ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES ETUDE DES MAPK ACTIVEES PAR DES ELICITEURS DES REACTIONS DE DEFENSE CHEZ LE TABAC

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1 MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE, DE LA RECHERCHE ET DE LA TECHNOLOGIE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE présenté par Annick CHILTZ pour l'obtention du diplôme de l'ecole Pratique des Hautes Etudes. ETUDE DES MAPK ACTIVEES PAR DES ELICITEURS DES REACTIONS DE DEFENSE CHEZ LE TABAC soutenu le 17 septembre 2001 devant le jury suivant : Monsieur Yves BENYAMIN, président. Monsieur Ali BETTAÏEB, rapporteur. Madame Angela LEBRUN-GARCIA, examinatrice. Monsieur Silvio GIANINAZZI, examinateur. Monsieur Francis MARTY, examinateur. Laboratoire d'immunologie et Immunothérapie des Cancers. Directeur : Pr J-F. JEANNIN E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre) 7, Bd Jeanne d'arc EPHE Banque de Monographies SVT 1

2 21000 DIJON UMR INRA-Université BBCE-IPM Directeur : Dr S. GIANINAZZI 17 rue Sully - BP Directeur adjoint : Pr A. PUGIN DIJON Cédex Directrice du stage : Dr A. LEBRUN-GARCIA ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ETUDE DES MAPK ACTIVEES PAR DES ELICITEURS DES REACTIONS DE DEFENSE CHEZ LE TABAC Annick CHILTZ Soutenu le 17 septembre 2001 RESUME Deux PK sont activées précocement dans des cellules de tabac traitées par les éliciteurs cryptogéine ou oligogalacturonides, par phosphorylation sur des résidus tyrosine. Leur substrat in gel, la MBP, est phosphorylé sur des résidus sérine et/ou thréonine. Des anticorps dirigés contre les MAPK animales ERK1/2 reconnaissent ces PK dans les extraits protéiques de cellules témoins et de cellules traitées, alors que les anticorps anti-mapk phosphorylées ne les reconnaissent que dans les extraits protéiques de cellules traitées, suggérant que ces MBPK sont de la famille des MAPK et sont présentes de façon constitutive dans les cellules de tabac. Par immunoprécipitation, elles ont été identifiées comme étant la SIPK et la WIPK, des MAPK initialement caractérisées lors de leur activation respectivement par l'acide salicylique et des blessures. Les 2 MAPK sont inhibées in vitro avec une sensibilité différente par les inhibiteurs de PK staurosporine et 5-iodotubercidine. L'activation de la SIPK et de la WIPK dans des cellules de tabac traitées par la cryptogéine se situe en aval de l'influx calcique. Afin de situer l'activation des MAPK par rapport aux autres évènements induits par la cryptogéine dans des cellules de tabac, de nombreux inhibiteurs de PP ou PK ont été testés. L'un d'entre eux, la 5-iodotubercidine est efficace in vivo dès 25 M sur les 2 MAPK. L'utilisation de cet inhibiteur a permis de préciser que la production de FAO et la mort cellulaire étaient indépendantes de l'activation des MAPK dans la séquence des évènements induits par la cryptogéine sur les cellules de tabac. L'utilisation de cellules de tabac transformées nahg a permis de démontrer que l'acide salicylique, qui a un rôle important dans les phénomènes de résistance des plantes, ne sert pas d'intermédiaire dans l'activation des MAPK induite par la cryptogéine. Des essais comparatifs d'activation avec des acides faibles n'ayant pas cette fonction biologique (acide butyrique, acide 4-hydroxybenzoïque) suggèrent un rôle potentiel, dans l'activation des MAPK, de l'acidification cytoplasmique lorsqu'elle est engendrée par les acides faibles. L'effet acidifiant reste néanmoins insuffisant pour expliquer l'intense et durable activation observée sur la SIPK et la WIPK dans des cellules de tabac traitées par la cryptogéine. EPHE Banque de Monographies SVT 2

3 MOTS CLES : MAPK, éliciteur, cryptogéine, tabac, mécanisme de défense, acidification cytosolique. ETUDE DES MAPK ACTIVEES PAR DES ELICITEURS DES REACTIONS DE DEFENSE CHEZ LE TABAC TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES * ABREVIATIONS * ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE * 1. Introduction * 2. Les réactions de défense des plantes * 2.1 Perception du signal éliciteur * 2.2 Transduction du signal * Modifications des phosphorylations de protéines * Production de FAO et NO * Modifications des flux ioniques * 2.3 Réponses des plantes * Métabolites secondaires * Renforcement des parois * Protéines de défense * 3. Le modèle Tabac/Cryptogéine * 3.1 Les élicitines * 3.2 Etapes initiales de l'interaction cryptogéine/ tabac * Reconnaissance de la cryptogéine par les cellules de tabac * Phosphorylation de protéines * Influx de calcium * Autres réponses précoces * EPHE Banque de Monographies SVT 3

4 3.2.5 Réponses plus tardives * 4. Les MAPK * 4.1 Les modules MAPK des levures * 4.2 Les modules MAPK animaux * 4.3 Les modules MAPK végétaux * Les MAPK * Stress abiotiques ou mécaniques * Signalisation hormonale et régulation du cycle cellulaire * Réponses de défense aux pathogènes * MAPKK et MAPKKK * ABREVIATIONS 4-HBA Acide 4-hydroxybenzoïque AA ABA ATP BA BSA BWMK1 CCCP cv. DPI EDTA EGTA Acide aminé Acide abscissique Adenosine 5'-triphosphate Acide butyrique Albumine de sérum bovin Blast and wound induced MAP kinase Carbonyl cyanide-m.chlorophenylhydrazone cultivar Diphénylèneiodonium chloride Acide éthylène diamine tétraacétique Acide éthylène Glycol-bis(β-aminoethyl ether)-n,n,n',n'-tétraacétique ERMK Elicitor-responsive MAP kinase EST FAO Expressed sequence tag Formes actives de l'oxygène HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonique acide] HMGR 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase HRP JA Horseradish peroxidase Acide jasmonique EPHE Banque de Monographies SVT 4

5 JNK NH 2 -terminal cjun kinase MAPK Mitogen Activated Protein Kinase MAPKK MBP MAPK Kinase ou MKK Protéine basique de myéline MBPK Myelin Basic Protein Kinase MEK MAPK/ERK kinase MEKK MEK kinase ou MKKK MES 2-[N-Morpholino]ethanesulfonique acide NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (forme réduite) NO NTF6 OGs PAL PK PMSF PP PPi PTP pv. RH rlu RSA Monoxyde d'azote Nicotiana tabacum FUS3-related kinase Oligogalacturonides Phenylalanine ammonia-lyase Protéine kinase Phenyl methyl sulfonyl fluoride Protéine phosphatase Pyrophosphate (tetrapotassium) Protéine tyrosine phosphatase pathovar Réponse hypersensible Relative luminescence unit Résistance systémique acquise RMN- 31 P Résonance magnétique nucléaire du 31 P SA Acide salicylique SAMK Stress-Activated MAPK SAPK SIMK SDS SIPK TCA TIR Tris VMT Stress activated protein kinase Stress-Inducible MAPK ou MsK7 Sodium Dodecyl Sulphate ou Lauryl Sulphate Salicylic acid-induced Protein Kinase Acide trichloroacétique Toll/Interleukine-1 receptor Tris(hydroxymethyl)aminomethane Virus de la mosaïque du tabac EPHE Banque de Monographies SVT 5

6 WIPK Wound-Induced Protein Kinase ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 1. Introduction Les plantes, tout comme les animaux, sont en permanence exposées à l'agression de pathogènes. Ne pouvant fuir devant l'agresseur (champignon, bactérie, virus, nématode, insecte, herbivore, ), elles ont élaboré au cours de leur évolution des défenses efficaces, ce qui fait que l'apparition d'une maladie est plus l'exception que la règle. Néanmoins, près de 20 % des récoltes sont perdues suite au développement d'agents microbiens, et ce malgré l'emploi massif de produits phytosanitaires qui ne sont pas sans conséquence sur l'environnement. Depuis quelques années, la connaissance des mécanismes de défense des plantes a progressé, laissant envisager de nouvelles stratégies de protection des végétaux, par une stimulation maîtrisée des défenses naturelles des plantes. L'interaction d'une plante avec un micro-organisme peut évoluer schématiquement de 3 façons (Gianinazzi et al, 1991) : - l'interaction est nulle ou suffisamment limitée pour passer inaperçue, - le micro-organisme peut pénétrer et se développer aux dépens du végétal, la plante ainsi infectée est plus ou moins envahie, elle est sensible avec apparition de symptômes de maladie : c'est une interaction compatible, - malgré l'agression du micro-organisme, la tentative de pénétration ou d'installation avorte : la plante est résistante et l'interaction est dite incompatible. La réalité, plus nuancée, va de l'incompatibilité la plus nette à la complète sensibilité. De plus, la plupart des microorganismes sont généralement incapables de franchir les barrières protectrices externes des plantes, comme la cuticule (une cire qui recouvre les feuilles) ou la paroi pecto-cellulosique (une enveloppe semi-rigide qui entoure chaque cellule végétale). A cette résistance passive s'ajoutent des réponses de défense activées par l'agression, qui conduisent autour des sites de tentative de pénétration à une activité métabolique modifiée, se présentant comme un ensemble d'événements coordonnés, dont l'expression la plus caractéristique est la résistance par hypersensibilité. Cette réaction inductible et locale est caractérisée par la nécrose rapide et localisée des tissus envahis par le pathogène, conduisant au confinement du microorganisme invasif. Chez les animaux, l'apoptose (mort cellulaire génétiquement programmée) intervient dans de nombreux processus physiologiques, dont les mécanismes de défense contre des agents pathogènes. L'apoptose se caractérise par une condensation du cytoplasme et du noyau, une fragmentation de l'adn et la formation de corps apoptotiques. Chez l'arabette (Arabidopsis thaliana) et le soja, l'infection par certaines bactéries aboutit à une mort cellulaire qui présente de nombreuses caractéristiques de l'apoptose, notamment une fragmentation de l'adn nucléaire et l'induction d'enzymes spécifiques, que l'on observe aussi dans des cellules de tabac au cours d'une infection par le VMT (virus de la mosaïque du tabac) ; toutefois, certaines caractéristiques de l'apoptose animale, telle la formation de corps apoptotiques, ne sont pas observées lors d'une réaction d'hypersensibilité ; l'apoptose animale et la mort cellulaire programmée de type hypersensible chez les plantes ne sont pas rigoureusement identiques, même si elles sont toutes deux des mécanismes génétiquement programmés (Kauffmann et al, 1999). D'après Lam et del Pozo (2000), l'identité des principaux acteurs de la mort cellulaire dans les systèmes végétaux reste peu connue, mais des éléments basés sur des études pharmacologiques ou des approches biochimiques suggèrent que des protéases "caspase-like" seraient impliquées dans le contrôle de la mort cellulaire chez les végétaux supérieurs. De même, Danon et al (2000) suggèrent que malgré quelques différences (homologues de caspases non encore clonés chez les plantes, absence de fragmentation cellulaire et de phagocytose liée à la présence de la paroi végétale), un certain degré de conservation dans le processus de mort cellulaire programmée existe chez tous les eucaryotes. Un éliciteur est une molécule produite par un agent phytopathogène ou un ravageur, qui induit chez une plante la production de phytoalexines et par extension, une molécule qui déclenche les mécanismes de défense des plantes avec production de substances défensives (Zaccomer, 1995 ; Nürnberger, 1999). Ces éliciteurs sont de nature chimique variée : des protéines pour les élicitines produites par les champignons de l'espèce Phytophthora (responsables du mildiou chez de nombreuses plantes cultivées), des lipides tel l'acide arachidonique, des oligosaccharides tels les β-glucanes et la chitine issus de la paroi des champignons, ou des oligogalacturonides dérivés de la pectine des parois des cellules végétales (Kauffmann et al, 1999). Ils peuvent également être de nature chimique différente pour un même type de pathogène : par exemple, toujours pour les champignons de l'espèce Phytophthora, les molécules dotées d'une forte activité élicitrice sont des polysaccharides, des glycopeptides, des protéines ou des lipides selon que la plante cible est, respectivement, le soja, l'œillet, le tabac ou le persil, la pomme de terre ou le piment (Gianinazzi et al, 1991). Ces composés peuvent être issus des micro-organismes pathogènes (éliciteurs exogènes) ou de la plante elle-même (éliciteurs endogènes). Ces éliciteurs endogènes sont libérés de la paroi végétale sous l'action d'enzymes hydrolytiques produites par le pathogène, ou par action de stress variés (rayons UV, blessures, abrasion, ). Les plus connus sont les oligogalacturonides (OGs) dont l'activité élicitrice dépend du degré de polymérisation (DP), les plus actifs ayant généralement un DP compris entre 10 et 15 (Mathieu et al, 1991). Les éliciteurs exogènes comprennent : EPHE Banque de Monographies SVT 6

