Introduction à l immunocytochimie. Pierre Gounon CCMA Faculté des Sciences Nice Cedex 2

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1 Introduction à l immunocytochimie Pierre Gounon CCMA Faculté des Sciences Nice Cedex 2

2 istorique et développements Origine: Albert. Coons, 1941 qui utilise la fluorescéine Introduction des marquages avec des enzymes (Avraméas et Uriel 1966) d abord avec la RP puis la phosphatase alcaline (1978), la glucose oxydase (1979), la ß-D-Galactosidase (1982) Introduction de marqueurs denses aux électrons avec la ferritine (1961) puis l or colloïdal (Faulk & Taylor, 1971) Exploitation de l interaction forte entre avidine et biotine (Guesdon, 1979)

3 istorique et développements Année Application Traceur Auteurs Immunofluorescence Fluorescéine Coons 1959 Microscopie électronique Ferritine Singer 1966 Microscopie optique Enzymes Nakane 1971 Microscopie électronique Enzymes Avrameas et Ternynck 1971 Microscopie électronique or colloïdal Faulk et Taylor 1975 Microscopie à balayage or colloïdal orisberger et coll.

4 Définition Technique permettant d identifier un antigène dans un tissu ou dans une localisation cellulaire La définition de l immunocytochimie est l utilisation d anticorps marqués comme des réactifs spécifiques pour la localisation de constituants in situ La réaction antigène anticorps est absolument spécifique

5 Définition: méthode directe Traceur Anticorps Antigène Tissu Avantages : Immunoréaction la plus simple et la plus rapide (1 seule étape), Idéal pour les marquages multiples, Distance minimale entre traceur et antigène : marquage le plus précis. Inconvénients : Nécessité, dans la plupart des cas, de marquer soi-même l'anticorps, Sensibilité réputée inférieure à celle des techniques "en plusieurs étapes".

6 Définition: méthode directe Les anticorps spécifiques sont couplés au marqueur Il faut faire un traitement préalable pour éviter le bruit de fond Réaction souvent trop faible, la méthode est peu utilisée

7 Définition: méthode indirecte ou à deux étapes Traceur Anticorps secondaire Anticorps primaire ETAPES 2 1 Méthode plus sensible car légère amplification (Coons 1955) Versatilité par le choix des anti-igg de la 2 ème couche Économique Antigène Tissu

8 Définition: méthode indirecte Méthode plus sensible car légère amplification (Coons, 1955) Versatilité par le choix des anti-igg de la 2 ème couche Cette vision des choses est toutefois très théorique

9 Techniques "sandwich" ou "bridge" Un anticorps est pris en sandwich (il sert de pont ou "bridge") entre l'anticorps primaire et le système révélateur. L'anticorps secondaire doit pouvoir reconnaître le premier et le troisième anticorps : ils doivent donc provenir de la même espèce (ou d'espèces voisines reconnues par le 2 anticorps). ETAPES ETAPES Traceur 4 Traceur 3 anticorps anti (traceur) 3 3 anticorps marqué 3 2 anticorps 2 2 anticorps 2 1 anticorps 1 1 anticorps 1 Antigène Antigène A B

10 Les anticorps Production monoclonale ou polyclonale Les 2 types ont des avantages et des limites Les étapes de test et de caractérisation des anticorps est capitale Plusieurs méthodes peuvent être utilisées et doivent être convergentes La méthode de test positif est la meilleure Il y a deux types d anticorps: les bons et les mauvais * Prendre avec précaution les anticorps du catalogue!

11 Caractéristiques d un bon anticorps Doit avoir une haute affinité pour son antigène C est-à-dire qu il doit se lier parfaitement à son antigène sans confusion avec des antigènes voisins ou modifiés Doit avoir une grande avidité (force de liaison) C est-à-dire qu il ne part pas de son site au cours de lavages par ex. Le titre doit être élevé Ce qui permet d utiliser de grandes dilutions et d améliorer la rapport signal/bruit. La concentration de travail devrait être entre 1 et 10 µg/ml

12 Test de spécificité (compétition) L'antisérum (ou anticorps) est préincubé avec l'antigène. On doit observer, suivant la quantité d'antigène ajouté, une suppression partielle ou totale du marquage si la réaction est spécifique : Préincubation anticorps-antigène Marquage supprimé Marquage Contrôle par compétition

