Chromosomes et Cancer : Le modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)

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1 Chromosomes et Cancer : Le modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) Ecole d été de Biologie de Luminy 3 septembre 2007 Dr Marina Lafage-Pochitaloff Laboratoire de Cytogénétique Onco-hématologique CHU Timone enfants et Université de la Méditerranée, Marseille

2 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) Hémopathie maligne Pathologie de la souche hématopoiétique Syndrome myéloprolifératif chronique Evolution en 3 phases : Phase chronique : durée médiane = 4 ans Phase d accélération Phase aiguë : transformation en leucémie aiguë

3 Hématopoièse

4 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) Epidémiologie : Incidence = 10 nouveaux cas/ an / million d habitants Prévalence : en augmentation car diminution du taux de mortalité Age moyen au diagnostic : 54 ans Sex ratio : 1,4 homme pour 1 femme

5 Leucémie myéloïde chronique (LMC) au diagnostic : frottis de sang, objectif 20 Majorité de PN et de myélocytes Hyperleucocytose : polynucléose neutrophile et myélémie

6 Nowell and Hungerford, Science, 1960 «A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia» 1960 Culture de sang de LMC : délétion d un chromosome du groupe G (21 ou 22), le chromosome Philadelphie (Ph1 ou Ph) 1 ère anomalie chromosomique acquise caractéristique d une tumeur maligne

7 Caryotype humain Bandes G (à gauche) / Bandes R (à droite) ISCN, Cytogenet Cell Genet, 21, 6, 1978

8 1973 : Janet Rowley identifie l anomalie Ph comme une translocation t(9;22)(q34;q11)

9 CARYOTYPE Indication : LMC au diagnostic Caryotype sur : Moelle Conditions de culture : 48h avec synchronisation Marquage chromosomique: RHG Nombre de mitoses photographiées et analysées : 20 Résultats : Toutes les mitoses sont Philadelphie (Ph) positives sous forme de la translocation classique, t(9;22)(q34;q11). Il n a pas été décelé d anomalie clonale surajoutée. Formule chromosomique : 46, XY, t(9;22)(q34;q11) [20] Conclusion : LMC Ph positive

10 Philadelphia chromosome (Ph) : translocation de abl sur le 22 (Bartram C et al., Nature,1983) fusion de abl avec bcr (Shtivelman E et al, Nature,1985) BCR BCR-ABL ABL

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12 5 BCR- 3 ABL FISH probe

13 Dual color BCR-ABL FISH probe Ph positive CML : t(9;22)

14 BCR Dual (green)- color ABL BCR-ABL (red) FISH FISH probe probe : nuclei Normal cells P Ph positive cells <Ph h

15 FISH : valeurs seuils de specificité (cut-off level) Etablissement de la valeur seuil : FISH sur 5 témoins normaux 2 observateurs 200 cellules par témoin et par observateur > 90% de cellules avec 4 signaux (hybridation optimale) Valeur seuil = Moyenne + 3 écarts-type sur témoins normaux Résultat positif si > valeur seuil Selon le type de sonde et le type de cellules étudiées, les valeurs seuils varient entre 0.5 et 20%

16 BCR-ABL FISH probe : 5 BCR-3 ABL probe cut-off level : 10%

17 BCR-ABL extra-signal FISH probe : 5 BCR/5-3 ABL probe cut-off level : 1% 5 -

18 Transcrits BCR-ABL NB : Nomenclature bcr b2=e13 ; b3=e14

19 PCR BCR-ABL sur lignée de LMC K562

20 RQ-PCR /LMC : amorces (F et R) et sonde (P) EAC (Europe against cancer program, Gabert et al.,leukemia, 17, 2003)

21 Amplification MBCR-ABL Patient Plasmide 10 5 Plasmide 10 4

22 RQ-PCR et LMC Calibrateurs : plasmide avec un insert Mbcr-abl (MBCR) Plasmide avec insert ABL (gène contrôle) Expression des résultats (standardisé): Rapport nombre de copies BCR-ABL / nombre de copies du gène de contrôle (ABL): nombre de copies normalisé (NCN)

23 Indication : LMC au diagnostic Prélèvement : Sang Résultats : RQ-PCR Recherche du transcrit MBCR-ABL positive. Qualité de l ARN : très bonne (Ct ABL: 24) Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 10 4 copies du transcrit contrôle (ABL) : 7564 Valeur de référence (médiane) au diagnostic des LMC en phase chronique : 8709

24 Chromosome Philadelphie (Ph) et LMC au diagnostic (1) Ph présent dans 90% des cas de LMC au diagnostic : 85% des cas : Ph classique: t(9;22)(q34;q11) 5% des cas : Ph complexe : t(v;9;22)

