes Traversée du cumulus 2. Reconnaissance et fixation primaire à la zone pellucide (ZP) 3. Réaction acrosomique (RA) 4. Liaison secondaire à la ZP 5. Traversée de la ZP 6. Fusion des deux membranes plasmiques 7. Activation de l ovocyte et formation des deux pronuclei Ovocyte ovulé entouré par le cumulus oophorus = 3000 à 6000 cellules folliculaires enchâssées dans une matrice acellulaire riche en acide hyaluronique In vivo, seuls les spermatozoïdes capacités pénètrent le cumulus et la corona radiata tout en conservant un acrosome intact. Hyaluronidase non indispensable. In vitro, la grande quantité d enzymes fournie par la réaction acrosomique d une centaine de spz dissout la matrice hyaluronique avec dissociation des cellules et passage du spermatozoïde fécondant (acrosome intact). 4

5 La fixation primaire d un spermatozoïde à membrane plasmique intacte avec la ZP : débute par l apex, implique la ZP3 ovocytaire et des récepteurs spécifiques de la membrane plasmique spermatique recouvrant la partie antérieure de l acrosome. Maillage composé de plusieurs glycoprotéines appelées ZP1, ZP2, ZP3 et ZP4 ZP2 et ZP3 disposées en alternance et formant des filaments reliés par ZP1 Chaîne polypeptidique sur laquelle sont attachées des petites chaînes oligosaccharidiques Ces étapes requièrent une spécificité d espèce assurée par les oligosaccharides pellucidaires. La reconnaissance met en jeu des systèmes de liaison généraux comme ceux par lesquels les cellules se fixent à des lames basales ou des matrices extracellulaires. Systéme le mieux connu : β1,4-galactosyltransférase du spz qui reconnaît β-n acétylglucosamine de ZP3. Probables systèmes redondants. ZP4 aurait une activité de fixation et serait indispensable. Acrosome = granule sécrétoire dérivé de l appareil de Golgi recouvrant les 2/3 antérieurs du noyau du spermatozoïde Réaction acrosomique débute dès fixation primaire engagée grâce à cascade Ca-dépendante : ouverture de canaux calciques et élévation Ca2+ intracellulaire Zone équatoriale Fusion ponctuelle des membranes plasmiques et acrosomiques externes Formation de vésicules puis rupture avec libération du contenu enzymatique - Enzymes libérées = hyaluronidase, acrosine, β-n-acétylglucosaminidase - Action : modification de la zone pellucide de l ovocyte modification de la zone équatoriale du spermatozoïde pour préparer la fusion - Exposition des récepteurs de la membrane acrosomique interne indispensable à la liaison secondaire à la ZP 5

6 D- Liaison secondaire à la ZP E- Traversée de la ZP L ancrage du spermatozoïde est conforté par la liaison secondaire, lui permettant de continuer sa progression à travers la ZP. Fait intervenir ZP2 et protéines présentes sur membrane acrosomique interne dont proacrosine et SPAM-1 (membre de la famille des CAM = Cell Adhesion Molecules) Arrivée tangentielle F- Fusion des 2 membranes plasmiques Le spermatozoïde réagi qui a pénétré dans l espace périvitellin se place tangentiellement contre la membrane plasmique de l ovocyte. Au niveau du segment équatorial, dialogue du spermatozoïde avec les microvillosités de la membrane ovocytaire. La fusion des membranes plasmiques permet au spz de s enfoncer totalement dans le cytoplasme ovocytaire. La pièce intermédiaire et le flagelle sont incorporés sans fusion puis disparaissent. Processus non spécifique d espèce Intervention d un complexe multimoléculaire : - Spz : ADAM 2 (fertiline β) et ADAM3 (cyritestine) - Ovocyte : intégrines et tétraspanines (CD9) G- Activation de l ovocyte et formation des pronuclei La pénétration du spermatozoïde dans l ovocyte déclenche l activation ovocytaire = ensemble de modifications au niveau du cytoplasme et du noyau ovocytaires. 1. Mobilisation du Ca intracellulaire et oscillations calciques Fusion spermatique = signal provoquant une augmentation massive et transitoire de la concentration intracellulaire en calcium libre (Ca i ++) Elle permettra la réalisation du 1er cycle cellulaire. 6