7 - les éliciteurs généraux, qui stimulent les réponses de défense dans tous les cultivars d'une espèce donnée ou même au niveau d'une famille de plantes ; ils correspondent à des molécules sécrétées par le micro-organisme ou à des composants structuraux de leur surface, et sont de nature protéique (élicitines de Phytophthora ou Pythium), glycoprotéique (produits par des Phytophthora, Saccharomyces cerevisiae ou Puccinia Graminis f.sp. tritici), ou polysaccharidique (chitosane par Fusarium solani f.sp. phaseoli). - les éliciteurs race-spécifiques, qui sont des produits directs ou indirects du gène d'avirulence (avr) d'un pathogène particulier interagissant avec le produit du gène de résistance (R) d'un cultivar donné (De Wit, 1997). Cette reconnaissance spécifique du micro-organisme par la plante est une interaction gène-pour-gène (Théorie de Flor, 1971) qui est maintenant reconnue comme une interaction éliciteur-récepteur, chaque élément correspondant respectivement au produit des gènes avr et R (Keen, 1990). Ces éliciteurs sont d'origine virale, bactérienne ou fongique. Les gènes avr d'origine bactérienne clonés sont nombreux (plus de 30) et codent le plus souvent pour des protéines hydrophiles qui, pour induire une réponse hypersensible (RH) sur une plante, nécessitent la présence d'un gène supplémentaire nommé Hrp (Hypersensitive response and pathogenicity) codant pour un système de sécrétion de type III. La seule exception connue à ce modèle est le gène Avr D de Pseudomonas syringae pv. glycinea qui code pour une enzyme impliquée dans la synthèse de l'éliciteur syringolide, qui induit une RH dans les cultivars de soja appropriés (De Wit, 1997). La plupart des gènes R correspondants aux gènes avr d'origine bactérienne sont clonés et codent surtout pour des protéines cytoplasmiques. Peu de gènes avr d'origine fongique sont isolés : 5 gènes avr spécifiques du cultivar (sur tomate, orge ou riz) et 3 spécifiques de l'espèce (Nicotiana et Eragrostis) sont détaillés dans une revue par Laugé et De Witt (1998), mais des études sur d'autres champignons sont en cours, qui permettront le clonage de nouveaux gènes avr fongiques. Les protéines codées par ces gènes ont une localisation, prédite ou démontrée, extracellulaire, ce qui suggère une perception par la plante résistante par l'intermédiaire d'un récepteur membranaire codé par le gène R. Les organismes porteurs de gènes d'avirulence sont limités dans leur capacité de colonisation des plantes, ce qui tendrait théoriquement à les faire disparaître par la pression de sélection exercée par les plantes résistantes. La fonction biologique des produits des gènes d'avirulence n'est en général pas connue, mais le maintien de ces gènes suppose qu'ils peuvent conférer un avantage au pathogène (Knogge, 1996). Une fonction "transporteur de stérol" a été détectée chez les élicitines produites par les Phytophthora, champignons eux-mêmes incapables de produire ces stérols et qui pourraient les prélever sur les membranes plasmiques de leur hôte grâce à une navette de l'éliciteur (Mikes et al, 1997 ; Vauthrin et al, 1999). Dans les écosystèmes naturels, les plantes développent de nouveaux systèmes de reconnaissance dirigés contre leurs pathogènes, qui eux-mêmes génèrent des souches nouvelles pouvant contourner ces résistances. La balance entre l'avantage d'une fonction intrinsèque cruciale et la perte du pouvoir contaminant sur certaines plantes décide de la longévité d'un gène d'avirulence dans la population des pathogènes. 2. Les réactions de défense des plantes Trois phases se retrouvent généralement dans les mécanismes de défense : perception, signalisation, réaction. La première, l'étape de reconnaissance de l'agent pathogène, est essentielle pour déclencher la seconde phase : l'activation d'une cascade de signaux dans les cellules attaquées et la transmission des signaux d'alerte aux cellules environnantes, se traduisant par des réactions de défense aboutissant quelquefois à l'induction de la résistance systémique acquise (RSA) à la plante entière. Dans ce cas, la plante est protégée contre un large spectre de pathogènes, de façon plus ou moins durable. La transduction du signal dépend de phosphorylations de protéines et implique des modifications physiologiques au niveau du plasmalemme : influx de Ca 2+, efflux de Cl - et de K +, dépolarisation membranaire, production de formes actives de l'oxygène (FAO). Il s'ensuit la production de métabolites secondaires et d'hormones (acide salicylique, acide jasmonique, éthylène ou acide abscissique) dont la synthèse est accrue sous l'action des éliciteurs et qui sont impliqués dans l'activation de gènes de défense. Au cours de la troisième étape, les réactions de défense comprennent la synthèse de phytoalexines (composés de nature chimique variée à activité antifongique ou antibactérienne), de protéines PR (pour Pathogenesis Related-Proteins) comme les chitinases ou les glucanases qui hydrolysent les parois cellulaires du pathogène, ou les HRGP (Hydroxyproline Rich GlycoProteins), lignine, callose qui renforcent les parois des cellules végétales. 2.1 Perception du signal éliciteur Des systèmes de perception hautement sensibles aux éliciteurs provenant de la plante (endogènes) ou du pathogène (exogènes) sont nécessaires pour l'induction des défenses chez la plante. Des récepteurs végétaux sont les éléments servant à la reconnaissance du signal et à l'initiation d'une cascade d'événements intracellulaires. Certains ont été caractérisés biochimiquement, et les paramètres de l'interaction ligand-récepteur ont été déterminés (Kd de 0,07 nm à 11,5 M ; nombre de site de 19 fmol à 250 pmol/mg de protéine de microsomes ou plasmalemme). Des différences fondamentales dans le mécanisme de reconnaissance semblent exister selon que le pathogène est d'origine virale, bactérienne ou fongique (Nürnberger, 1999) : - les virus pénètrent dans leurs plantes-hôtes par des blessures et la propagation se fait par l'intermédiaire des plasmodesmes EPHE Banque de Monographies SVT 7

