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1 DES de athologie AFIA 21 novembre 2009 J. Audouin,, S. ain

2 IMMUNOHISTOCHIMIE Introduction I - Différentes méthodes AC conjugués Enzyme - anti-enzyme : A, AAA rotéine conjuguée : avidine, streptavidine Amplification par la tyramide olymère de dextran II - Enzymes et chromogènes III - Anticorps IV - réparation tissulaire 1. Fixation et inclusion en paraffine 2. Tissu congelé V - Contrôles VI - Quantification

3 IMMUNOHISTOCHIMIE rincipe Fluorochrome Enzyme Antigène Détection d une substance chimique dans un tissu ou dans une cellule par un anticorps (AC) dirigé contre cette substance. Les AC sont appliqués sur la section tissulaire (ou sur la cellule) pour se lier à l antigène (Ag) correspondant. Un système de détection est ensuite utilisé pour identifier le lieu de la réaction antigène-ac. Ce système de détection utilise des molécules marquées qui peuvent être visualisées : soit par un microscope à lumière blanche : enzymes soit par un microscope à fluorescence : fluorochromes

4 Antigènes (Ag) L antigène : molécule complexe, habituellement une glycoprotéine, immmunogène, capable d induire la production d AC chez un animal d espèce différente. Un antigène comporte en fait plusieurs déterminants antigéniques ou épitopes (3 à 8 acides aminés) dont la configuration est complémentaire du site AC des immunoglobulines qui leur correspondent. antigène Epitopes antigéniques

5 Anticorps (AC) Les anticorps : immunoglobulines comportant une paire de chaînes légères et une paire de chaînes lourdes reliées par des ponts disulfures Les chaînes lourdes et légères ont une région constante et une région variable. Les sites de liaison avec l épitope sont formés par les extrémités variables de chaque paire chaîne lourde-chaîne légère. Un anticorps monoclonal est dirigé contre un seul épitope antigénique. Un antigène comportant plusieurs épitopes peut être reconnu par plusieurs anticorps différents.

6 1 - Anticorps conjugués La molécule marquée est conjuguée à une immunoglobuline : soit l anticorps primaire (méthode directe) soit l anticorps secondaire (méthodes indirectes) Méthode directe Anticorps primaire (spécifique de l antigène) conjugué à la molécule marquée (enzyme ou fluorochrome) AC primaire conjugué avantages : rapidité peu de réactions non spécifiques double marquage Antigène inconvénients : sensibilité faible

7 1.2 - Méthode indirecte Anticorps primaire non conjugué se lie à l antigène Anticorps secondaire conjugué à la molécule marquée dirigé contre les immunoglobulines de l animal chez lequel est préparé l anticorps primaire Avantages : Sensibilité augmentée (AC primaire : plusieurs sites de liaison pour l AC secondaire) AC II conjugué AC primaire Inconvénients : Réactions croisées avec les Ig endogènes. Antigène

8 2 - Méthode enzyme-anti anti-enzyme Méthode utilisant des anticorps non conjugués Elle utilise un complexe soluble constitué par une enzyme (HR, A) et un anticorps dirigé contre l enzyme Séquence : 1. AC primaire non conjugué 2. AC de liaison 3. complexe enzyme-anti-enzyme L AC primaire et l AC du complexe enzyme-anti-enzyme doivent provenir de la même espèce animale afin que l AC secondaire puisse lier les deux AC ensemble Le nom de la méthode dépend de l enzyme utilisée : A (peroxydase-anti-peroxydase) AAA (phosphatase alcaline-anti-phosphatase alcaline) Avantages : sensibilité augmentée.

