TP3 Test immunologique et spécificité anticorps - déterminant antigénique

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1 TP3 Test immunologique et spécificité anticorps - déterminant antigénique Partie 1 : Spécificité d'un anticorps pour un déterminant antigénique du VIH La séropositivité pour le VIH correspond à la présence dans le sérum d'anticorps reconnaissant certaines protéines du virus, les antigènes viraux. La reconnaissance est la liaison spécifique d'un anticorps avec une zone particulière de la protéine, zone appelée déterminant antigénique. La protéine p24 du virus comporte plusieurs déterminants antigéniques, dont l'un appelé 5.3 utilisé pour le test de séropositivité. Ressources Partie 2 : Méthode d'ouchterlony C est une méthode d immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu elles ont suffisamment progressé. Si il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l œil nu : des complexes immuns se sont formés dans la zone de contact. Le temps de réaction est de l ordre de 24h avec produits réels. Il est de quelques minutes avec les produits de substitution utilisés ici. Matériel disponible Matériel nécessaire à la réalisation du test d'ouchterlony. Solutions de divers antigènes. Sérum à tester contenant un anticorps spécifique à un des antigènes fournis. Partie 1 Réaliser le protocole proposé et exploiter les résultats de façon à déterminer quel est l'anticorps (Ac1 ou Ac2) spécifique du déterminant antigénique 5.3. Partie 2 1. Concevoir une démarche d'investigation permettant de déterminer de quel antigène est spécifique l'anticorps présent dans le sérum à tester. 2. Réaliser le protocole fourni. 3. Présenter les résultats sous forme d'un schéma légendé. 4. Exploiter les résultats de façon à déterminer de quel antigène est spécifique l'anticorps présent dans le sérum à tester.

2 FICHE TECHNIQUE : Méthode d'ouchterlony Matériel - une boîte de Pétri contenant le gel d agar ; un tube emportepièce et un cure-dent, une micro-pipette, embouts - un récipient poubelle - sérum du lapin (= S) contenant des anticorps dirigés contre l antigène inconnu injecté - eau distillée (= E) - 4 solutions d antigènes protéiques :. pancréatine= P. caséine= C. hémoglobine= H. albumine de sérum de bœuf (BSA)=B Protocole Préparation du test 1. Utiliser le gabarit de perçage pour creuser à l aide du tube emporte-pièce les puits nécessaires dans le gel d agar. NB. Penser à bien superposer la marque de référence afin de repérer vos puits. 2. Éliminer les cylindres de gel avec le cure-dent si nécessaire. Réalisation des dépôts 1. Reporter le gabarit de perçage sur votre feuille et indiquer la disposition des produits à déposer dans les puits. 2. Remplir les différents puits avec 20 μl. NB. Chaque produit devra être prélevé avec une micropipette à embout propre, puis être déposé dans les puits sans débordement ni bulles et sans endommager le gel. 3. Fermer la boite 4. Après 20 minutes, observer les résultats sur fond noir. Appeler pour vérification. Exploitation Noter sur le gabarit le résultat du test. Déduire des résultats, quel antigène a été injecté au lapin.

3 FICHE TECHNIQUE : Spécificité d'un anticorps pour un déterminant antigénique du VIH 1. Localisation du déterminant antigénique 5.3 dans la protéine p24 du VIH - Logiciel Geniegen Matériel Protocole Le déterminant antigénique 5.3 est une partie intégrante de la séquence de la protéine p24. - Fichier : SVT_Fichiers/Geniegen/sida03.edi Séquences polypeptidiques : - de la protéine p24 - du déterminant antigénique 5.3. Localiser la partie de la séquence de la protéine p24 qui correspond au déterminant antigénique 5.3. Identifier les numéros des acides aminés correspondants. Appeler pour vérification 2. Détermination de l'anticorps spécifique au déterminant antigénique 5.3 de la protéine p24 du VIH - Logiciel Rastop Matériel Fichiers : SVT_Fichiers/Rastop/Anticorps RTOP2 - p24+ac1.pdb : association de la protéine p24 avec le fragment de l'anticorps Ac1 - p24+ac2.pdb : association de la protéine p24 avec le fragment de l'anticorps Ac2. Protocole Mettre en évidence les chaînes lourdes (H) et légères (L) des anticorps ainsi que la protéine p24 et son déterminant antigénique 5.3. Présenter les résultats à l'écran permettant d'identifier l'anticorps recherché. Légender et titrer les documents fournis. Appeler pour vérification

4 CORRIGÉ Partie 1 : Spécificité d'un anticorps pour un déterminant antigénique du VIH Le déterminant 5.3 correspond aux acides aminés 65 à 75 de la protéine p24. En colorant le déterminant antigénique 5.3 on observe qu'il est reconnu par l'anticorps Ac1. L'anticorps Ac2 reconnaît un autre déterminant antigénique de la protéine p24. Partie 2 : Méthode d'ouchterlony Démarche Pour déterminer l'anticorps présent dans le sérume de Lapin, il faut tester toutes les combinaisons possibles entre l'anticorps et les différents antigènes proposés. Il faut donc placer le sérum contenant l'anticorps dans le puits central et les différents antigènes dans les puits périphériques. L'obtention d'un arc de précipitation permettra de déterminer de quel antigène l'anticorps est spécifique. Résultats Exploitation On obtient un arc de précipitation entre le sérum et le puits contenant l'antigène B. L'anticorps du sérum est donc anti-albumine de bœuf.

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