13 Caractéristiques d un bon anticorps Dilution Tester un anticorps (ou un antisérum) à différents dilutions (4 ou 5 dilutions en cascade) permet de déterminer la dilution de travail de ce réactif. La différence entre l'intensité du marquage spécifique et l'intensité du bruit de fond est le contraste du marquage auquel l'œil de l'observateur est sensible. Plus cette valeur est élevée, plus le marquage est contrasté et la gamme de dilution utilisable étendue. Intensité Intensité Marquage Contraste Bruit de fond Dilution Dilution Plage de dilution utilisable Effet de la dilution de l'antisérum (ou de l'anticorps) sur le marquage. Bien que l'intensité du marquage spécifique soit identique dans les 2 cas, on a, à gauche, un réactif très médiocre et, à droite, un excellent réactif : ceci est dû uniquement à une différence d'intensité du bruit de fond. Différents artifices permettent parfois d atténuer le bruit de fond.

14 Conditions essentielles pour l immunocytochimie Préservation de l antigène dans le contexte cellulaire ou tissulaire (fixation) Marquage spécifique et sensible avec absence de marquage non spécifique Anticorps bien caractérisés Marquage et détection efficaces

15 Conditions essentielles pour l immunocytochimie Fixation Rendre l antigène insoluble mais cependant disponible Préserver tous les composants cellulaires, la morphologie, les effets osmotiques Fixation par les aldéhydes (pontage) Formaldéhyde Forme des ponts hydroxy-méthylène Doit être préparé fraîchement et tamponné (~ p 7,5) Fixation fonction du temps, de la concentration et de la température Partiellement réversible (rinçage, traitement par N4Cl) Glutaraldéhyde Pas réversible A réserver pour l ICC ultrastructurale (autofluorescence)

16 Conditions essentielles pour l immunocytochimie Agents de pontage chimique Ils créent des ponts intra- et inter-moléculaires qui immobilise les molécules. Aldéhydes Ils ont pour formule générale : R CO. Ils réagissent essentiellement avec les groupements aminés des protéines. Les plus couramment utilisés sont le formaldéhyde, le glutaraldéhyde et l'acroléine. O Formaldéhyde C 2 Acroléine O O Glutaraldéhyde Formaldéhyde C'est l'agent de fixation le plus souvent utilisé. Il entre seul ou en combinaison avec d'autres réactifs dans la composition de très nombreux fixateurs. Il est presque toujours préparé à partir de paraformaldéhyde lorsqu'il est destiné à un usage délicat comme l'immunocytochimie et l'hybridation in situ. Il réagit avec les composés ayant un hydrogène actif (amines par exemple) et forme des ponts méthylène ( C2 ) : O Il réagit avec les amines biogènes (sérotonine, dopamine, etc.) pour donner des composés à fluorescence jaune (réaction FIF ou Formaldéhyde-Induced-Fluorescence) qui peuvent gêner l observation des immunoréactions utilisant comme traceur la fluorescéine.

17 Conditions essentielles pour l immunocytochimie Agents de pontage chimique Ils créent des ponts intra- et inter-moléculaires qui immobilise les molécules. Aldéhydes Ils ont pour formule générale : R CO. Ils réagissent essentiellement avec les groupements aminés des protéines. Les plus couramment utilisés sont le formaldéhyde, le glutaraldéhyde et l'acroléine. R N 2 + O O + N 2 R' Protéine Glutaraldéhyde Protéine N N R R' + 2 O

18 Conditions essentielles pour l immunocytochimie Fixateur précipitants Méthanol, acétone Ce sont des fixateurs chaotropiques qui fonctionnent par extraction brutale de l eau moléculaire Ils doivent être parfaitement secs (pas facile!) Efficaces car rapides, fonctionnent à très basse température. Extraction notable, éviter pour des petits peptides. Dans une première approche, faire une fixation // Formol et Méthanol puis comparer les résultats. O O 3 C O 3 C C 3 Méthanol Ethanol Acétone

19 Conditions essentielles pour l immunocytochimie Fixateurs complexes Fixateurs de Bouin, Zamboni, Carnoy, etc. Le fonctionnement de ces fixateurs est discuté (et discutable!) Fonctionnent mais de façon empirique. Souvent utilisés mais peu recommandables O - O NO 2 NO 2 NO 2 NO 2 Acide picrique NO 2 NO 2 Fixateur PLP (Periodate-Lysine-Paraformaldehyde; McLean & Nakane, 1974) Fixateur compliqué à préparer (attention aux mauvaises recettes) Avantages?