9 2 - Méthode enzyme-anti anti-enzyme Méthode utilisant des anticorps non conjugués Elle utilise un complexe soluble constitué par un enzyme (HR, A) et un anticorps dirigé contre l enzyme AC anti-enzyme enzyme Complexe enzyme anti-enzyme

10 Méthode enzyme-anti anti-enzyme Complexe A Complexe AAA Séquence : I. AC primaire non conjugué II. AC de liaison III. Complexe enzyme-anti-enzyme III II AC de liaison AC de liaison I AC primaire AC primaire Technique A Technique AAA L AC primaire et l AC du complexe enzyme-anti-enzyme doivent provenir de la même espèce animale afin que l AC secondaire puisse lier les deux AC ensemble Le nom de la méthode dépend de l enzyme utilisée : A (peroxydase-anti-peroxydase) AAA (phosphatase alcaline-anti-phosphatase alcaline)

11 3 - Méthodes streptavidine-biotine Méthode utilisant la grande affinité de la streptavidine pour la biotine. Streptavidine : Streptomyces avidinii, ph7, pas d hydrate de carbone. biotine : vitamine de faible poids moléculaire. La streptavidine a 4 récepteurs pour la biotine. La biotine peut être couplée aux anticorps et aux enzymes (enzyme biotinylé). La streptavidine peut être couplée aux enzymes Deux méthodes streptavidine-biotine sont fréquemment utilisées. Ces deux méthodes nécessitent un AC biotinylé comme AC de liaison Complexe streptavidine-biotine (SAC). Complexe tridimensionnel comportant de l avidine en excès et de la peroxydase biotinylée Streptavidine conjuguée-biotine (LSA). Septravidine conjuguée à l enzyme. Avantages : sensibilité. Inconvénients : biotine endogène dans de nombreux tissus (foie, rein,...)

12 Complexe streptavidine-biotine (SAC) S-AVIDINE AC II biotinylé S-avidine + peroxydase biotinylée AC primaire Complexe streptavidine - iotine : SAC

13 Complexe streptavidine-biotine (SAC). Complexe tridimensionnel comportant de l avidine en excès et de la peroxydase biotinylée. AC II biotinylé AC primaire

14 Streptavidine conjuguée-biotine (LSA) Septravidine conjuguée à l enzyme S-AVIDINE AC II biotinylé Streptavidine - peroxydase AC primaire

15 4 - Amplification par la tyramine Catalysed Reporter Deposition (CARD) ou Catalysed Signal Amplification (CSA) rincipe : la peroxydase catalyse la formation de radicaux tyramine. Ces radicaux se lient de façon covalente avec les protéines de proximité. T + S-AVIDINE Tyramine biotinylée Avidine-peroxydase

16 4 - Amplification par la tyramine Méthodologie : Technique conventionnelle : LSA peroxydase SAC peroxydase Incubation avec la tyramine biotinylée et H2O Révélation de la tyramine biotinylée par S.avidine-peroxydase ou SAC-peroxydase. III S-AVIDINE S-AVIDINE Technique CSA V S-AVIDINE I II S-AVIDINE I. AC primaire II. AC secondaire III. SA- peroxydase IV. Tyramine biotinylée V. SA- peroxydase IV T T T S-AVIDINE

17 MDH: CD30 SAC - DA MDH: CD30 CSA - DA

18 MDH: CD30 CSA - DA MDH: CD30 CSA - AEC

19 5 - olymère couplé à la peroxydase Ehanced olymer One step Staining (EOS) olymère couplé à de nombreuses molécules de peroxydase Méthodologie : AC primaire couplé au polymère-peroxydase olymère AC primaire Technique EOS

20 II ENZYMES Méthodes immunoenzymatiques : réaction enzyme-substrat pour convertir un chromogène non coloré et soluble en un produit final coloré insoluble Formule générale : enzyme + substrat complexe ES ES roduit coloré + Enzyme Ex : peroxydase eroxydase + H2O2 eroxydase H2O2 + Donneur d électron (par ex. DA) oxydation molécule colorée insoluble + H2O + oxygène Sélection des enzymes utilisables en immunohistochimie la conjugaison (AC, avidine,...) ne doit pas abolir l activité enzymatique l enzyme lié doit être stable en solution les produits de la réaction colorée doivent être détectables et stables.

21 1 eroxydase 40kD, racine de radis noir substrat : H2O2 activité endogène : lignée myéloïde, hémoglobine inhibition : H2O2 en excès Chromogènes DA AEC - produit brun, - insoluble dans l alcool et les solvants organiques - possibilité d intensification par le tetroxyde d osmium ou par des métaux lourds (cuivre, cobalt,...) - produit rouge - soluble dans l alcool montage en milieu aqueux.