7 1. Mobilisation du Ca intracellulaire et oscillations calciques Fusion spermatique = signal provoquant une augmentation massive et transitoire de la concentration intracellulaire en calcium libre (Cai++) Propagation de ce signal calcique à partir du REL en quelques secondes dans l ensemble de l ovocyte entraînant une série d oscillations calciques Fréquence de quelques minutes et durée de plusieurs heures (intensité et fréquence dépendantes de l espèce) Indispensables aux événements de l activation ovocytaire, mais aussi au développement embryonnaire - Formation d inositol triphosphate (IP3) - Libération brutale de Ca2+ à partir du RE - Élévation massive et transitoire de la concentration intracellulaire en Ca2+ 2. Réaction corticale 3. Reprise de la méiose et formation des pronuclei Formation du PN La fusion du spermatozoïde déclenche l exocytose de granules corticaux situés sous la membrane plasmique de l ovocyte. Début au niveau de la zone de fusion puis dans tout l ovocyte en quelques secondes = réaction corticale Les enzymes hydrolytiques (protéases) libérés par les GC provoquent des modifications physico-chimiques de la partie interne de la zone pellucide qui devient impénétrable à d autres spz assurant le blocage de la polyspermie Formation du PN L ovocyte reprend et achève sa 2e division de méiose expulsion 2e GP Les 23 chromosomes restés dans l ovocyte après l expulsion du 2e GP - s enfoncent dans le cytoplasme - se décondensent - s entourent d une membrane nucléaire pronucleus femelle (22µm) La tête du spermatozoïde s enfonce dans le cytoplasme ovocytaire Le noyau perd son enveloppe Les chromosomes se décondensent : - protamines histones ovocytaires - rupture des ponts disulfures sous l action de facteurs cytoplasmiques ovocytaires (rôle du glutathion) Une nouvelle enveloppe nucléaire se constitue à partir de vésicules du RE pronucleus mâle (24µm) 4. Redistribution des organites cellulaires Les mitochondries - Celles du spermatozoïde sont rapidement dégradées - Seules les mitochondries maternelles persistent dans le zygote Avant fécondation : réparties uniformément dans le cytoplasme Au moment de la fécondation : se regroupent autour des PN, puis migrent à chacun des pôles du fuseau de 1ère division de segmentation Le centriole - L ovocyte mature ne possède plus de centriole - Le spermatozoïde apporte son centriole proximal. Il fonctionne comme un centrosome ou centre organisateur des microtubules. A partir du centrosome s organise un demi-fuseau mitotique appelé spermaster - Rappel : le centriole distal du spz a dégénéré après avoir organisé le flagelle 7

8 Le spermaster («aster de microtubules») - attire le PN femelle - puis s étend à tout l œuf - entraîne les 2 PN au centre du zygote - disparaît en quelques heures. Toute anomalie du spermaster ou son absence (microinjection de têtes spermatiques isolées) aboutit à de graves perturbations des mitoses futures et donc de la segmentation de l embryon. I- Définition II- Phénomènes préparatoires à la rencontre des gamètes A- Collecte et transport de l ovocyte dans les trompes B- Trajet du spz dans les voies génitales féminines III- Interaction gamétique D- Liaison secondaire à la ZP E- Traversée de la ZP F- Fusion des membranes plasmiques G- Activation de l ovocyte et formation des PN IV- Premier cycle cellulaire embryonnaire Apparition des 2 PN = zygote Formation environ 6-7h après le début de la fécondation, en position périphérique. La réplication de l ADN (phase S) a lieu dans chaque PN indépendamment, environ 12h après le début de la fécondation Migration (rôle du spermaster) Accolement Polarisation des nucléoles Phase G2 pendant laquelle les PN migrent. Vers T = 18h, PN apposés et centraux, sans fusion = stade d amphimixie Leurs nucléoles (rrna) se polarisent et s alignent le long de la zone d apposition. 1 e division de segmentation et formation des 2 blastomères Les chromosomes restent groupés séparément, il n y a pas de fusion des PN. Chaque PN entre en prophase, les chromosomes paternels et maternels se condensent, les membranes nucléaires disparaissent. Les centrioles occupent les 2 pôles du premier fuseau mitotique. Les chromosomes se placent sur la plaque équatoriale du fuseau de 1ère division mitotique, c est le stade de syngamie, environ 30h après la mise en contact du CCO avec les spz. La fécondation est achevée, le développement embryonnaire commence. T = 30 HEURES PI T = 36 HEURES PI 8