8 intercellulaires, - un mécanisme de transfert dépendant d'un contact (système de sécrétion de type III) permet l'introduction des produits du gène Avr bactérien directement dans les cellules hôtes, où ils peuvent interagir avec les produits du gène R correspondant, - les systèmes de perception pour les produits des gènes Avr d'origine fongique semblent différents ; les éliciteurs racespécifiques semblent interagir avec des structures ressemblant à des récepteurs en surface de la plante-hôte, apparemment sans internalisation du signal fongique, mais plutôt avec la génération subséquente d'un signal intracellulaire qui va initier les défenses de la plante. La reconnaissance des produits des gènes Avr fongiques semble donc transmise par des récepteurs de la membrane plasmique, alors que les éliciteurs viraux ou bactériens sont perçus au niveau intracellulaire par des récepteurs solubles, ces récepteurs membranaires ou cytosoliques étant les produits des gènes R végétaux. La plupart des gènes R isolés possèdent des motifs structuraux communs comme des domaines transmembranaires (TM), des sites de fixation nucléotidique (NBS) et des "Leucine Rich Repeats" ("LRR", qui sont des répétitions imparfaites d'environ 25 amino-acides). Ces LRR interviendraient d'une façon générale dans les interactions protéine-protéine et en particulier dans la fixation du ligand dans les protéines de transduction de signaux eucaryotes. Les produits des gènes R comportant des LRR, mais pas de TM ou de site de myristoylation (servant à l'ancrage sur la membrane), pourraient être des récepteurs intracellulaires solubles, tels RPS2, RPM1 ou RPP5 chez Arabidopsis. A l'opposé, les produits des gènes R ayant des LRR et des TM, comme les protéines Cf de la tomate ou Xa21 du riz, devraient être des récepteurs membranaires. La protéine Xa21 combine ce domaine LRR extracellulaire N-terminal avec un domaine C-terminal ser/thr kinase intracellulaire séparés par un motif transmembranaire (Song et al, 1995), possédant ainsi les caractéristiques d'un vrai récepteur avec un site de réception pour un stimulus et une région capable d'assurer la transmission du signal en aval. D'autres protéines possèdent, en plus des domaines NBS et LRR, un domaine de type Leucine-zipper (LZ) ou TIR, ce dernier domaine présentant des homologies avec la protéine Toll de la drosophile et le récepteur de l'interleukine-1 des mammifères. La première interaction directe entre les produits des gènes R et Avr a été démontrée par Tang et al (1996) entre la tomate (gène R Pto codant pour une sérine/thréonine kinase) et Pseudomonas syringae pv tomato (gène AvrPto) par utilisation du système double hybride, et la recherche de protéines végétales interagissant avec Pto (appelées Pti pour Pto-interacting) a conduit à l'isolement de gènes potentiellement impliqués dans la même voie de signalisation (Bogdanove et Martin, 2000). 2.2 Transduction du signal La reconnaissance initiale de l'éliciteur est suivie par l'activation d'une cascade de transduction du signal par la plante, incluant des modifications biochimiques et des événements cellulaires et moléculaires. Leur importance relative ainsi que leur localisation dans la cascade est mal définie et peut varier selon le modèle plante/micro-organisme étudié Modifications des phosphorylations de protéines Les phosphorylations/déphosphorylations de protéines jouent un rôle important dans la transduction des signaux menant à la résistance aux pathogènes chez les plantes. Elles permettent une amplification efficace du signal initial, une désensibilisation par feedback négatif, des interconnections et des ramifications pour l'activation de plusieurs voies de défense. La mise en évidence de leur implication a été réalisée très tôt par l'analyse des changements dans les profils de phosphorylations après l'application d'éliciteurs sur des suspensions cellulaires : le traitement de cultures cellulaires de tomate, persil, soja ou tabac avec différents types d'éliciteurs (oligosaccharides, oligomères de chitine, extraits de levure, xylanase, élicitine) entraîne l'induction dès les premières minutes de la phosphorylation de protéines (Grab et al, 1989 ; Dietrich et al, 1990 ; Felix et al, 1991, 1994 ; Viard et al, 1994). Des études pharmacologiques avec des inhibiteurs de PK montrent en outre que ces produits entraînent des modifications des autres événements impliqués dans les réactions de défense, incluant l'alcalinisation extracellulaire (Felix et al, 1991 ; Mathieu et al, 1996b), le stress oxydatif (Chandra et Low, 1995 ; Mathieu et al, 1996b), la transcription de gènes de défense (Suzuki et Shinshi, 1995) ou la biosynthèse d'éthylène (Felix et al, 1991). A l'opposé, les inhibiteurs de PP induisent certaines réactions de défense en absence d'éliciteur : la calyculine A induit une alcalinisation du milieu extracellulaire avec une hyperphosphorylation de protéines sur des cellules de tomate (Felix et al, 1994) ou une alcalinisation du milieu extracellulaire et un stress oxydatif sur des suspensions cellulaires de tabac (Mathieu et al, 1996b) alors que l'acide okadaïque initie un stress oxydatif (Chandra et Low, 1995) et une accumulation de phytoalexines (MacKintosh et al, 1994) sur des suspensions cellulaires de soja. Un des événements principaux des voies de transduction du signal éliciteur est la transcription de nombreux gènes, qui vont coder entre autres pour des produits à activité antimicrobienne. L'activation de facteurs de transcription est un niveau de régulation supplémentaire où la phosphorylation de protéines intervient. L'exemple le plus démonstratif est fourni après l'interaction des produits des gènes AvrPto et Pto. Cet événement active la PK Pto, stimulant la phosphorylation de ses substrats dont les facteurs de transcription Pti4, 5 et 6 et la sérine/thréonine kinase Pti1, ce qui correspond certainement au début d'une cascade de phosphorylation conduisant au stress oxydatif et à la réponse hypersensible (Bogdanove et Martin, 2000). Les MAPK sont également des intermédiaires reconnus dans la transduction du signal éliciteur jusqu'au noyau des EPHE Banque de Monographies SVT 8

9 cellules végétales (Voir Etude bibliographique 4/ les MAPK) Production de FAO et NO Le stress oxydatif est un des événements le plus rapidement observable dans les stratégies de défense des plantes. Il consiste en la production de formes actives de l'oxygène (FAO), principalement composées du radical superoxyde O.- 2, du peroxyde d'hydrogène H 2 O 2 et du radical hydroxyl OH.. O.- 2 a un temps de 1/2 vie très court (moins de 1 s) et est généralement rapidement dismuté en H 2 O 2 qui est relativement stable. En présence d'ions métalliques divalents (comme Fe 2+ ), H 2 O 2 peut être transformé par la réaction de Fenton en OH., qui est une espèce chimique très réactive, pouvant entraîner une peroxydation des lipides et détériorer les acides nucléiques et les protéines. La réponse par le stress oxydatif doit donc être bien régulée par la cellule pour éviter une toxicité non désirée. En général, la réponse qui suit la reconnaissance du pathogène est de type biphasique, le second pic de production étant plus spécifique de l'interaction incompatible, et implique un certain nombre de protéines dont une oxydase NADPH-dépendante localisée sur la membrane plasmique, une peroxydase située dans la paroi cellulaire et des enzymes de type amine, diamine et polyamine-oxydases apoplastiques (Grant et Loake, 2000). De ces mécanismes, le système oxydase NADPH-dépendante, similaire à celui présent dans les neutrophiles animaux, est le plus étudié (Pugin et al, 1997 ; Keller et al, 1998). Des événements de phosphorylation/déphosphorylation de protéines régulent l'activation du stress oxydatif (Voir Modifications dans les phosphorylations de protéines). Ce système de régulation est intéressant pour sa rapidité de mise en oeuvre et pour le contrôle de son amplitude et de sa durée. Les FAO produites ont une action directe sur les pathogènes par leur toxicité, mais elles agissent également de façon indirecte en renforçant la paroi végétale par pontages oxydatifs de protéines ou de polysaccharides (Lamb et Dixon, 1997), ce qui ralentit la progression du pathogène, laissant ainsi aux autres défenses végétales le temps de se mettre en place. Les FAO interviennent également dans certains modèles en amont de la production de phytoalexines, dans l'expression de gènes de défense et sur l'initiation de la RH (Low et Merida, 1996). Ils peuvent également agir comme des messagers déclenchant une modification de flux ioniques ou la production de second messagers tel l'acide salicylique (Pontier et al, 1998). Le monoxyde d'azote (NO. ) est une forme particulière de radical oxygéné. Les plantes ne se contentent pas de répondre au monoxyde d'azote atmosphérique, mais sont également capables d'en synthétiser enzymatiquement, en particulier au cours de l'élicitation : par l'utilisation d'un fluorophore et d'un microscope confocal, Foissner et al (2000) ont montré in vivo sur des cellules de tabac traitées par la cryptogéine qu'elles répondaient par une forte augmentation du NO intracellulaire, avec une inhibition possible par un produit piégeur de NO ou un inhibiteur de l'enzyme NOS (Nitric oxide synthase). Le monoxyde d'azote intervient également dans la synthèse de PR-protéines (Kaufmann et al, 1999) et l'induction de la RH (McDowell et Dangl, 2000 ; Wendehenne et al, 2001). Cette molécule signal semble agir par l'intermédiaire de voies de transduction similaires à celles observées chez les animaux. De nombreuses études sont actuellement en cours sur l'implication de cette molécule dans le domaine végétal Modifications des flux ioniques Une modification des flux ioniques à travers la membrane plasmique est observée rapidement après l'interaction du microorganisme avec la plante. Ce sont principalement des efflux de K +, de Cl - et des influx de Ca 2+, H + (Pontier et al, 1998 ; Zimmermann et al, 1998). Ils sont vraisemblablement dus à l'activation de canaux ioniques, qui interviennent dans les réactions de défense : Clough et al (2000) ont montré qu'une résistance à spectre large aux pathogènes et une inhibition de la RH peuvent être obtenues par une altération du canal ionique couplé à un nucléotide cyclique DND1 d'arabidopsis. Le retrait du calcium du milieu de culture ou l'inhibition des flux ioniques par des produits bloquant les canaux ioniques (Anthracène- 9-carboxylase, dérivés d'indanyloxyacétate et de diphénylamine-2-carboxylate) empêchent la production de FAO, l'activation des gènes de défense et la production de phytoalexines sur des cellules de persil traitées par des éliciteurs fongiques (Jabs et al, 1997). L'importance du rôle du calcium dans la transduction du signal a été démontrée par l'utilisation d'inhibiteurs des canaux calciques (Lanthane, 5-nitro-2,3-phenylpropyl aminobenzoïque acide, acide 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic), des chélateurs de calcium EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) et EGTA (acide éthylène Glycol-bis(β-aminoethyl ether)-n,n,n',n'-tétraacétique) ou des ionophores (A23187) (Tavernier et al, 1995a ; Levine et al, 1996 ; Pontier et al, 1998 ; Sasabe et al, 2000). Plus récemment, des plantes ont été transformées par un gène exprimant l'apoaequorine dans certains compartiments cellulaires (cytoplasme, noyau), permettant une quantification précise et non-invasive des concentrations cytoplasmiques ou nucléaires en calcium (première transformation par Knight et al, 1991 dans Blume et al, 2000) : le calcium libre cytoplasmique de cellules de persil transformées augmente rapidement après un traitement par l'éliciteur Pep-13 pour atteindre un pic vers 1 M, avant de redescendre pour se stabiliser vers 300 nm, alors que la valeur normale en calcium libre cytoplasmique se situe vers 100 nm (Bush, 1995). Cette augmentation est principalement liée à un influx de calcium EPHE Banque de Monographies SVT 9

