Rennes Project in Bioinformatics

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1 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Rennes Project in Bioinformatics Analyse de données pour le séquençage haut-débit à visée diagnostique des cancers Service de Génétique Moléculaire et Génomique du CHU de Rennes Marie de Tayrac

2 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Médecine personnalisée, thérapies ciblées & marqueurs compagnons Augmentation du nombre de thérapies ciblées Augmentation du nombre de marqueurs compagnons URGENCE: Mise en place de nouvelles méthodes pour le diagnostic moléculaire

3 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Context du diagnos)c Maladie acquise évolu)ve Génome tumoral hétérogène Appari)on de résistance Muta)ons Drivers / Passengers Altéra)on diverses Recherche de biomarqueurs compagnons et prise de décision thérapeu)que Identifier les clones répondeurs et/ou résistants à une thérapie ciblée Adapter le diagnostic sur un ADN issu de multiples clones (fréquence allélique faible)

4 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Plateformes INCa Catalogue de 60 tests & Orienter le processus PermeCre le suivi de la maladie résiduelle Orienter la stratégie de traitement Déterminer l accès à une thérapie ciblée Sein - Trastuzumab (amplifica@on ERBB2) Poumon - Crizo@nib (transloca@on ALK) Colon - Cetuximab (muta@on voie RAS) Poumon - Gefi@nib (muta@on EGFR) Melanome - Vemurafenib (muta@on BRAF) Ovaire Olaparib (muta@on BRCA1/2)

5 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Plateforme de Géné)que Soma)que des Cancers de Rennes [Pr J. Mosser] Recherche systéma)que d altéra)ons géné)ques Muta@ons simples sur des hot-spots, exons en@ers ou zones d épissage Pe@tes inser@ons ou délé@ons Quelques chiffres: prélèvements, 3000 pa@ents / an Nbre%examens%/%patho% 1600" 1400" 1200" 1000" 800" 600" 400" 200" 0" 2008" 2009" 2010" 2011" 2012" 2013" 2014" 2015" 3500" 3000" 2500" 2000" 1500" 1000" 500" 0" Nbre%examens%/%an% HNPCC" Cancer"Colorectal" CBPNPC" Melanome" Glioblastome" GIST" CBPNPC_cfDNA" AcSe" PAOLA" Alexandra Lespagnol

6 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Mise en place du NGS à visée diagnos)que, les contraintes Haut-débit Nombre (60-80/semaine) Nombre marqueurs (> 5 kb de séquence sur 20 gènes) Rapide Délais de rendu de résultat (7 10 jours) Flexible Evolu@on des thérapies ciblées Econome (INCa) ADN Echan@llons précieux (exérèse, biopsie, ponc@on ) Sensible Prélèvements avec % cellules tumorales < 10% Hétérogénéité tumorale FFPE Qualité et quan@té d ADN médiocre Accrédita)on ISO 15189

7 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Protocole de produc)on des données 2 x 150 cycles Pre-amp Ampli Tagging-a1 DNA Sequencing Pre-amp Ampli Tagging-a2 2 Index / pa)ent Pre-Amplifica)on Amplifica)on (2304 wells) P5_CS1 Tagging CS1-Tagged TS P7_BC_CS2 CS2-Tagged TS P5 CS1 CS2 BC P7 ~130 amplicons 250bp Alexandra Lespagnol

8 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Difficultés de détec)on des variants soma)ques des tumeurs Ploïdie: chromosomiques (CNV, ) Hétérogénéité tumorale (clonalité) ie. allèle à allélique variable étudiés ADN fragmentés/dégradés Présence d ADN «normal» (% cellules normales) ie. allèle à frac@on allélique faible + Technologie PCR Séquençage Quel pipeline bioinforma)que pour ce type de diagnos)c?

9 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle Solu)ons apportées Développement d un pipeline «maisons» incluant des briques «classiques» tout en affinant (adaptant) l étape de et en facilitant le preprocessing alignement annota)on calling rendu diagnos)c

10 Bioinforma)que et Biologie Computa)onnelle AAP INCa 2013, Structuring of Next Genera)on Sequencing for Diagnos)c Purposes in Cancer Mise en place d un pipeline d analyse dédié au diagnos@c moléculaire des tumeurs solides (A. Aliouat) Benchmark de pipelines dédiés à la détec@on de variants à frac@on allélique variable (T. Cuppens) Mise en place d une interface pour le rendu diagnos@c en NGS et solu)on de transfert et de partage de données et d algorithmes (F. Denoual)

11 Pipeline d analyse Soma)c AlteRa)on Detec)on - INca Fichiers.fastq 1 pa0ent = 2 index Appel des variants Contrôles qualité des librairies et amplicons Filtrage des séquences Alignement des séquences Annota0on des variants Sélec0on des variants selon la pathologie Répar00on par groupes d amplicons Données alignées Prépara0on des données Iden0fica0on des variants Généra0on des résultats

12 Phase 1 Data processing 1 pa)ent = 2 index Etape 1: Filtrage des reads en fonc@on de leur qualité moyenne Etape 2: Alignement (BWA-mem ou sw) - en sens et en an@-sens séparément Etape 3: Réalignement autour des INDELs GATK Etape 4: Split, répar))on des reads par groupe de produit de PCR (amplicons) Amyra Aliouat

13 Split des amplicons primer pas de calling! fréquence allélique vraie, pas de a.bam /!\ possible car double indexage! = réplica b.bam c.bam

14 Split des amplicons a1r1 a1r2 a2r1 a2r2 Fichiers d alignements totaux (IGV) Fichiers d alignements séparés en groupes d amplicons non chevauchants Amyra Aliouat