22 MDH: CD30 SAC - DA MDH: CD30 SAC - AEC

23 MDH: CD30 CSA - DA MDH: CD30 CSA - AEC

24 Immunoglobuline : comparaison AEC et DA Kappa Lambda DA DA AEC AEC

25 2 - hosphatase alcaline hosphatase alcaline intestinale de veau, 100kD Substrat : esters de phosphate de naphtol Activité endogène : intestin, rein, ostéoblastes, cellules endothéliales, polynucléaires, etc... Inhibition de l activité endogène : lévamisole (pas de blocage de la A intestinale) Chromogènes Substrat naphtol AS-MX phosphate : - Fast Red, Fast lue produit rouge ou bleu soluble dans l alcool et les solvants organiques - New Fuchsin produit rouge insoluble dans l alcool Substrat 5-romo-4-chloro-3-indoxyl phosphatase (CI) - Nitro leu de Tetrazolium (NT) produit pourpre noir insoluble

26 III - ANTICORS Anticorps polyclonaux Antisérum produit par immunisation d un animal. Il est produit par différentes cellules et réagit avec différents épitopes de la molécule antigénique roduction : résentation : Avantages : lapin, chèvre, porc, mouton - antisérum total (bruit de fond) - fraction d Ig purifié - AC spécifique de l antigène (Ag) - faible coût - facilité de production - bonne affinité Inconvénients : - réactions non spécifiques (AC naturels) - bruit de fond - reproductibilité dans le temps - nécessité de purifier l Ag

27 Anticorps monoclonaux Les anticorps monoclonaux sont produits par des clones de plasmocytes. Les AC d un clone donné sont immunologiquement identiques et réagissent avec un seul épitope de l Ag. Avantages : - spécificité : un seul déterminant antigénique - AC standardisés permettant une nomenclature précise : CD, cytokératines,... - production permanente - absence de variation qualitative Inconvénients : - nécessité d AC présentant une grande affinité Limites : - AC dirigé contre un seul épitope. Si l épitope est détruit par la préparation tissulaire, la réaction sera négative - l épitope peut être présent dans des molécules différentes Ex : HNK-1 : Ag CD57 (cellules T ou NK) et protéine MAG, glycoprotéine associée à la myéline (cellules de Schwann) - la même molécule peut être présente dans des cellules différentes Ex : CD4 : lymphocytes T facilitants et histiocytes

28 Hyperplasie lymphoïde folliculaire : tissu fixé et inclus en paraffine IgD Ac monoclonal IgD Ac polyclonal IgD Ac polyclonal

29 Sélection des AC clone espèce animale, technique de préparation, classe d Ig concentration en AC spécifique date de péremption description de l Ag, indications sur les témoins positifs caractéristiques techniques ordre de grandeur de la dilution tampon de dilution réactivité en fonction des fixateurs prétraitement nécessaire conditions de stockage lyophilisés +4 C concentrés aliquots à -20 C dilués +4 C

30 IV- REARATION TISSULAIRE 1 - Fixation et inclusion en paraffine Avantages : - qualité de la morphologie cellulaire et tissulaire - facilité de conservation et de transport des blocs tissulaires - matériel usuel des pathologistes Inconvénients : - la plupart des épitopes antigéniques sont masqués ou détruits par les fixateurs uts de la fixation En immunohistochimie : - préserver l intégrité de l antigène - éviter l extraction, la diffusion et le déplacement des molécules En fait : les modifications des protéines au cours de la fixation ne sont pas toujours compatibles avec la préservation de l activité antigénique

31 1.2 - Différents fixateurs Fixateurs coagulants Ex. éthanol, méthanol, Carnoy préservent les Ag de poids moléculaire élevé (Ig, filaments, récepteurs, ) extraction des Ag de faible poids moléculaire Fixateurs par ponts protéiques Ex. Formaldéhyde 10 % formalin (solution du commerce), 4 % formaldéhyde ph neutre : acétate de sodium, carbonate de calcium, S réaction avec protéines: ponts méthylènes entre les chaînes polypeptidiques augmentation des ponts protéiques : ph acide, fixation longue stockage prolongé du formol : - formation d acide formique - formation de polymères (+++) qui augmentent les ponts protéiques Fixateurs mixtes Acides : ouin (acide picrique + acide acétique) AFA Attention : les acides sont responsables d altérations antigéniques +++