10 extracellulaire et non à un relargage à partir d'autres compartiments intracellulaires (Blume et al, 2000). 2.3 Réponses des plantes Les modifications métaboliques qui, dans toutes les espèces végétales, participent à la lutte contre l'infection se retrouvent systématiquement dans trois grandes catégories de réactions : une stimulation de certaines voies métaboliques secondaires, le renforcement de la paroi pecto-cellulosique et la production de toute une gamme de protéines de défense Métabolites secondaires Les métabolismes secondaires jouent un rôle essentiel en permettant notamment la production des phytoalexines, ces petites molécules de natures chimiques variées ayant un large spectre d'activité antifongique ou antibactérienne. La principale phytoalexine du piment est le capsidiol, celle du pois la pisatine et la scopolétine ou le capsidiol sont synthétisés par le tabac. Mais tous les pathogènes ne manifestent pas la même sensibilité à une substance donnée : par exemple, le mildiou du piment est dix fois moins sensible que le mildiou de la pomme de terre au capsidiol (Gianinazzi et al, 1991). D'autres molécules interviennent dans la résistance des plantes aux pathogènes, dont l'acide salicylique (SA), l'acide jasmonique (JA) ou l'éthylène, qui sont des phytohormones. De nombreuses études ont démontré que SA est un signal intracellulaire important dans la voie de transduction menant à la résistance locale ou systémique (RSA), ainsi que dans l'expression des PR-protéines (Gaffney et al, 1993; Shah et Klessig, 1999). En réponse à une infection par le VMT, SA s'accumule dans la feuille de tabac inoculée et à une plus faible concentration dans les feuilles non inoculées, ce qui déclenche l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes de défense. L'utilisation de plants de tabac ou d'arabette transformés par le gène nahg (codant une salicylate hydroxylase, donc empêchant l'accumulation intracellulaire de SA) a permis de démontrer le rôle de SA dans la mise en place des mécanismes de défense : l'activation des gènes de défense et la mise en place de la RSA est réduite dans ces plants transformés (Gaffney et al, 1993, Vernooij et al, 1994). L'acide jasmonique est une molécule importante dans la régulation des réponses de défense chez les plantes. Il induit la biosynthèse de protéines de défense et de métabolites secondaires ayant un effet protecteur. Dans le métabolisme des alcaloïdes, les jasmonates agissent en coordinant l'activation de l'expression de multiples gènes de biosynthèse. Dans le métabolisme des terpenoïde-indole alcaloïdes et dans la voie des précurseurs primaires, les jasmonates induisent l'expression de gènes et les métabolismes par l'intermédiaire des protéines ORCAs (pour Octadecanoid-responsive Catharanthus AP2-domain proteins), qui sont des membres de la famille des facteurs de transcription à domaine "DNA-binding" AP2/ERF, spécifiques des plantes (Memelink et al, 2001). D'autre part, des études récentes ont démontré que l'éthylène et JA interviennent dans l'activation de diverses réponses de défense et la résistance à certains pathogènes. Les interactions entre les voies de signalisation de SA, JA et éthylène restent encore à préciser : il a été démontré que SA avait une action synergique avec l'éthylène ou les dérivés volatils de JA (méthyljasmonate) pour activer l'expression de PR-protéines chez le tabac et l'arabette, néanmoins, d'autres réponses régulées par l'éthylène et/ou JA semblent indépendantes de SA (Klessig et al, 2000). L'analyse de mutants plus ou moins affectés dans leur possibilité d'accumuler SA devrait aider à la compréhension du rôle de cette molécule dans la résistance des plantes aux micro-organismes Renforcement des parois Les parois, à base de fibres de cellulose, qui protègent les cellules végétales et constituent l'armature de la plante, sont plus des voies de colonisation que des barrières efficaces contre les agents pathogènes. Les défenses de la plante comprennent un ensemble de mécanismes conduisant à étanchéifier les parois et à les renforcer contre les dégradations enzymatiques générées par les pathogènes. Un mécanisme fréquent est la synthèse de métabolites secondaires, de nature phénolique, qui se lient chimiquement entre eux, et imprègnent les fibres de cellulose. Les polymères très résistants ainsi formés ressemblent beaucoup à la lignine des parois de certains tissus (bois, fibres sclérifiées) mais leur composition et leur localisation leurs vallent le nom de lignines pathologiques. Ce phénomène de polymérisation met en jeu des enzymes spécifiques, notamment des peroxydases, dont l'activité est accrue de façon considérable en réponse aux agressions. Un rôle analogue est joué par d'autres polymères comme la subérine et la callose Protéines de défense L'arsenal défensif des plantes comprend de nombreux peptides et protéines de défense. Parmi ces dernières, les PR-protéines ont été découvertes en 1970 chez le tabac. Elles ont des propriétés physico-chimiques communes et qui leur sont spécifiques : elles sont très stables en milieu acide et résistent à l'action des protéases produites par la plante elle-même ou par les microorganismes pathogènes ; ces deux propriétés leurs confèrent une grande stabilité dans les environnements défavorables où elles s'accumulent, notamment dans la vacuole, et dans les espaces intercellulaires occupés par les agents pathogènes (Kauffmann et al, 1999). Certaines ont une activité enzymatique identique à celle de la β-1,3-glucanase ou de la chitinase, enzymes qui dégradent, parfois en synergie, la paroi des champignons et des bactéries ; d'autres inhibent des protéases ou des polygalacturonases microbiennes, importantes pour le pouvoir pathogène des micro-organismes. EPHE Banque de Monographies SVT 10

11 3. Le modèle Tabac/Cryptogéine 3.1 Les élicitines Des plants de tabac inoculés avec des espèces de Phytophthora incompatibles développent rapidement des nécroses foliaires à distance du point d'inoculation. A l'opposé, le pathogène compatible Phytophthora parasitica var nicotianae envahit la plante hôte, sans induire ce genre de nécrose, provoquant la maladie du "Black shank" (pourriture noire du pied de la plante). Les symptômes observés lors de l'interaction incompatible (nécrose locale et à distance) peuvent être reproduits en remplaçant le champignon par des extraits fongiques ou par application de filtrats de culture sur des plants de tabac décapités (Bonnet et al, 1986). Cette observation a permis l'isolation de petites protéines de 10 kda à partir du filtrat de culture de ces espèces incompatibles. Ces protéines purifiées, nommées élicitines, sont sécrétées par ces champignons in vitro et in planta pendant l'infection ; elles déclenchent une réponse de type hypersensible chez le tabac et protègent la plante entière contre un large spectre de pathogènes, en particulier contre Phytophthora parasitica var nicotianae, par la mise en place d'une RSA (Ricci, 1997). Toutes les espèces de tabac répondent aux diverses élicitines : il n'y a donc pas d'interaction cultivar-spécifique. Par ailleurs, les élicitines induisent une RH dans d'autres Brassicacées telles le colza ou le radis (Bonnet et al, 1996). L'élicitine la plus étudiée est la cryptogéine, produite par Phytophthora cryptogea. Elle est constituée de 98 résidus d'acides aminés (AA), dont six cystéines engagées dans des ponts disulfure intramoléculaires, et ne montre aucune activité enzymatique. La protéine purifiée reproduit les nécroses observées avec le champignon à des doses aussi faibles que 100 picomoles par plante (Ricci, 1997). Une dizaine d'élicitines, ayant une forte homologie de séquence avec la cryptogéine (supérieure à 66%) ont été purifiées et séquencées à partir d'autres espèces de Phytophthora. La comparaison de leur séquence indique que ces protéines partagent certains points communs : une séquence de 98 résidus, la présence de six résidus cystéine invariants, l'absence de trois AA (histidine, tryptophane et arginine) et l'abondance de quatre autres AA (leucine, alanine, sérine, thréonine). Malgré leur forte homologie, les élicitines présentent de grandes différences de charges nettes ; elles ont été classées en élicitines acides (ou α) avec un ph i entre 3 et 5, et en élicitines basiques (ou β) avec un ph i entre 7 et 9. Toutes induisent une nécrose à distance sur des feuilles de tabac mais les élicitines basiques sont environ 100 fois plus efficaces que les acides (Nespoulous et al, 1992 ; Pernollet et al, 1993), le résidu présent en position 13 semblant jouer un rôle important dans l'activité nécrotique : la lysine des élicitines basiques est remplacée par une valine dans les élicitines acides (O'Donohue et al, 1995). La structure cristalline de la cryptogéine a été déterminée (Boissy et al, 1996) : elle comporte 6 hélices α, un motif composé d'un feuillet β antiparallèle et d'une boucle Ω, qui pourrait correspondre à un site d'interaction avec un récepteur potentiel. L'apparition de nécroses sur les feuilles de tabac loin du point d'inoculation par la cryptogéine est liée à sa capacité à migrer sur des distances longues par l'intermédiaire du système vasculaire de la plante. L'utilisation de cryptogéine marquée à l'iode 125 appliquée sur une tige de tabac décapitée montre la migration rapide de l'élicitine dans la plante, puis son accumulation au niveau des feuilles ; l'autoradiographie des plantes montre une superposition de la distribution de la cryptogéine et de la répartition des nécroses (Zanetti et al, 1992), suggérant une implication directe de la cryptogéine dans l'induction de la mort cellulaire (Keller et al, 1996). 3.2 Etapes initiales de l'interaction cryptogéine/ tabac Ces étapes ont été caractérisées sur des suspensions cellulaires de tabac Nicotiana tabacum cv Xanthi, traitées par la cryptogéine à des concentrations de l'ordre de 25 nm Reconnaissance de la cryptogéine par les cellules de tabac En utilisant de la cryptogéine marquée à l'iode 125, Wendehenne et al (1995) ont mis en évidence sur le plasmalemme de cellules isolées ou de feuilles de tabac, la présence de sites de haute affinité pour l'élicitine (K d = 2 nm, nombre de sites = 220 fmol/mg de protéines de plasmalemme). Cette liaison de forte affinité est saturable, réversible, spécifique et ph dépendante (optimale à ph 7), ce qui représente les propriétés attendues pour une interaction ligand-récepteur. Un traitement du plasmalemme par la pronase ou la trypsine supprime la fixation de la cryptogéine, indiquant que les sites de fixation sont de nature protéique (Bourque, 1999). Des essais réalisés avec trois autres élicitines (Cinnamomine, Capsicéine, Parasiticéine) par Bourque et al (1998) montrent que l'affinité pour le site de fixation et le nombre de ces sites est le même pour les quatre élicitines. De plus, des essais de compétition et de déplacement avec ces élicitines ont montré une interaction sur le même récepteur, suggérant qu'il est commun à cette famille de protéines (Bourque, 1999) Phosphorylation de protéines Une étape de phosphorylation de protéines est observée précocement après l'application de la cryptogéine. En effet, la staurosporine (inhibiteur des PK) appliquée à 1,25 M inhibe toutes les réponses observées dans les premières minutes, dont l'alcalinisation extracellulaire, l'efflux de potassium, la production de FAO (Viard et al, 1994) ainsi que l'influx de calcium (Tavernier et al, 1995a) sur des suspensions cellulaires de tabac traitées par 5 à 50 nm de cryptogéine. D'autre part, Lecourieux-Ouaked et al (2000) ont montré que la calyculine A, un inhibiteur de PP, mime les effets induits par la EPHE Banque de Monographies SVT 11

