Oxydants et appareil respiratoire

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1 Oxydants et appareil respiratoire Jorge Boczkowski Unité Inserm Université Paris 7

2 Plan Géneralités sur les radicaux libres Sources endogènes et systèmes anti-oxydants Particularités du système respiratoire Radicaux libres et physiologie respiratoire Radicaux libres et physiopathologie respiratoire

3 Quelques notions importantes. L oxygène (O 2 ) est apparu sur la terre il y a environ 2 x 10 9 années L oxygène est utilisé dans la respiration et il est incorporé dans divers substrats à des fins de detoxyfication (oxygénases) La réduction univalente de l O 2 donne lieu à la formation de radicaux libres de l oxygène (RLO) Les RLO sont produits en continu dans les cellules dans des nombreux processus biologiques Chez le rat, environ molécules d O 2 sont utilisées par cellule chaque jour, et 2% dont lieu à la formation de RLO

4 En chimie, l oxydation est définie comme une perte d électrons et la réduction, comme un gain d éléctrons, comme l illustre l oxydation de l ion ferreux en ion ferrique e - Fe 2+ Fe 3+ Les oxydases catalysenr l enlèvement d atomes d hydrogène d un substrat en utilisant l oxygène comme accepteur de l hydrogène. AH 2 (Red) A (Ox) 1/2O 2 Oxydase H 2 O

5 Géneralités 1 : équilibre oxydants/antioxydants Antioxydants Oxydants diminution des apports (vitamines) inactivation enzymatique modifications transcriptionnelles susceptibilité génétique (HO, GSH..) Production

6 Géneralités 2 : status redox vs stress oxydant Désequilibre oxydants/antioxydants Status redox vs Stress oxydant physiologie vs physiopathologie

7 Géneralités 2 : status redox vs stress oxydant Dröge W. Physiol. Rev. 2002

8 Géneralités 3 : diffussibilité des RLO RLO RLO RLO Rôle autocrine Rôle paracrine

9 Géneralités 4 : Les différentes espèces reactives Métabolites dérivés de l oxygène : O 2 - H 2 O 2 OH Métabolites dérivés de l azote : NO NO 2 N ONOO -

10 Sources d oxydants dans les cellules inflammatoires NADPH Oxydase O 2 O 2 - H 2 O 2, OH, HOCl

11 La NAD(P)H oxydase du neutrophile

12 Sources d oxydants dans les cellules inflammatoires NADPH Oxydase O 2 O 2 - H 2 O 2, OH, HOCl NOS MPO

13 Sources d oxydants dans les cellules de structure NOS Mitochondrie O 2 - H 2 O 2 Xanthine deshydrogenase/ oxydase COX - H 2 O 2 O 2 Oxydants ONOO NO NOS NADP(H) oxydase O 2 -

14 La NAD(P)H oxydase dans les cellules non-phagocytaires Homologues de la Gp91: NOX (1-5) Production d O 2 - : faibles quantités «basale» direction intra et extracellulaire Activée par AII, TNF, IL5 p22 induite par TNF

15 Les NOX modulent différentes fonctions cellulaires Trends Pharmacol Sci. 2003;24:471-8.

16 Production des RLO par la mitochondrie ONOO.- NO I H + O 2.- H + C H + Espace intermembranaire NAD + NADH II Q III IV 1/2 O 2 H 2 O Membrane mitochondriale interne Matrice FADH 2 FAD électrons

17 Le NO augmente la production d H 2 O 2 et diminue la consommation d O 2 des mitochondries de cœur isolées H 2 O 2 Cons. O 2 Poderoso et al. Arch. Biochem. Biophys. 1996

18 Géneralités 5 : Les différents systèmes antioxydants Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, GPX, etc) Systèmes non enzymatiques Antioxydants de haut poids moléculaire Prévention de la formation des RLO (catalase, peroxydases, chélateurs de métaux lourds) Antioxydants casseurs de chaînes (SOD, urate, vitamine E, bilirubine) Conversion des RLO en espèces moins toxiques Compartimentalisation des RLO en dehors des structures vitales

19 Un puissant système antioxydant : le système hème oxygénase (HO) hémoprotéines microsomes Hème O2 Fe3+ Fe2+ Fe3+ OH CO biliverdine Bilirubine NADPH NADP NADPH NADP NADPH cyt C réductase Heme oxygénase Fer Ferritine Contrôle du stock cellulaire d hème Effets biologiques propres HO-1 : isoforme inductible ; HO-2 : isoforme constitutive