15 Phase 2 Variant Calling Etape5: Lecture des alignements de séquences base par base par index et sens de sequençage Etape 6: Filtrage des posi@ons variables Etape 7: Annota@on ANNOVAR Etape 8: Appel des variants selon arbre décisionnel Amyra Aliouat

16 La «réalité» se trouve dans les.bam Données pileup: synthèse de l informa@on base par base de l ensemble des reads alignées à une posi@on chromosomique. Amyra Aliouat

17 Arbre décisionnel 1 amplicon A pools 2 For each pool k, k (a1r1, a1r2, a2r1, a2r2) a1r1 posi@on i a1r2 a2r1 a2r2 DP i is the number of base sequenced at posi@on i f i,x,k x (A,C,T,G) frequency of nucleo@de X (or ins or del) at posi@on i in pool k 3 Calling decision tree for each posi@on i QC run density read Q ok QC library read Q % mapping ok QC amplicons DPi > 150 in all pools yes x and k f i,x,k >0.02 yes k f i,x,k >0.02 yes Mutated not ok not ok not ok no no All pa)ents NC pa)ent NC NC new experiment WT NC new experiment

18 Phase 3 Genera)ng results Cese étape génère des rapports contenant: Les informa@ons sur le run de séquençage Les librairies Les contrôles posi@fs Les contamina@ons poten@elles Les amplicons Par pa@ent un rapport rassemblant les informa@ons nécessaires pour rendre un diagnos@c Amyra Aliouat

19 Benchmark Données Pa)ents Validables Résultats rendus en diagnos)c 7 RUNs de MiSeq (Panel de 20 gènes) 45 colons 24 Mélanomes 70 Poumons Cibles: AMM, ATU, biomarqueurs EGFREx21, n = 4 EGFREx20, n = 2 EGFREx18, n = 1 NRASEx2, n = 1 NRASEx3, n = 5 Gene BRAF EGFR KRAS NRAS Exons Ex15 Ex18 Ex19 Ex20 Ex21 Ex2 Ex2 Ex3 EGFREx19, n = 10 BRAFEx15, n = 18 KRASEx2, n = 70 Pyroséquençage ARMs Alexandra Lespagnol

20 Benchmark Ou)ls de référence en Géné)que Soma)que Analyse des données pairées JointSNVMix, Soma9cSniper, Strelka, VarScan2 Analyse indépendante SNVMix, MuTect DIAGNOSTIC Mutect Mutect 2058 muta)ons Varscan Varscan 5361 muta)ons SARDINe 2801 SARDINe muta)ons Diagnos)c classique 114 muta)ons!!! Sur des zones restreintes!!! Tania Cuppens

21 Evalua)on de SARDINe vs diagnos)c classique Colon SARDINe KRAS BRAF MUT WT NC MUT DIAG WT NC Sensibilité 100 % Spécificité 100 % Poumon SARDINe EGFR KRAS BRAF MUT WT NC MUT DIAG WT NC Sensibilité % Spécificité 98.6 % Mélanome SARDINe BRAF NRAS MUT WT NC MUT DIAG WT NC Sensibilité 100 % Spécificité 93.33% Muta@on KRAS 35 G>A (p/g12d) retrouvée par pyroséquençage.!!! Réponse aux inhibiteurs d EGFR tyrosine kinase: pa@ent ayant une sensibilité réduite Tania Cuppens

22 Interface web Florent Denoual

23 Benchmark Florent Denoual

24 Interface web Fonc)onnalités Prépara)on des runs de séquençage de la Samplesheet pour le MiSeq Contrôles de la saisie (formats, ID des etc) Lancement du pipeline d analyse - SARDINe Exécu@on sur les noeuds du cluster CHU, traitement en parallèle Valida)on / Aide à la décision Consulta@ons des données générés (QC, Contrôles Pos/Neg, pa@ents) pour le diagnos@c Florent Denoual

25 Interface web

26 Interface web

27 Interface web

28 Interface web

29 Bilan Pipeline fonc)onnel u)lisé en diagnos)c de rou)ne [~ 60 Plus de Améliora)on de la stra)fica)on des pa)ents Panel Biomarqueur (INCa) EGFR%sensibilité% 10%% EGFR%résistance% 2%% PIK3CA% 7%% Panel NGS (19 oncogènes) EGFR%sensibilité% 11%% EGFR%résistance% 2%% PIK3CA% 7%% KRAS% 14%% wt% 50%% KRAS% 16%% wt% 67%% BRAF% 0%% BRAF% 2%% AKT1% 0%% PDGFRA% 0%% IDH1% 0%% MEK1% 1%% FGFR3% 1%% KIT% 3%% NRAS% 1%% MET% 5%% CTNNB1% 1%% Développement envisagé Couplage à d autres ou@ls de Calling (collabora@on P. Peterlongo, DiscoSNP)

30 Remerciements Thanks!! Bioinformatics Web design, development Florent Denoual E-science consultant HubZero and data management Yvan Le Bras Bioinformatics consultant algorithmic Dominique Lavenier Bioinformatics analyst large structural variations Wilfried Carré Bioinformatics Pipeline development Amyra Alliouat Bioinformatics consultants variants detection Claire Lemaitre & Pierre Peterlongo Bioinformatics design, statistics Marc aubry E-science consultant Bioinformatics consultant IT infrastructure data infrastructure Olivier Collin Audrey Bihouée Bioinformatics Benchmarking Tania Cuppens Biologist referent Alexandra Lespagnol Project Manager Marie de Tayrac Referent in cancer genetic diagnosis Jean Mosser

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