32 Notes sur les fixateurs Facteurs influençant la conservation antigénique nique : fixateur durée de la fixation facteurs locaux : ph, composition du compartiment cellulaire (Ex. : immunoglobulines) Epitopes antigéniques niques (3-8 8 AA) soit détruits, cassés soit masqués Une molécule contient de multiples épitopes antigéniques niques : intérêt des AC polyclonaux

33 1.3 Récupération antigénique Démasquage enzymatique Avantages des enzymes protéolytiques : démasquer des épitopes antigéniques cachés ou pliés par ouverture des protéines supprimer des agrégats de macromolécules empêchant l accessibilité à l antigène démasquer les ponts protéiques induits par les fixateurs diminuer le bruit de fond par destruction des sites protéiques de la substance fondamentale augmenter la pénétration des anticorps dans les tissus Inconvévients des enzymes protéolytiques ils peuvent couper ou détruire les Ag faux négatif Agents protéolytiques protéase pepsine trypsine

34 Chaleur Incubateur (bain marie), autoclave, micro-ondes ondes augmentation de la réactivité augmentation de l intensité du signal détecte des Ag non détectables après fixation : Ki-67, Ig de surface, CD20 (ouin) Micro-ondes ondes température : 100 C +/- 5 C cycles courts : 5 mn, x 1, x 2, x 3 Incubateur température : 95 C +/- 2 C 40 mn Solutions tampons pour l incubation Solutions tampons pour l incubation : citrate 10 mm, ph 6 EDTA ph 9, ph 9,9 UREE 2 M, 4 M

35 Augmentation de la pénétration de l anticorps Détergents à ajouter soit dans les tampons, soit dans l AC dilué triton X 100, Tween 20, saponine acétone enzymes protéolytiques

36 2 - Coupes au cryostat de blocs congelés Avantages : - conservation de la plupart des épitopes antigéniques Inconvénients : - congélation immédiate du tissu frais (prévoir le prélèvement congelé) - médiocrité de la morphologie cellulaire et tissulaire - difficulté de conservation et de transport des blocs congelés

37 Morphologie sur congélation TTF-1 sur congélation

38 TTF-1 extemporané TTF-1 sur tissu fixé

39 TTF-1 extemporané TTF-1 sur tissu fixé

40 2.1 - Congélation Congélation immédiate par immersion dans l azote liquide (-196 C) pendant 5 à 10 mn congeler, si possible, plusieurs fragments tissulaires (5 x 5 x 3 mm) la chaîne du froid ne doit plus être interrompue Les blocs congelés seront transportés, même pour une courte distance, dans l'azote liquide (ou dans de la carboglace à -60 C) Conservation des blocs congelés azote liquide congélateur à -80 C Coupes au cryostat (-( 20 C) Coupes régulières à 5-6 µm Séchage à l air, à température ambiante, pendant au moins 2 heures Fixation des coupes dans l acétone à +4 C, pendant 5 à 10 mn - soit techniquées immédiatement - soit stockées à -80 C

41 V - CONTROLES de QUALITE Validation de la technique et spécificité du signal ositifs Les contrôles positifs sont utilisés pour valider l AC primaire et les différentes étapes de la technique. tissu témoin contenant l Ag recherché témoin endogène +++ (préparation tissulaire + technique) Négatifs Un contrôle négatif est utilisé pour évaluer l intensité du bruit de fond non spécifique. omission de l AC primaire AC de la même espèce non immun absorption de l AC primaire avec l antigène purifié blocage des sites antigéniques par un AC d une autre espèce réparation tissulaire témoin endogène molécule présente dans tous les tissus : par ex. Vimentine

42 VI - QUANTIFICATION EN IMMUNOHISTOCHIMIE La quantification comporte : 1 - Nombre de cellules positives dans un tissu 2 - Intensité du signal immunohistochimique quantité d antigènes nes présents dans le tissu / les cellules? En fait, l intensité du signal pour un antigène donné : ne dépend pas uniquement de la quantité de l antigène dépend également de multiples facteurs techniques (durée de la fixation, épaisseur de la coupe tissulaire, méthode utilisée,...) Ces facteurs ont une grande variabilité et expliquent la difficulté d interpréter l intensité du signal immunohistochimique : Ex. Her-2 2 : lame témoin validée confirmation par technique FISH des cas douteux