20 Le système hème oxygénase : caractéristiques 3 isoformes : HO-1 inductible, HO-2 constitutive, HO-3 ubiquitaire, mais localisation préférentielle: HO-1 dans la rate, HO-2 dans le cerveau activité enzymatique identique, mais structure différente, produit de deux gènes différents. HO-1 induite par «le stress» (cytokines, RLO, métaux lourds, hème ): Présence dans le promoteur des nombreux eléments de réponse et sites de liaison pour facteurs de transcription : système d action «large» expression d HO-2 non modulable, sauf par corticoïdes; activité HO-2 sensible au stress oxydant (groupes thiols)

21 Le système hème oxygénase : fonctions Hème Régulation du stock d hème Régulation d l expression de certaines hémoprotéines : NOS et des COX Biliverdine bilirubine Antioxydante

22 Bilirubine : effet toxique ou protecteur? Neurotoxicité : Chez le Nouveau Né, l accumulation de bilirubine dans le plasma entraîne une encéphalopathie (> 300 µm) Protecteur : bilirubine <=> «Protecteur Tissulaire Endogène» (20-50 nm) In vitro : Chélateur des Radicaux Libres de l Oxygène Stocker R. Science 1987 Minetti R. Arch Biochem Biophys 1998 Effet cytoprotecteur (concentration nanomolaire) Doré S. Proc Natl Acad Sci 1999 Baranano D. Proc Natl Acad Sci 2001 Baranano D. Proc Natl Acad Sci 2002 In vivo : Diminution du TGF-β dans un modèle de fibrose pulmonaire Wang HD. Am J Respir Crit Care Med. 2002

23 Le système hème oxygénase : fonctions Hème Régulation du stock d hème Régulation d l expression de certains Hémoprotéines : NOS et des COX Biliverdine bilirubine CO Fer Métabolisme et stockage du fer Ferritine : antioxydante antioxydante Relaxation muscle lisse vasc. Antiaggrégant plaquettaire Messager intracellulaire, antiinflammatoire Neurotransmetteur Antiprolifératif CML vasc (poison!!!!!!)

24 Méthodes de dosage d oxydants (en général) Quantification de la production des RLO : O 2 - H 2 O 2 NO ONOO Dosage de produits dérivés de l action des RLO sur les : protéines lipides Cellule «vivante» Tissu / organe «ex vivo» Homogénat cellulaire/tissulaire Liquides (surnageants, lavages, etc)

25 Le contact direct avec le milieu extérieur constitue la caractéristique principale de l appareil respiratoires Sources et espèces oxydantes Mécanismes de défense antioxydante Pathologies liées au stress oxydant

26 Sources d oxydants dans l appareil respiratoire Sources exogènes : ozone (O 3 ), dioxyde d azote (NO 2 ), fumée de cigarette, pollution particulaire Sources endogènes : cellules inflammatoires cellules de structure

27 Oxydants et fumée de cigarette Fumée de cigarette : mélange complexe de 4700 espèces chimiques, incluant des oxydants. Deux phases : Phase gazeuze : RLO/puff (alkyl, peroxyl) : demi vie courte NO : ppm Aldéhydes réactifs Goudron (tar phase) : Nicotine RLO/gramme Radicaux plus stables que dans la phase gaz : semiquinone (O 2- ), H 2 O 2 Fer (prooxydant) Effet oxydant amplifié par la production de RLO par les cellules inflammatoires

28 Oxydants et pollution particulaire : particules diesel Les émissions Diesel constituent la source majoritaire de PM10 en milieu urbain représentant environ 40% de la pollution urbaine. Elles sont issues des moteurs de type diesel, dont le régime diffusionnel à combustion incomplète génère des suies sous forme de micro sphères de carbone agrégées les unes aux autres avec un diamètre aérodynamique moyen de 100 nm. La grande surface d'exposition qu'elles présentent permet à de nombreuses molécules issues de la combustion incomplète d'y être adsorbées (± 400), au premier rang desquelles on trouve les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), des sulfates, des métaux lourds et des oxydants.