20 Conditions essentielles pour l immunocytochimie Recipes For Making PLP Fixative (Paraformaldehyde/Lysine/Periodate) 8% Paraformaldehyde Stock : 1. eat 800 ml of 2O to 55 C. 2. Add 6 drops of 50% w/w NaO. 3. Add 80 grams of Paraformaldehyde from Electron Microscopy Sciences (Cat# 19202) and stir continuously on heat/stir plate. Do not allow powder to settle on bottom of beaker) 4. DO NOT ALLOW TEMP TO EXCEED 60 DEGREES C. OR YOU WILL MAKE FORMIC ACID!!!!! 5. Stir until solution is clear. A small amount of flocculent material will remain. 6. Vacuum filter through a 3mm Whatman filter in a Buchner funnel on a filter flask. 7. Top off to 1 liter and do not store. 0.4 M Phosphate Buffer Stock: (use at 0.1M on tissues) 1. Dissolve Grams of Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate in 100 ml 2O. 2. Dissolve 49.4 Grams of Sodium Phosphate in 750 ml Add #1 and #2 in a 1 Liter cylinder and top off to 1 liter with If you have properly weighed out the chemicals, you should now have p7.6. Do not correct with acid or base. 5. This stock solution must be diluted with 20 to be used on tissues at 0.1M. 6. This may be stored at room temp for up to 6 months. Lysine Stock: To be used for making PLP mix 1. Dissolve 16.4 grams of L-Lysine (Sigma cat #L5626) in 300 ml Adjust p to 7.4 with 0.1M Na2PO4 3. Add 20 to 450 ml 4. Add 0.1M Phosphate buffer to 900cc 5. This may be stored at 4 Degrees C. for up to 3 weeks. Sodium m-periodate: 1. Purchase from Sigma (Cat#s gram bottles) 2. This will be used to make PLP fixative To Make PLP fixative (prepare just before use) Use 50 ml polypropylene centrifuge tube to mix solutions in (convenient) 1. Add 30 mls of Lysine Stock 2. Add 10 mls of 8% Paraformaldehyde 3. Add grams of Sodium m-periodate powder 4. Shake until powder dissolves. 5. Fixation for 1h to 24 h. 6. Rinse your samples with 0.1M Phosphate Buffer Reference: McLean I. And Nakane P.K. Periodate-Lyline-Paraformaldehyde fixative-a New Fixative for Immunoelectron Microscopy. Journal of istochemistry and Cytochemistry, 22, , 1974.

21 Problèmes et remèdes aut niveau de bruit de fond aut niveau de bruit de fond Peut avoir plusieurs origines L anticorps primaire Les anticorps secondaires ou marqués Des facteurs tissulaires (sites de liaisons non spécifiques, récepteurs Fc, protéines basiques Remèdes Diluer l anticorps primaire Déterminer l origine du bruit de fond (tester l anticorps secondaire et/ou tertiaire) Pour les facteurs autres que précédents, plusieurs possibilités:

22 Problèmes et remèdes aut niveau de bruit de fond Pour les facteurs tissulaires : Augmenter la concentration des protéines de blocages (BSA/Sérum) Ajouter des détergents (ex. tween 20 de 0,05% à 0,2%) Augmenter NaCl (de 0,9% à 2,5% par étapes) Augmenter le p de la solution d incubation (jusqu à p 9,0; faire des tampons Tris de 20 à 50 mm, éliminer le PBS) Ajouter de la poly-l-lysine, protéine basique (PM ) jusqu à 2 mg/ml dans la solution d anticorps primaire Pour les aldéhydes laissés dans le tissu: Laver les tissus Ajouter un traitement par N 4 Cl (de 10 à 100 mm) Traiter par NaB 4 ou KB 4 dans 0,1M tampon phosphate (2-30 min, RT)

23 Marquages faibles ou absents Origines possibles Méthode choisie peu sensible pour la rareté de l antigène Méthode en 2-3 couches Amplification enzymatique L antigène est masqué (sur-fixation) Récupération par traitement par des protéases (!) Récupération par la chaleur (!!) Détérioration de l anticorps Éviter les congélations-décongélations Éviter les contaminations Éviter les solutions trop diluées/concentrées Erreurs dans les solutions! Recommencer (!!)