12 cryptogéine : influx de calcium, alcalinisation extracellulaire, production de FAO, suggérant que pendant la transduction du signal induit par la cryptogéine, la balance entre les PK et les PP est modifiée. Ils ont également analysé par électrophorèse 2D les protéines phosphorylées in vivo dans des cellules de tabac traitées par la cryptogéine, la calyculine A ou la staurosporine : sur la centaine de polypeptides marqués avec le 32 P, 19 polypeptides sont phosphorylés en réponse à la cryptogéine. Toutes ces phosphorylations sont inhibées par la staurosporine alors que 18 d'entre elles ont également lieu dans les cellules traitées par la calyculine A, et 12 dépendent de l'influx calcique. Ceci confirme la similitude d'effet de la calyculine A et de la cryptogéine, suggérant qu'une cible de la calyculine A est impliquée dans la transduction du signal de la cryptogéine en amont de la cascade de signalisation. L'identification de ces polypeptides spécifiquement phosphorylés par la cryptogéine apportera des renseignements sur les voies de transduction du signal impliquées dans les réponses de défense des plantes Influx de calcium Dans les premières minutes suivant un traitement de cellules de tabac par la cryptogéine, une entrée massive de calcium (quantifiée par utilisation de 45 Ca) est détectable dans les cellules (Tavernier et al, 1995a). Cet influx, qui peut être supprimé par le lanthane (agent bloquant les canaux calciques) ou l'egta (chélateur de cations divalents), précède et est nécessaire à une série de réponses précoces ou plus tardives induites par l'éliciteur Autres réponses précoces L'influx de calcium engendre rapidement deux types d'événements (Pugin et al, 1997 ; Wendehenne et al, soumis): - un efflux d'anions (Cl -, NO 3 - ) et l'inhibition de la H + -ATPase résultant d'une dépolarisation de la membrane plasmique (de -154 mv à -36 mv en quelques minutes), - l'activation d'une NADPH-oxydase plasmique responsable de la production de FAO, d'une acidification cytoplasmique et d'une alcalinisation extracellulaire ; cette activation de la NADPH-oxydase par la cryptogéine entraîne une diminution du rapport NADPH/NADP +, et conduit à une activation consécutive du cycle des pentoses-phosphate, qui sert essentiellement à fournir le NADPH, utilisé comme source d'électron par l'oxydase. La forte intensité de l'influx de calcium observée avec la cryptogéine pourrait être corrélée à son pouvoir nécrosant, puisque d'autres éliciteurs comme les OGs, qui n'induisent qu'un faible influx de calcium, n'entrainent aucune nécrose sur des plantes (Binet et al, 1998). Cette apparition des nécroses foliaires induite par la cryptogéine serait étroitement associée à une peroxydation des lipides de la membrane plasmique (Tavernier et al, 1995b ; Rustérucci et al, 1996). Cette hydroperoxydation des acides gras semble être exclusivement le résultat d'activités lipoxygénases (Rustérucci et al, 1999). D'autres événements induits par la cryptogéine pendant la première heure de traitement sur des cellules de tabac ont été caractérisés : - des protéines G d'environ 20 kda, homologues à Rac2 (protéine de neutrophile), pourraient être impliquées dans la régulation du stress oxydatif induit par la cryptogéine (Kieffer et al, 1997), - la dynamique des microtubules de cellules de tabac, un des constituants du cytosquelette, a été étudiée ; sous l'action de la cryptogéine, une dépolymérisation progressive et intense des microtubules corticaux, dépendante de l'influx de calcium, mais indépendante de la production de FAO est observée (Binet et al, 2001), - des modifications dans l'expression de certains gènes codant pour des enzymes-clés végétales ont été mises en évidence : elles concernent la H + -ATPase de la membrane plasmique, une Ca 2+ -ATPase, une lipoxygénase, PR-b1 codant pour une PRprotéine, la PAL et une sous-unité b du protéasome (Suty et al,1995 ; 1996 ; Petitot et al, 1997 ; Etienne et al, 2000) Réponses plus tardives Les modifications plus tardives caractérisées dans le modèle tabac/cryptogéine concernent la paroi cellulaire et la production de métabolites dans le milieu extracellulaire. Kieffer et al (2000), après avoir observé l'agrégation des cellules après min de traitement et une forte baisse de la digestibilité de la paroi, ont montré que des cellules élicitées synthétisaient des extensions fibrillaires de pectine le long de la paroi primaire, riches en ions calcium (gel de pectate de calcium), résultant de la réorganisation de la pectine dans la lamelle moyenne. L'utilisation du DPI, un inhibiteur de la NADPH-oxydase montre une intervention possible mais partielle de la production de FAO dans ce phénomène. Une synthèse extracellulaire d'éthylène et de capsidiol a été démontrée sur des suspensions cellulaires traitées par l'éliciteur EPHE Banque de Monographies SVT 12

13 (Blein et al, 1990 ; Milat et al, 1991) : - la production de l'éthylène commence après une période de latence d'environ 2 h pour augmenter ensuite régulièrement pendant au moins 8 h ; - la synthèse de capsidiol, la phytoalexine majoritaire chez le tabac est un événement plus tardif (latence de 4-5 h) mais se poursuit pendant au moins 24 h. Cette production de phytoalexine est dépendante de l'influx de calcium (Tavernier et al, 1995a) mais ne semble dépendre ni de la production de FAO, ni de la peroxydation des lipides, ni des nécroses observées sur des feuilles de tabac traitées par la cryptogéine, ces trois dernières réponses semblant par contre directement reliées entre elles (Rustérucci et al, 1996). La réponse hypersensible est caractérisée par une nécrose observée au point d'inoculation de l'éliciteur sur des feuilles de tabac. Cette nécrose est liée à la mort cellulaire, qui a été quantifiée sur des cellules de tabac en suspension par Binet et al (2001) à l'aide du rouge neutre, un colorant vital : après 1 h de traitement, les cellules sont toujours vivantes ; par contre, à 24 h du traitement initial, la cryptogéine induit la mort cellulaire de manière dose-dépendante, avec 60 % de cellules mortes observées à la concentration de 25 nm utilisée dans la plupart des expériences. L'activation rapide et efficace des mécanismes de résistance est essentielle à la défense des plantes contre les pathogènes. L'interaction initiale éliciteur-récepteur est indispensable au déclenchement des autres réponses. Keller et al (1999) ont développé une nouvelle stratégie de résistance en créant des tabacs transgéniques pouvant produire un éliciteur suite à une infection par un pathogène : ces plantes sont des tabacs transformés avec un gène de fusion constitué du promoteur hsr203j inductible par un pathogène et du gène codant pour l'éliciteur cryptogéine. Dans des conditions normales, la cryptogéine n'est pas décelable dans les plantes ; par contre, l'infection par le champignon pathogène Phytophthora parasitica var nicotianae stimule la production de l'éliciteur, qui coïncide avec l'induction rapide de plusieurs gènes de défense au site d'infection et avec une nécrose localisée limitant la croissance du pathogène, ainsi qu'une résistance accrue à d'autres pathogènes dont Erysiphe cichoracearum et Botrytis cinerea ; ainsi, la synthèse constitutive de l'éliciteur n'est pas nécessaire à la mise en place d'une résistance contre un large spectre de pathogènes. Par contre, le niveau de protection atteint reste inférieur à celui observé dans une interaction incompatible plante-pathogène naturelle, montrant les limites de ces plantes transformées, un des facteurs limitant pouvant être le délai entre l'infection et la synthèse de l'éliciteur par les cellules végétales. 4. Les MAPK Les réactions de phosphorylation/déphosphorylation des protéines sont reconnues comme des événements biochimiques capitaux dans la régulation de l'activité cellulaire. Parmi les diverses PK impliquées dans ces processus, les mitogen-activated protein kinases (MAPK, également connues sous le nom de ERK, external-signal regulated protein kinases) sont distribuées de façon ubiquitaire chez tous les eucaryotes, incluant les champignons, les animaux et les plantes. Les MAPK sont des sérine/thréonine PK dont la structure primaire contient 11 domaines conservés (I à XI). Elles sont activées par phosphorylation sur des résidus tyrosine et thréonine spécifiques, localisés dans la boucle d'activation qui s'étend entre les régions VII et VIII du domaine kinase. Ces résidus sont en général séparés par un seul acide aminé, ce qui permet la classification des sites de phosphorylation selon 3 types de motif : T-E-Y (motif des ERK animales, FUS3/KSS1 et MPK1 de Saccharomyces cerevisiae, et Spk1 de Schizosaccharomyces pombe), T-P-Y (dans JNK) ou T-G-Y (dans la p38 animale et HOG1 de Saccharomyces cerevisiae). L'analyse cristallographique de plusieurs MAPK révèle une architecture 3D très similaire, avec une structure bilobée, le site actif étant à l'interface (Zhang et al, 1994). Une des structures secondaires la plus importante et la moins stable est la boucle d'activation qui contient le site actif contenant le motif T-X-Y de phosphorylation spécifique des MAPK (Zhang et al, 1995). La réaction de phosphorylation des MAPK est catalysée par des MAPKKs (ou MEK) relativement spécifiques, elles-mêmes activées par phosphorylation de 2 résidus conservés sérine et/ou thréonine du domaine VIII par des MAPKKK (ou MEKK). Bien que les MAPKK d'animaux et de levures aient 3 résidus d'aa entre les 2 sites de phosphorylation, tous les homologues de MAPKK végétales reportées à ce jour possèdent 5 résidus d'aa sur ce même site (Machida et al, 1997). Les MAPKKK peuvent être activées par différents mécanismes, entre autres des phosphorylations par des MAPKKKKs ou par la PKC (Meskiene et Hirt, 2000). Leprince et al (1999) ont utilisé une EST d'arabidopsis thaliana ayant une certaine homologie aux MAP4K animales, pour isoler des cdna de Brassica napus : deux clones ont été isolés, BnMAP4K-α1 et BnMAP4K-α2, qui codent pour des protéines possédant les 11 sous-domaines de la partie catalytique des Ser/Thr kinases ; elles possèdent un domaine N-terminal catalytique et une longue extension C-terminale (qui les placeraient dans la famille des protéines MAP4K GCK/SPS1), sont présentes surtout dans les racines, les siliques, les boutons floraux et semblent régulées par le cycle cellulaire. Le couplage de plusieurs PK dans ces modules MAPK permet l'amplification du signal, alors que la durée de l'activation est contrôlée essentiellement par des PP, permettant ainsi, grâce aux 2 propriétés des modules MAPK (amplification du signal et inhibition rétroactive) la conversion de signaux extracellulaires gradués en signaux intracellulaires effectifs dépendant du EPHE Banque de Monographies SVT 13