43 I RUIT de FOND IHC : ROLEMES et SOLUTIONS - ruit de fond - Signal faible ou résultat négatif - Fausse positivité 1. AC primaire trop concentré Dilution 2. Sites électrostatiques a) blocage des sites non spécifiques (coupes congelées+++) - sérum normal (même espèce ACII) -SA b) détergent dans les tampons et/ou l AC - Triton, Saponine 3. Récepteurs R Fc a) Sérum normal (même espèce ACII) (coupes congelées +++) b) Fraction F(ab )2

44 4. éroxydase endogène ne a) H2O2 concentré b) H2O2 / Méthanol 5. hosphatase alcaline endogène Levamisole 6. AC pris au piège dans le tissu coupes, rinçages - coupes irrégulières ou décollées - séchage pendant la technique - rinçages insuffisants 7. Territoires de nécrosen 0 8. Antigènes nes phagocytés s (histiocytes) 0

45 II SIGNAL FAILE, FAUX NEGATIFS roblème difficile 1. Erreurs fréquentes 1.1. Erreur technique expérience du technicien 1.2. Réactif R détériord rioré Facteurs méthodologiquesm 2.1. réparation tissulaire surfixation : masquage des Ag sous-fixation : diffusion des Ag lavage coupes / blocs enzymes protéolytiques chaleur sites antigéniques niques masqués s dans l antigl antigène ne lié au tissu (ELISA +, RIA + : spécificité de l AC mais ne précise pas si l AC est utilisable sur des tissus)

46 2.2. Technique d IHC Coupes tissulaires étalement à température < 45 C séchage 3h à 37 C ou 20 mn à 58 C erméabilisation détergent Triton X-100 Tween 20 Tampons vérifier le ph de tous les tampons (ph ) Température d incubationd 22 C 4 C 37 C Durée e d incubationd AC polyclonaux 30 mn AC monoclonaux 1 à 2 h La durée d incubation est fonction de la dilution Sensibilité de la méthodem et de la température d incubation AC polyclonaux à 4 C - incubation 18 à 48h - dilution type de méthode enzyme (eroxydase/phosphatase alcaline) chromogènes

47 3. Anticorps Dilution Effet prozone (A, AAA) Affinité : AC polyclonaux Stockage des AC AC concentrés AC dilués -20 C (aliquots) +4 C (+SA, +azide de sodium) Quelques problèmes Contamination azide de sodium Destruction par des protéases inhibiteur des protéases Détachement du marqueur de l AC

48 Faut-il faire un compte rendu d immunohistochimie? Exemple : Lymphome folliculaire d un ganglion du col de la vésicule biliaire GANGLION DU COL DE LA VESICULE ILIAIRE Ganglion mesurant 1 cm de grand axe. Le tissu ganglionnaire est occupé par de multiples formations nodulaires, de petite taille et de taille moyenne, tassées les unes contre les autres. Ces follicules, dépourvus de zone du manteau, homogénéises, sont constitués d une majorité de centrocytes et de rares centroblastes. Absence de macrophages à corps tingibles et de mitoses. Les territoires interfolliculaires, la population cellulaire est constituée de lymphocytes, petits et moyens, à noyau plus ou moins irrégulier.

49 ÉTUDE IMMUNOHISTOCHIMIQUE SUR TISSU FIXÉ ET INCLUS EN ARAFFINE CD20 (L26, Dako) : positivité membranaire vive de la population lymphoïde constituant les nodules. Entre les nodules, 60 % de la population lymphoïde est positive. CD3 (S7, Neomarkers) : 40 % de lymphocytes positifs, situés entre les nodules. CD10 (5C6, Tebu) : vive positivité des cellules constituant les nodules. Entre les nodules, 40 % des cellules lymphoïdes sont positives. CL-2 (124, Dako) : positivité cytoplasmique vive de l'ensemble des cellules lymphoïdes dans les nodules et entre les nodules. La population lymphoïde tumorale exprime CD20, CD10 et cl-2. CONCLUSION Localisation ganglionnaire (col de la vésicule biliaire) d'un lymphome folliculaire de grade 1 (classification OMS 2008).

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