24 Conservation des anticorps Stockage à 4 C Ajouter 0,1% NaN 3 Éviter de conserver des solutions diluées (sinon ajouter 0,1% BSA et 1% sérum qui diminuent le collage sur les parois du tube) On peut aussi ajouter du glycérol (au moins 30% final, mais faire attention à la dilution finale) Stockage à -20 C Faire des fractions aliquotes pour éviter la congélation décongélation Avec 30% glycérol mini, la solution ne congèle pas (mais attention à la dilution finale d utilisation!)

25 Temps d incubation? La vitesse de la réaction antigène anticorps est fonction de la T Rapide à T ordinaire, mais bruit de fond Plus spécifique à 4 C, mais plus lente. Important! Les temps d incubation sont toujours trop courts! Une heure est le minimum, 2-3 h à T labo est bien. OU MIEUX la nuit en chambre froide! Attention: Bien faire la chambre humide.

26 Un protocole standard qui va bien PBS ou TBS + N 4 Cl 50 mm soit 0,25% 5 min. PBS 1% NGS, 1% BSA, p 7,5 ou > 5 10 min(*). Anticorps dilué dans PBS-BSA-NGS (**) Rinçage PBS 0,1% BSA 10 min. en plusieurs bains Anticorps marqué dilué dans PBS BSA NGS (***) Rinçage PBS en plusieurs bains Montage final (milieu anti fading) (*) On peut ajouter du Tween (ou Triton X100) ~ 0,2% (**) Le temps d incubation est à déterminer par l expérimentateur (***) On évite d utiliser les surfactants avec les anticorps marqués

27 Vers istoire de la GFP Vers Qdots

28 istoire de la GFP Deux Américains, Roger Tsien et Martin Chalfie, et un Japonais, Osamu Shimomura, sont récompensés par le prix Nobel de chimie 2008 pour la découverte de la protéine fluorescente GFP et la mise au point de son utilisation comme marqueur. Un honneur mérité pour un travail qui a fait progresser à pas de géant notre connaissance du vivant.

29 L'idée d'utiliser des molécules fluorescentes est ancienne. Réémettant une lumière d'une certaine couleur lorsqu'ils sont éclairés, ces colorants originaux ont donné naissance à la microscopie par fluorescence, ensemble de techniques faisant appel à des microscopes spéciaux. Mais ces molécules lumineuses ont longtemps été toxiques, limitant leur usage. Osamu Shimomura, l'homme qui a découvert la GFP. Le cadeau de la méduse Il y a bientôt un demi-siècle, au début des années 1960, un biologiste marin qui était aussi chimiste, le Japonais Osamu Shimomura, s'est intéressé à une méduse du Pacifique, Aequorea victoria, capable, comme d'autres organismes marins, d'émettre de la lumière par fluorescence. Ce cnidaire utilise deux molécules, l'une (baptisée aequorine) émettant une lumière bleue (395 nanomètres) qui excite la seconde, la GFP, petite protéine de 238 acides aminés, laquelle réémet une lumière verte (508 nanomètres). Ses résultats sont publiés en 1962 mais la GFP n'éveille pas tout de suite l'intérêt des biologistes.

30 Dans les années 1980, un Américain, Douglas Prasher, émet une idée originale. Si l'on parvient à installer le gène de la GFP juste après un gène produisant une certaine protéine, celle-ci, lorsqu'elle sera fabriquée, portera une séquence supplémentaire, celle de la GFP. Elle deviendra ainsi visible pour peu qu'on l'éclaire avec une lumière bleue. Voilà un moyen d'étudier la production d'une protéine, dans des cellules en culture voire, pourquoi pas, chez un organisme vivant. Martin Chalfie, celui qui a découvert comment intégrer le gène de la GFP à un endroit quelconque du génome. C'est Martin Chalfie qui concrétisera cette brillante idée en 1994 en rendant fluorescentes deux vedettes des laboratoires, la bactérie Escherichia coli et le ver Caenorhabditis elegans (un nématode).

31 L'année suivante, Roger Tsien réussit à mettre au point des variantes de GFP de couleurs différentes, obtenues par mutation de son gène. Le bleu, le cyan et le jaune viennent ainsi compléter le vert naturel de la GFP de la méduse. Une autre protéine naturelle, DsRed, rougeâtre comme son nom l'indique, est ensuite découverte chez un organisme marin, un corail. Grâce à cette palette colorée, les chercheurs peuvent mettre en évidence simultanément plusieurs phénomènes. Roger Tsien, qui apporta la couleur...

32 Une composition obtenue par Roger Tsien en colorant différemment des colonies bactériennes à l'aide de GFP mutées et de dsred, obtenu chez le corail Discosoma.