14 seuil d'activation des MAPK (Bögre et al, 2000). 4.1 Les modules MAPK des levures Les levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe ont constitué un système intéressant pour étudier les éléments spécifiques des modules MAPK. Le séquençage des génomes de ces levures a permis un inventaire complet de leurs gènes de MAPK. L'utilisation de la génétique classique alliée à la biologie moléculaire et à la biochimie a permis d'étudier la fonction de chacun de ces gènes. Cinq modules distincts ont été identifiés chez Saccharomyces cerevisiae et trois chez Schizosaccharomyces pombe. Cinq des 6 MAPK codées par le génome de S. cerevisiae ont été associées à des réponses biologiques pour des stimuli spécifiques : HOG1 est nécessaire à la réponse au stress hypertonique, MPK1 est activée par un stress hypoosmotique et régule l'architecture de la paroi cellulaire, SMK1 intervient dans le développement de la méiose, FUS3 contrôle la réponse aux phéromones pour la reproduction sexuée et KSS1 régule la croissance filamenteuse ; la sixième MAPK, MLP1 fonctionnerait de concert avec MPK1, dont elle est très proche (Madhani et Fink, 1998). Les 3 modules de MAPK de Schizosaccharomyces pombe interviennent dans la voie de réponse aux phéromones (Byr2/Byr1/Spk1), dans le développement sexuel ou la réponse aux stress (Wik1/Wis1/Spc1) et dans l'intégrité de la paroi cellulaire (MEKK?/MEK?/Pmk1) (Lewis et al, 1998). Ces différents modules de MAPK sont fonctionnellement distincts, chaque stimulus conduisant à une seule réponse, bien que certaines cascades partagent des composants. Leur spécificité est déterminée, en partie, par le biais d'assemblage en complexe multikinases. Par exemple, STE5 coordine le module MAPK régulant la voie de réponse aux phéromones en formant un complexe de haut poids moléculaire avec STE11, STE7 et FUS3/KSS1, présent quand le signal est absent. Quand une stimulation par phéromone intervient, STE5 facilite la transduction du signal de STE11 à FUS3 et KSS1, ces MAPK activées pouvant ensuite initier les processus cellulaires nécessaires à la reproduction sexuée (Whitmarsh et Davis, 1998). La localisation de STE5 dans la cellule est primordiale pour sa fonction : Mahanty et al (1999) ont montré la nécessité de son passage par le noyau avant sa relocalisation sur la membrane plasmique de la cellule grâce à une association avec Gβ, essentielle pour l'activation de la voie des phéromones. PBS2, une autre protéine d'assemblage, coordine un module de MAPK intervenant dans l'osmorégulation chez S. cerevisiae. A l'opposé de STE5, PBS2 intervient dans la cascade en tant que MKK, et forme un complexe multiprotéique avec SHO1 (osmosenseur), STE11 (MEKK) et HOG1 (MAPK). La MEKK STE11 intervient également dans le module MAPK de régulation de la filamentation distinct de ceux menant à l'osmorégulation (avec PBS2) ou à la réponse aux phéromones (avec STE5) (Whitmarsh et Davis, 1998). 4.2 Les modules MAPK animaux Plusieurs modules de MAPK animaux sont identifiés et interviennent dans des processus cellulaires aussi variés que la prolifération ou la différenciation cellulaire (ERK), la réponse aux stress osmotique ou thermique, à l'irradiation UV, aux cytokines (JNK/SAPK et p38). Meskiene et Hirt (2000) signalent 13 MAPK identifiées chez les animaux (6 ERK, 3 JNK et 4 p38 kinases), avec l'existence de plusieurs isoformes et des variants dûs à l'épissage (les 3 gènes JNK codent au moins 10 isoformes différentes). Le génome humain code en plus pour 7 MAPKK et 14 MAPKKK, pour lesquels différentes isoformes et variants existent également. La première et la mieux caractérisée des cascades de MAPK est constituée par les isoformes Raf - MEK1/2 - ERK1/2 et est régulée par Ras ; cette voie est présente dans les cellules non prolifératives, et des signaux mitogènes peuvent l'activer (Robinson et Cobb, 1997). La moitié des protéines ERK dans les cellules activées sont liées au cytosquelette, suggérant qu'elles sont impliquées dans sa réorganisation au cours de la phase proliférative (Reszka et al, 1995). Khokhlatchev et al (1998) se sont intéressés à l'activation de ERK2, suivie par sa translocation dans le noyau, où elle peut phosphoryler des cibles nucléaires : ERK2 phosphorylée forme des dimères avec des partenaires ERK2 phosphorylées ou non phosphorylées, cette dimérisation semblant essentielle pour sa relocalisation ligand-dépendante. La dimérisation pourrait jouer sur l'accessibilité à des sites NLS (nuclear localization signal) bien que les MAPK ne semblent pas posséder de tels sites dans leur séquence primaire (Reiser et al, 1999), ou à des sites NES (nuclear export signal). Elle pourrait changer la faculté de ERK2 à diffuser librement au travers des pores nucléaires (des protéines de kda peuvent diffuser vers le noyau selon Görlich et Mattaj, 1996) ou encore bloquer ou favoriser des interactions avec d'autres protéines contrôlant sa localisation cellulaire (Cobb et Goldsmith, 2000). La dimérisation d'une MAPK pourrait également faciliter la phosphorylation de facteurs de transcription souvent dimériques eux-aussi (Chang et Karin, 2001). La régulation de la localisation cellulaire des MAPK semble relativement conservée chez les eucaryotes. Le scénario de traffic nucléocytoplasmique suivant est proposé par Reiser et al (1999) : les MAPK naviguent en permanence entre les compartiments cytoplasmiques et nucléaires ; leur activation par double phosphorylation les dissocie des MAPKK cytoplasmiques, puis elles se transloquent dans le noyau, avec l'aide de facteur(s) d'import nucléaire ; leurs cibles (facteurs de transcription,...) les retiennent dans le noyau, puis l'adaptation au signal induit leur déphosphorylation et leur export nucléaire EPHE Banque de Monographies SVT 14

15 actif. JNK/SAPK et p38 sont des MAPK intervenant dans les réponses aux stress cellulaires, l'inflammation et l'apoptose ; leur activation peut conduire à une inhibition de la croissance ou de la différenciation. Leur participation dans l'apoptose est reconnue, en général avec un effet opposé à celui induit par ERK, mais l'effet peut être promoteur ou protecteur selon le modèle : Nishina et al (1997) démontrent que Sek1 (qui est une JNKK/MKK4, activateur direct de JNK/SAPK en réponse à des stress environnementaux ou à des facteurs mitogènes) intervient dans la médiation de signaux de survie cellulaire dans le développement et l'activation de lymphocytes T, alors que l'apoptose observée sur des cellules PC12 suite au retrait de NGF (nerve growth factor) coïncide avec une activation de JNK/SAPK et p38 en même temps qu'une inhibition d'erk (Xia et al, 1995). Plus récemment d'autres MAPK ont été clonées, incluant ERK5 et 4 kinases homologues de p38 (Mxi2, ERK6, SAPK3, p38β). Certaines indications montrent que ces 4 PK ne seraient pas régulées comme p38, suggérant qu'elles appartiennent à de nouveaux modules de MAPK (Robinson et Cobb, 1997). Plusieurs membres de la famille des MAPKK (ou MKK) sont détaillés par Lewis et al (1998) : - MKK1/2 régulent ERK1/2, et sont exprimées de façon ubiquitaire dans les cellules animales à des concentrations atteignant le micromolaire. L'activation partielle ou totale est réalisée par phosphorylation sur une seule ou 2 sérines séparées par 3 AA sur la séquence Ser(P)-Met-Ala-Asn-Ser(P). - MKK3 phosphoryle spécifiquement la MAPK p38 ; MKK6 est très proche de MKK3 mais son activité de base est environ 300 fois plus forte que celle de MKK3 ; MKK4 et MKK7, nommées également JNKK1/SEK1 et JNKK2 respectivement, sont les régulateurs de JNK/SAPK. Ces 4 MAPKK ont une masse moléculaire de 35 à 45 kda, ne possèdent pas l'insertion riche en proline entre les domaines IX et X qui se trouve dans MKK1 et MKK2 et répondent aux cytokines inflammatoires, rayons UV ou γ, et stress osmotiques. - MKK5 a été clonée comme une homologue de MKK avec 45% d'identité à MKK1 ; elle est présente sous 2 formes de 50 ou 40 kda selon l'épissage ; elle active ERK5 qui a été identifiée par le système double-hybride : c'est une protéine de 90 kda, également nommée BMK1 (big MAP kinase 1) qui contient un motif T-G-Y dans la boucle d'activation (Thr-Glu-Tyr), n'ayant pas encore de fonction connue. - Une PK ayant une activité de type MKK, phosphorylant ERK3, a été partiellement purifiée (Cheng et al, 1996). Au moins 3 familles de MEKK peuvent phosphoryler et activer MKK1 et MKK2 : RAF (régulée en amont par RAS), MOS et TPL2. Les stress-activated MAPKKK pouvant activer les MKK3, 4, 6 et 7 sont : - les MEKK, homologues des kinases de levures STE11, au nombre de 9 : MEKK1, 2, 3 et 4, MAPKKK5, TPL2, TAK1, ASK1 et NIK. Ce sont des protéines de 50 à 180 kda. - les MLK (mixed lineage kinases), toutes voisines de 100 kda, et contenant des domaines LZ (leucine zipper) favorables aux interactions protéine-protéine. Des membres des deux grandes familles de protéines phosphatases (PP, protéines phosphatases et PTP, protéines tyrosinephosphatases) interviennent dans la régulation des cascades de MAPK. Lewis et al (1998) a établi une revue de leurs fonctions : - les PP (1, 2A, 2B et 2C) hydrolysent spécifiquement les liaisons sérine/thréonine phosphoesters. PP1 et PP2A sont des régulateurs négatifs de ERK1/2 et MKK1/2. - l'hydrolyse des tyrosine phosphoesters est catalysée par les PTP, incluant les DSP (dual specificity phosphatases) pouvant hydrolyser à la fois les phosphotyrosine et les phosphosérine/thréonine. Cette dernière famille est la plus impliquée dans la régulation des MAPK et constitue le groupe des MKP (MAPK phosphatases). Bien qu'ayant des fonctions similaires, les membres des MKP se distinguent par leur spécificité au substrat, leur localisation (en général, dans le noyau, où elles peuvent inactiver les MAPK nucléaires, mais certaines sont cytoplasmiques), la régulation de leur expression génique et leur distribution tissulaire. Les substrats cellulaires des MAPK sont des facteurs de transcription nucléaire, des protéines du cytosquelette et divers composants de la signalisation cellulaire, mais également des PK nommées MAP-KAP (MAPK-activated proteins) kinases, dont au moins cinq peuvent être activées par ERK, JNK/SAPK ou p38. La reconnaissance MAPK-substrat repose sur 2 interactions : la première est commune à toutes les MAPK et est basée sur la reconnaissance du site de phosphorylation EPHE Banque de Monographies SVT 15