29 Le métabolisme des HAP peut donner lieu à la production de RLO HAP Peroxydases P450s e - Radical HAP HAP quinone

30 Défenses antioxydantes : particularités du système respiratoire Nombreux systèmes antioxydants d activité croisée, de localisation épithéliale prédominante mucus («système Kamikaze») fluide de recouvrement épithélial et alvéolaire : GSH (concentration 100x > plasma) catalase ceruloplasmine, transferrine, ferritine, ascorbate, vitamine E, bilirubine Enzymes antioxydantes : épithélium bronchique +++(muscle lisse)

31 Pathologies respiratoires associées à un stress oxydant Emphysème et BPCO (tabac +++) Asthme (éosinophiles) Asbestose et silicose ARDS (PNN, macrophages) Fibrose pulmonaire (fibroblastes?) Hyperoxie OEdème pulmonaire de reperfusion (endothélium) Dysfonction des muscles respiratoires septiques (muscles) Présence de RLO rôle pathogène des RLO

32 La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) 1. Facteur de risque : Fumée de cigarette Pollution atmosphérique (pollution particulaire) 2. Inflammation chronique et remodelage du tissu pulmonaire Remodelage bronchique Hyperplasie épithéliale Fibrose péribronchique Épaississement muscle lisse Remodelage alvéolaire (Emphysème) Destruction des parois alvéolaires Augmentation du volume pulmonaire Trouble ventilatoire obstructif fixé

33 BPCO : anomalie de la balance oxydants / antioxydants Macrophages PNN Fumée de cigarette NO Fer O2.-, OH., HOCl, H 2 O 2 Défenses infections Inactivation des antiprotéases Peroxidation lipidique Altération du DNA Déficit en antioxydants Activation NFκB TNFα, IL-8 BPCO

34 Il existe une augmentation de la concentation d isoprostane dans le LBA chez des patients porteurs d une BPCO Montuschi P et al., AJRCCM 2000

35 Il existe une corrélation négative entre le VEMS et la concentration expirée d un marqueur de stress oxydant Paredi P et al., AJRCCM, 2000

36 Il existe une corrélation négative entre le VEMS et des marqueurs de stress oxydant plasmatique Variable (unités) TBARS plasma (nmol/l) Bilirrubine (mg/dl) Gluthaione (mg/dl GR) Coefficient de régression (± SE) p R 2 ajustée -11,12 ± 5,22 0,035 0,03 10,35 ± 5,90 0,082 0,04-0,24 ± 0,15 0,118 0,05 Schünemann H et al., Am. J. Epidemiol. 1997

37 Il existe une production accrue d anion superoxide par des leucocytes du LBA des fumeurs Morrison D et al., AJRCCM 1999

38 Il existe une production accrue d anion superoxide par des leucocytes sanguins de patients avec BPCO Agusti A et al., Thorax 2001

39 Il existe une diminution des défenses antioxydantes chez des patients avec BPCO TEAC (mmoles/l) 2 1,5 1 0,5 0 n=18 n=29 n=20 *** normal subjects stable COPD acute COPD Rahman I et al, AJRCCM, 1996 diminution des taux plasmatiques d ascorbate de vitamine C de β-carotène diminution de la vitamine E dans le lavage bronchique diminution du pouvoir antioxydant du sérum

40 La supplémentation orale en vitamine E corrige le déficit vitaminique local et systémique Pacht I et al., J Clin Invest, 1986

41 mais n apporte pas de bénéfice clinique! Rautalathi, AJRCCM, 1997

42 Cependant une baisse de l expression d HO-1 prédispose à la diminution accélérée du VEMS chez des fumeurs Gros fumeurs ECRHS I (GF) p p "GF & L+" Déclin non m±et (n) oui m±et (n) interaction vs autres VEMS L ± 29.7 (86) ± 29.5 (11) L ± 31.0 (570) ± 30.3 (81) VEMS/CVF L ± ± < L ± ± 5.4 Gunegou et al. J Med Genetics, 2006

43 Les antioxydants : une perspective thérapeutique? Nbses pathologies associées au stress oxydant Nbses preuves expérimentales de l effet bénéfique des antioxydants mais peu d études cliniques très concluantes Choix de la/les molécule(s). Associations? Biodisponibilité, liposolubilité des molécules (NAC?) le stress oxydant n est pas le seul élément pathogène. en attendant : prévention des carences alimentaires éviter tabac (+ pollution?)