25 LMC avec Ph variant complexe : t(6;9;22)(p23;q34;q11)

26 Chromosome Philadelphie (Ph) et LMC au diagnostic (2) Ph absent dans 10% des cas de LMC au diagnostic : 5% des cas, BCR-ABL positif en PCR 5% des cas : BCR-ABL négatif en PCR Compléter le caryotype par FISH BCR-ABL

27 LMC Ph negative BCR-ABL positive Sonde 5 BCR-3 ABL : insertion (22;9) 22 9 der (22) der(9)

28 Chromosome Philadelphie (Ph) et LMC au diagnostic (3) Ph absent dans 10% des cas de LMC au diagnostic : 5% des cas, BCR-ABL positif: Ph masqué dû à une insertion submicroscopique, ins (22;9) ou (9;22) 5% des cas : BCR-ABL négatif : LMC atypique, forme frontière SMP/SMD, ne répond pas à l Imatinib

29 Role oncogénique de BCR-ABL Daley GQ et al, Science,1990

30 Protéine normale ABL : Famille des ABL kinases ( Nonreceptor Tyrosine kinases ): ABL (ABL1) ARG (ABL related gene, ABL2) Drosophila ABL C.Elegans ABL Régulation morphogénèse et mobilité cellulaire par action sur le cytosquelette (actine) via l activation de récepteurs cellulaires (ex : PDGF-R) ABL, protéine ubiquitaire (exprimée dans tous les tissus), localisation nucléaire et cytoplasmique (navette) Pour revue : Hernandez SE, Trends in Cell Biology, 2004

31 Protéines Tyrosine Kinases

32 Protéine normale BCR : Protéine cytoplasmique Intervient dans les signaux cellulaires Domaine de dimérisation en N-terminal

33 DD : domaine de dimérisation SH : domaine SRC-homology (Goldman and Melo, NEJM, 2003)

34 Protéines ABL et P210 BCR-ABL (Goldman and Melo, NEJM, 2003)

35 (Goldman J and Melo JV, NEJM, 2003)

36 Protéine BCR-ABL : Localisation cytoplasmique et nucléaire Domaine SH1 (src homology domain 1) de la partie ABL contient le site kinase qui fixe ATP Domaine de dimérisation de la partie BCR : dimérisation de BCR-ABL entrainant l activation constitutive du site kinase de BCR-ABL

37 Principaux substrats phosphorylés par BCR-ABL : GRB-2 (Growth-factor receptor 2) SHC : (SRC homology containing protein) STAT5 DOK CRK CRK-like protein

38 Principales voies activées par BCR-ABL : RAS-MAP kinases STAT (signal transducers and activators of transcription) : augmentation de la production de facteurs de croissance myéloides: IL3, GM-CSF, G-CSF PI3K (Phosphatidyl Inositol Phosphate) MYC SRC family kinases NF-KB Pour revues : Ren R, Nature Reviews 2005; Delhommeau F et al, Cell Mol Life Sc, 2006

39 Conséquences de l activation de BCR-ABL Augmentation de la prolifération cellulaire Diminution de l adhérence au stroma médullaire (microenvironnement médullaire) Diminution de l apoptose

40 Traitement de la LMC en phase chronique : Traitement Tolérance Efficacité Hydréa (hydroxyurée) +++ +/- Allogreffe +/- - (GVH) ++++ (guérison) Interféron +/- ++ Imatinib (Glivec)

41 (Gleevec, Glivec, Novartis) STI-57 1 Inactive Active BCR-ABL Inactive Inactive inhibée par IM Activée par l ATP

42 SMP à éosinophiles avec t(5;12)(q33;p13) / TEL-PDGFRB Réponse à l Imatinib (inhibiteur de PDGFRB) à 8 mois

43 Suivi des LMC par cytogénétique : critères d évaluation Réponse cytogénétique majeure : Réponse cytogénétique complète : 0% Ph Réponse cytogénétique partielle : 1-35% Ph Réponse cytogénétique mineure : 36-65% Ph Réponse cytogénétique minime : 66-95% Ph Absence de réponse cytogénétique : % Ph NB : analyse d au moins 20 métaphases

44 Réponse cytogénétique au STI 571 (imatinib) des LMC en phase chronique (1) Kantarjian et al., NEJM, février patients en phase chronique résistants ou intolérants à l IFN : Réponse cytogénétique majeure* : 60% complète : 41% partielle : 19% Réponse cytogénétique mineure : 5% Réponse cytogénétique minime : 11% Absence de réponse cytogénétique : 24% *Obtention entre 3 et 19 mois

45 1106 pts LMC en phase chronique au diagnostic : 553 pts traités IFN +Ara-C vs 553 pts traités Imatinib O Brien et al., NEJM, février 2003 Figure 1. Kaplan Meier Estimate of the Time to a Major Cytogenetic Response

46 1106 pts LMC en phase chronique au diagnostic 553 pts traités IFN +Ara-C vs 553 pts traités Imatinib O Brien et al., NEJM, février 2003 Figure 2. Kaplan Meier Estimates of the Rates of Progression-free Survival Progression was defined by any of the following events, whichever came first: death, acceleratedphase or blast-crisis CML, loss of response, or an increasing white-cell count.