16 (résidu sérine ou thréonine suivi d'une proline selon Gonzalez et al, 1991), la seconde assure une spécificité plus forte et fait intervenir un ancrage sur un autre site de la kinase. Mais la majorité des cibles des MAPK restent encore à découvrir ; des techniques d'analyse protéomique et des inhibiteurs spécifiques maintenant disponibles devraient permettre leur identification et la définition de leurs fonctions physiologiques, qui amènera une compréhension approfondie du rôle des MAPK (Chang et Karin, 2001). 4.3 Les modules MAPK végétaux Les MAPK Comme tous les organismes vivants, les plantes doivent percevoir et signaler des stimuli extérieurs. Les MAPK, présentes chez tous les eucaryotes, sont une part importante des composants intervenant dans cette transduction du signal. Meskiene et Hirt (2000) signalent 28 gènes codant pour des MAPK identifiés à partir de plusieurs espèces de plantes dont la luzerne, le persil, le pois, le pétunia, le tabac, Arabidopsis et Avena sativa. Les séquences en acides aminés déduites de ces gènes montrent une forte conservation sur toute la longueur de la protéine avec une forte similarité dans les 11 domaines nécessaires à la fonction catalytique de ces sérine/thréonine PK. Les extensions N- et C-terminales sont plus divergentes, mais restent conservées dans un sous-groupe spécifique des plantes, supposant une importance biologique de ces séquences (spécificité au substrat ou interactions avec d'autres protéines). Pour l'instant, les séquences en acides aminés des MAPK végétales ont plutôt révélé une homologie à la famille des ERK, mais certaines EST et séquences obtenues du projet génoplante (séquençage total du génome d'arabidopsis) sont clairement différentes. Au moins 4 sous-groupes ont été déduits de ces séquences, qui pourraient refléter des fonctions similaires dans des espèces différentes : par exemple, les MAPK des sous-groupes I et II seraient impliquées dans la réponse aux pathogènes et aux stress abiotiques ( Jonak et al, 1999), alors que certaines MAPK du sous-groupe III sont impliquées dans la régulation du cycle cellulaire (Bögre et al, 1999, 2000). La majorité des MAPK végétales possèdent le motif T-E-Y sur le site de phosphorylation. Des exceptions existent avec le motif T-D-Y, comprenant les MAPK d'arabidopsis AtMPK8 et 9 (Meskiene et Hirt, 2000), de la luzerne TDY1 (Schoenbeck et al, 1999) ou du riz BWMK1 (He et al, 1999). Ces 4 MAPK ont également la particularité d'avoir une longue extension C- terminale leur conférant des caractéristiques diverses comme une structure en hélice α favorable à un ancrage membranaire pour TDY1 (Schoenbeck et al, 1999) ou un site de phosphorylation tyrosine-kinase pour BWMK1 (He et al, 1999). La diversité des MAPK leur permet d'intervenir dans un grand nombre d'événements cellulaires. Leur implication a été mise en évidence dans des phénomènes aussi divers que des stress biotiques ou abiotiques, des réponses aux pathogènes ou aux hormones végétales et la régulation du cycle cellulaire Stress abiotiques ou mécaniques La disponibilité en eau, les températures extrêmes, le vent, la pluie, les radiations,... sont des facteurs de stress limitants pour le développement et la croissance végétale. L'adaptation des plantes (différenciation, réduction de la croissance, épaississement de la paroi) dépend principalement de l'expression de certains gènes qui font évoluer des composants essentiels pour la cellule. L'intervention de MAPK dans la régulation des chocs osmotiques a été démontrée dans plusieurs espèces végétales. Chez la luzerne, SAMK est régulée au niveau de la transcription par des stress hydriques (Jonak et al, 1996) mais est également activée par le stress mécanique que constitue l'agitation de suspensions cellulaires (Bögre et al, 1996). Toujours chez la luzerne, Munnik et al (1999) ont mis en évidence la SIMK (MAPK constitutivement nucléaire dont l'activité n'est pas corrélée à un changement de compartiment cellulaire) activée par des concentrations de mm de sel ; des concentrations plus élevées n'activent plus la SIMK mais une PK de 35 kda, indiquant la présence de 2 osmosenseurs dans ce système, selon que la pression osmotique est modérée ou élevée. Chez Arabidopsis, AtMEKK1 et AtMPK3 (une MAPK homologue de SAMK) ne sont pas seulement transcriptionnellement induites par une stimulation mécanique, mais aussi par la déshydratation (Mizoguchi et al, 1996). AtMEKK1, exprimée chez des levures, permet leur survie sur un milieu hypersalé, certainement grâce à la synthèse accrue de glycérol (Covic et al, 1999). Dans des cellules de tabac traitées par un stress hypoosmotique, 2 PK de 46 et 50 kda sont activées ; la PK de 50 kda est une homologue de Ntf4 (Cazalé et al, 1999), une MAPK également activée pendant la réhydratation du pollen (Wilson et al, 1997). Les 2 PK ont été identifiées comme étant les WIPK et SIPK (Droillard et al, 2000) qui sont également activées par d'autres stimuli : la SIPK par un choc hyperosmotique (Hoyos et al, 2000 ; Mikolajczyk et al, 2000 ; Droillard et al, 2000) et la WIPK par des blessures (Seo et al, 1995). Une troisième PK signalée selon les auteurs à 40, 42 (homologue de ASK1 selon Mikolajczyk et al, 2000) ou 44 kda, serait plus spécifique du choc osmotique. D'autres stress ont été associés à l'activation d'une MAPK. En 1999, He et al ont isolé une MAPK du riz, BWMK1, activée par des blessures mécaniques et des infections par le champignon Magnaporthe grisea. Stratmann et al (2000) ont testé les effets des radiations UVB/UVA sur des jeunes plants de tomate : ils induisent l'activation d'une MAPK de 48 kda dans les feuilles, et la synthèse systémique potentielle d'un inhibiteur de protéinase en réponse à une blessure, suggérant une contribution de l'irradiation solaire dans l'interaction plante-herbivores/pathogènes. EPHE Banque de Monographies SVT 16

17 Signalisation hormonale et régulation du cycle cellulaire Les cellules végétales communiquent à distance par sécrétion et transport d'hormones et de molécules de signalisation variées. De nombreux travaux suggèrent l'implication de modules MAPK dans les réponses à l'auxine, l'éthylène, l'acide jasmonique, l'acide salicylique ou la gibberelline. Kovtun et al (1998) ont montré que l'activation constitutive de NPK1 (une MAPKKK du tabac) active une kinase de type MAPK et inhibe spécifiquement l'expression de gènes induits par l'auxine. Ces 2 voies de transduction antagonistes pourraient ajuster la sensibilité des cellules à l'auxine. Selon Machida et al (1998), NPK1 n'est présent que dans les cellules en division et agit probablement pendant la mitose. Néanmoins, Tena et Renaudin (1998) n'ont décelé aucune MAPK activée par des niveaux physiologiques d'auxine dans des cellules de tabac pendant les 2 premières heures de traitement, alors qu'une acidification cytoplasmique induite par des acides faibles lipophiles (comme le sont l'auxine dans des concentrations non physiologiques, l'acide butyrique ou l'acide acétique) est suffisante pour induire l'activation d'une MAPK, suggérant un rôle fonctionnel de cette acidification cytoplasmique comme second messager dans l'activation de MAPK en réponse à divers stress par les plantes. Calderini et al (2001) ont récemment identifié une MAPKK de tabac (NtMEK1) par le système double hybride, qui activerait la MAPK NTF6 impliquée dans le cycle cellulaire (Calderini et al, 1998). Une autre MAPK homologue de NTF6, AtMMK3, serait détectable seulement dans les cellules en division chez Arabidopsis (Bögre et al, 2000). Des MAPK seraient impliquées dans la réponse à l'éthylène chez les plantes : des mutants d'arabidopsis montrant une triple réponse constitutive (CTR) en absence d'éthylène ont permis d'isoler et de cloner le gène correspondant CTR1, qui est similaire à Raf (PK animale activatrice de MAPKK) et est activé par des composants en amont dont ETR1, le récepteur membranaire de l'éthylène (Woeste et Kieber, 1998). Des MAPK ont été impliquées dans la réponse à l'acide salicylique (SA) ou dans la signalisation cellulaire permettant la production d'acide jasmonique (JA) : SA active la SIPK chez le tabac (Zhang et Klessig, 1997) et l'activation de WIPK serait nécessaire pour déclencher la cascade de transduction induite par JA sur des tabacs subissant une blessure (Seo et al, 1999). La gibberelline (GA) est une autre hormone influençant l'expression d'une MAPK (AsPK9) chez Avena sativa : l'accumulation de transcripts d'aspk9 se produisant en absence de GA est inhibée en sa présence (Huttly et Phillips, 1995) Réponses de défense aux pathogènes L'induction des réponses de défense est majoritairement le résultat de l'interaction entre un éliciteur produit par le pathogène et un récepteur de la plante. Les voies de signalisation menant aux réponses de défense de la plante font l'objet de recherches intensives : les changement de profils de phosphorylation, les flux d'ions, le calcium, les FAO sont autant de phénomènes jouant un rôle important. Une étude de Suzuki et Shinshi (1995) a montré que le traitement de cellules de tabac par un éliciteur fongique (PiE de Phytophthora infestans) déclenchait l'activation d'une PK de 47 kda ayant les caractéristiques d'une MAPK. En traitant les cellules de tabac avec un autre éliciteur (TvX de Trichoderma viride), Suzuki et al (1999) décèlent l'activation de la même MAPK de 47 kda, avec une intensité égale mais une durée d'activation supérieure, ainsi qu'une mort cellulaire hypersensible, suggérant que, de même que JNK a un rôle dans l'apoptose des cellules animales, l'activation soutenue de la p47-mapk pourrait induire la mort cellulaire hypersensible chez les plantes. La preuve réelle de l'implication d'une MAPK dans la réponse aux pathogènes a été réalisée sur des cellules de persil traitées par l'éliciteur Pep13, dérivé de Phytophthora sojae : la reconnaissance de l'éliciteur par un récepteur plasmique entraîne l'activation de canaux ioniques, puis d'une MAPK (nommée ERMK qui présente plus de 80 % d'homologie avec MPK3 d'arabidopsis, MMK4 de la luzerne ou WIPK du tabac) à la fois au niveau traductionnel et transcriptionnel, ces événements se situant en amont ou indépendamment de la production de FAO ; ERMK est transloquée dans le noyau, suggérant qu'elle pourrait être le lien entre le signal de transduction cytoplasmique et l'activation des gènes de défense dans le noyau (Ligterink et al, 1997). Récemment, le modèle persil/phytophthora a été utilisé pour étudier l'influx calcique induit par les éliciteurs (Fellbrich et al, 2000) : Pep25 et Pp (oligopeptides dérivés respectivement de la paroi de Phytophthora infestans ou de Phytophthora parasitica) stimulent de façon similaire dans des suspensions cellulaires de persil l'accumulation de gènes de défense, la production de phytoalexines et les flux ioniques. Mais la concentration du calcium cytoplasmique, suivie sur des cellules transformées par l'aequorine, atteint un niveau plus élevé avec Pep25 (300 nm) en comparaison à Pp (175 nm), suggérant l'activation d'une même cascade de signalisation cellulaire par des sites de fixation différents selon le ligand. Il a été prouvé pour chaque éliciteur que le calcium extracellulaire était essentiel à l'activation du burst oxydatif, à l'activité d'une MAPK (immunoprécipitée avec un anticorps polyclonal dirigé contre les 10 acides aminés C-terminaux de MMK4) et à la production de phytoalexines. Chez le tabac, la SIPK initialement identifiée par son activation transitoire par SA (Zhang et Klessig, 1997) est également activée rapidement et sur des périodes longues (plusieurs heures), ainsi que des PK de 44 et 40 kda avec des temps de latence EPHE Banque de Monographies SVT 17