47 Patient MBCR : suivi Patient Plasmide 10 2 Plasmide 10 1

48 RQ-PCR MBCR-ABL Indication : LMC Mbcr positive traitée par Glivec depuis 1 an Prélèvement : Sang Résultats : Qualité de l ARN : bonne (transcrit contrôle :ABL) Recherche du transcrit MBCR-ABL positive. Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 10 4 copies du transcrit contrôle : 4 Valeur de référence au diagnostic des LMC en phase chronique : 8709 Taux de maladie résiduelle = 4/8709= =0.05%= 5x10-4 <10-3 Conclusion : Réponse moléculaire majeure

49 LMC : Niveaux de maladie résiduelle (European Leukemia Net, Baccarani et al, Blood, 2006)

50 LMC : Critères de réponse au traitement (European Leukemia Net, Baccarani et al, Blood, 2006)

51 LMC : Conduite à tenir en cas de réponse non optimale Dosage sanguin de Glivec Recherche de mutations dans le domaine kinase de ABL conférant la resistance au Glivec Recherche de donneur pour Allogreffe Autres inhibiteurs de tyrosine kinase actifs sur formes mutées (sur T315I): Dasatinib (Sprycel- BMS) Nilotinib (AMN -Novartis)

52 Mécanismes potentiels de résistance à l Imatinib (Glivec) Daub H et al. Nature Reviews,

53 Mécanismes potentiels de résistance à l Imatinib (Glivec) Daub H et al. Nature Reviews,

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55 Corm S, séminaire Novartis 2007

56 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) Evolution en 3 phases : Phase chronique Phase d accélération Phase aiguë (crise blastique ou phase blastique) : leucémie aigue myéloïde (2/3 cas) leucémie aigue lymphoïde (1/3 cas) : type B

57 LMC en phase chronique : prolifération et différenciation Moelle osseuse : moins de 10% de myeloblastes cliché Dr Sophy Laibe, IPC Marseille

58 LMC en transformation aigue : blocage de la différenciation Plus de 20% de blastes myéloïdes (LAM) dans la moelle osseuse cliché Dr Danielle Sainty,IPC Marseille

59 Hematopoièse

60 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) et caryotype Phase chronique : Ph isolé Phase d accélération et phase d acutisation (LA): Ph et anomalies chromosomiques clonales additionnelles

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66 BCR-ABL duplication der(18) der(22)

67 Anomalies chromosomiques clonales surajoutées au Ph Anomalies de nombre : trisomie 8 trisomie19 Anomalies de structure : Isochromosome 17q : i(17)(q10) ou idic(17)(p11) isoph : ider(22)t(9;22) t(3;21)(q26;q22) : evi1-aml1 Anomalie de nombre et de structure : duplication du Ph : +der(22)t(9;22)

68 LMC : Cinétique des populations cellulaires Roche-Lestienne C et al., Medecine/Science, décembre 2004

69 Junia V. Melo & David J. Barnes Nature Reviews Cancer 7, (June 2007)

70 Junia V. Melo & David J. Barnes Nature Reviews Cancer, 2007

71 Repartition des LAL enfant/ adulte ( d après Pui et al., NEJM, 350;15, 2004)

72 Survie sans événement des LAL de l enfant du St Jude s Children Hospital de 1991 à 1999 ( d après Pui et al., NEJM, 350;15, 2004)

73 Modèle de la protéine chimérique BCR-ABL 22 Ph Bcr Abl Bcr-Abl c-abl M SH domains SH3 SH2 SH1 / TK Kinase + - Transformation Pathologies v-abl P190 Bcr-Abl P210 Bcr-Abl Leucémie murine +++ LAL Ph (70%) ++ LMC (99%) et LAL Ph ( 30%) Translocation site

74 LAL-T avec fusion NUP214-ABL : aspect habituel ( amplification ABL par épisomes), sonde BCR-ABL ES Graux et al. 2004

75 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) : conclusion La majorité des hémopathies malignes et des cancers présentent des anomalies chromosomiques clonales dont certaines sont caractéristiques voire spécifiques de la tumeur Rôle diagnostique et pronostique de ces anomalies Clonage de ces anomalies : Identification de gènes impliqués dans la différenciation, la prolifération et l apoptose normale et maligne Mise au point de thérapeutiques ciblées en remplacement ou en complément de la chimiothérapie

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