18 plus longs, par des traitements avec les éliciteurs fongiques parasiticéine et cryptogéine (Zhang et al, 1998b). Romeis et al (1999) ont également détecté l'activation de la SIPK, ainsi que de la WIPK, dans des plants ou des cellules de tabac transformés par le gène de résistance (R) de la tomate Cf9 élicités par Avr9, montrant que l'induction des mécanismes de défense chez les plantes via la reconnaissance dite gène-pour-gène (Voir Introduction) emprunte des voies de signalisation parallèles, et que les MAPK sont interconnectées dans les réponses non seulement aux éliciteurs non race-spécifiques mais aussi aux stimuli abiotiques (blessures, stress mécanique). La protéine bactérienne harpine, originaire de Erwinia amylovora ou de Pseudomonas syringae pv. syringae, utilisée respectivement sur le tabac (Adam et al, 1997) ou sur Arabidopsis (Desikan et al, 1999a) déclenche l'activation de PK ayant les caractéristiques des MAPK avec des masses de 49 kda pour les MAPK de tabac et de 39 ou 44 kda pour les MAPK d'arabidopsis, indiquant que les éliciteurs bactériens déclenchent également l'activation de MAPK chez les plantes. Nühse et al (2000), par utilisation d'éliciteurs d'origine fongique (xylanase et chitohexaose), bactérienne (flagelline) ou végétale (fragments pectiques), ont démontré l'activation de 2 PK de 45 et 49 kda chez Arabidopsis, indiquant une voie de signalisation conservée, et identifié la MAPK de 49 kda comme étant AtMPK6, par homologie avec celle du tabac (SIPK a 90% d'homologie avec AtMPK6). Selon Petersen et al (2000), une autre MAPK d'arabidopsis, AtMPK4, serait nécessaire pour réprimer la RSA, elle-même dépendante d'un taux élevé d'acide salicylique, et interviendrait dans l'expression de gènes en réponse à l'acide jasmonique. AtMPK4 est activée in vitro par AtMEK1 (une homologue de MEK chez Arabidopsis) par la phosphorylation principalement du résidu thréonine, alors que la phosphorylation du résidu tyrosine, indispensable à l'activité de la PK (la tyrosine phosphatase AtPTP1 supprime presque toute l'activité de la MAPK), serait réalisée par autophosphorylation ; AtMEK1 ne serait donc pas une kinase à double spécificité, contrairement aux MEK animales (Huang et al, 2000). Chez la luzerne, 4 MAPK sont activées avec des cinétiques et des niveaux différents selon l'éliciteur (tous dérivés de paroi de levure) utilisé pour traiter les cellules (Cardinale et al, 2000): SIMK et MMK3 sont activées principalement alors que SAMK et MMK2 le sont moins ; SIMK et SAMK sont également associées à divers stimuli (stress osmotique, hydrique, mécanique), et MMK3 est activée pendant la mitose ; MMK2 (jusqu'ici non reliée à un processus physiologique) et MMK3 sont associées ici à une réponse de défense à un pathogène qui représente un stimulus externe. Mais surtout, les auteurs ont démontré que des cellules végétales peuvent interpréter différents signaux d'un même micro-organisme (ici, la levure) par le biais de l'activation de multiples MAPK MAPKK et MAPKKK Un certain nombre de MAPKK (pour revue : Bögre et al, 2000) et MAPKKK (pour revue : Jouannic et al, 1999) végétales ont été caractérisées depuis La plupart sont impliquées dans une réponse physiologique particulière et sont activées par le stimulus correspondant (Bent, 2001). Une des exceptions à ce mécanisme, procédant d'une inactivation de MAPKKK, concerne l'interaction de CTR1 (MAPKKK d'arabidopsis) avec le récepteur de l'éthylène ETR1: des mutants ctr1 d'arabidopsis montrent une activation constitutive de la réponse à l'éthylène, hormone importante dans la croissance et le développement des plantes, ainsi l'éthylène inactiverait une cascade MAPK initiée par CTR1 (Woeste et Kieber, 1998), néanmoins aucune MAPKK ou MAPK participant à la réponse à l'éthylène n'a été reportée à ce jour (Bent, 2001). Un autre travail intéressant a été réalisé par Frye et al (2001) sur un mutant edr1 (enhanced disease resistance) d'arabidopsis qui confère une résistance accrue au mildiou corrélée avec l'induction de réponses de défense : des double mutants qui portent une deuxième mutation bloquant la perception de l'acide salicylique (nim1) ou réduisant sa production (pad4 et eds1) n'ont plus le phénotype edr1 ; le gène EDR1 code pour une MAPKKK similaire à CTR1, suggérant que EDR1 fonctionne en tête d'une cascade MAPK qui régule négativement les réponses de défense inductibles par SA. Des connections entre différents composants des modules MAPK ont été établies par utilisation du système double hybride ou par reconstruction d'un module MAPK avec des composants végétaux chez la levure, mais la fonction et l'existence de ces voies de signalisation restent à vérifier in planta. Le système double hybride a permis de mettre en évidence des interactions entre des MAPKK et des MAPK telles que MEK1 et AtMPK4 chez Arabidopsis (Mizoguchi et al, 1998), SIPKK et SIPK (Liu et al, 2000) ou NtMEK1 et NTF6 (Calderini et al, 2001) chez le tabac, SIMKK et SIMK chez la luzerne (Kiegerl et al, 2000). Mizoguchi et al (1998) ont également montré des interactions entre MEK1 et AtMEKK1 (une MAPKKK d'arabidopsis) par le système double hybride, qui avec les interactions entre AtMPK4 et MEK1, regrouperaient tous les constituants nécessaires à une cascade MAPK végétale. Des tests de complémentation chez la levure ont établi une caractérisation fonctionnelle d'atmekk1 : elle permet la survie et la croissance de levures sur milieu hypersalé quand les autres composants HOG1 et PBS2 sont présents, et complémente le triple mutant sho1/ssk2/ssk22, suggérant son implication dans la réponse au stress osmotique (Covic et al, 1999). Les mutants végétaux sont d'autres outils qui permettent une approche in vivo pour l'étude des modules MAPK. En utilisant des plantes transformées, Kovtun et al (2000) ont montré que ANP1 et NPK1, des MAPKKK orthologues respectivement d'arabidopsis et de tabac, interviennent dans la transduction du signal H 2 O 2 en activant AtMPK3 et AtMPK6, les 2 MAPK induites par le stress chez Arabidopsis. Celles-ci vont à la fois activer l'expression de gènes de réponse aux stress pour EPHE Banque de Monographies SVT 18

19 protéger les plantes et réprimer des promoteurs inductibles par l'auxine. Ce double rôle (expression de gènes et inhibition de la réponse à l'auxine) allierait une adaptation au stress à une inhibition de la prolifération cellulaire (Bögre et al, 2000). Plus récemment, Yang et al (2001) ont utilisé des mutants de tabac transformés avec une MAPKK constitutivement active NtMEK2 DD (par remplacement des résidus Ser/Thr avec Glu ou Asp) pour mettre en évidence son effet activateur sur 2 MAPK normalement activées par des stress biotiques ou abiotiques : NtMEK2 DD active in vitro SIPK et WIPK, et in vivo ces mêmes MAPK endogènes, menant à l'activation de gènes de défense (qui contrôlent par exemple l'expression de HMGR et PAL) et à une mort cellulaire de type hypersensible, démontrant que la cascade NtMEK2-SIPK/WIPK contrôle des réponses de défense multiples intervenant dans la résistance des plantes aux maladies. La structure des MAPKKK est très divergente (24 à 90% d'identité sur le domaine kinase catalytique) mais permet une classification en 3 familles majeures : type STE11/MEKK, type Raf et un groupe spécifique des plantes avec NPK1 comme modèle initial (Jouannic et al, 1999). Certains motifs des extensions N- ou C-terminales laissent envisager des interactions protéine-protéine mais ces motifs sont différents de ceux présents chez les MAPKKK animales, laissant envisager des connections avec des composants spécifiquement végétaux. Les connaissances sur le nombre et la fonction des composants végétaux en amont des cascades de MAPK ne permettent pas actuellement de faire une estimation du nombre total des modules MAPK intervenant chez les plantes. Les composants déjà identifiés de cette voie de signalisation montrent sa complexité (Bögre et al, 2000 ; Bent, 2001). ANP1/NPK1 jouent un rôle dans la signalisation du stress oxydatif, de l'auxine (hormone de croissance végétale) et également dans le cycle cellulaire ; ces diverses fonctions assurées par une même MAPKKK peuvent s'expliquer par sa capacité à fonctionner dans plusieurs cascades, comme STE11 chez la levure, ou à activer des PK distinctes dans les cascades de MAPK (Hirt, 2000). La surexpression ou la sous-expression d'une protéine agissant sur les mécanismes de défense des plantes est un outil d'intérêt pour la recherche dans la transduction du signal et peut ouvrir de nouvelles voies d'intérêt économique dans l'amélioration de la résistance des plantes aux maladies. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Adam AL, Pike S, Hoyos ME, Stone JM, Walker JC, Novacky A (1997) - Rapid and transient activation of a myelin basic protein kinase in tobacco leaves treated with harpin from Erwinia amylovora. Plant Physiol., 115 : Alvarez ME (2000) - Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease resistance. Plant Mol. Biol., 44 : Baluska F, Ovecka M, Hirt H (2000) - Salt stress induces changes in amounts and localization of the mitogenactivated protein kinase SIMK in alfalfa roots. Protoplasma, 212 : Binet M-N, Bourque S, Lebrun-Garcia A, Chiltz A, Pugin A (1998) - Comparison of the effects of cryptogein and oligogalacturonides on tobacco cells and evidence of different forms of desensitization induced by these elicitors. Plant Sci., 137 : Binet M-N, Humbert C, Lecourieux D, Vantard M, Pugin A (2001) - Disruption of microtubular cytoskeleton induced by cryptogein, an elicitor of hypersensitive response in tobacco cells. Plant Physiol., 125 : Blume B, Nürnberger T, Nass N, Scheel D (2000) - Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell, 12 : Bogdanove AJ, Martin GB (2000) - AvrPto-dependent Pto-interacting proteins and AvrPto-interacting proteins in tomato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : Bonnet P, Poupet A, Abad P, Venard P, Cardin L (1986) - Induction de nécroses foliaires, de protéines b et de résistance dans les interactions tabac-phytophthora. Agronomie, 6 : Bonnet P, Bourdon E, Ponchet M, Blein J-P, Ricci P (1996) - Acquired resistance triggered by elicitins in tobacco and other plants. Eur. J. Plant Pathol., 102 : Bourque S, Ponchet M, Binet M-N, Ricci P, Pugin A, Lebrun-Garcia A (1998) - Comparison of binding properties and early biological effects of elicitins in tobacco cells. Plant Physiol., 118 : Bourque S (1999) - Effets comparés des élicitines et caractérisation de leur site de fixation chez le tabac. Thèse de 3 ème cycle, Université de Bourgogne - Dijon, 127 p. EPHE Banque de Monographies SVT 19

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