RENIN-ELISA. Active Renin. Notice d utilisation - FR. 1. NOM ET INDICATION 2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION 3. PRINCIPE

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1 Cisbio Bioassays Parc Marcel Boiteux BP Codolet / France Téléphone : +33 (0) Télécopie : +33 (0) RENIN-ELISA Notice d utilisation - FR Active Renin Référence du document : 01 - Juin NOM ET INDICATION La trousse RENIN-ELISA est un immunodosage destiné à la mesure quantitative diagnostique in vitro de la concentration de rénine active dans un plasma traité par EDTA. Le dosage de la rénine est utilisé pour le diagnostic et le traitement de certains types d hypertension. 2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION La rénine est une enzyme protéolytique acide produite et sécrétée par les cellules juxtaglomérulaires. Elle clive l angiotensinogène en angiotensine I (inactive), ce qui conduit ensuite à la production d angiotensine II (active). Par conséquent, la rénine, qui exerce un effet limitant sur la production d angiotensine, est un facteur essentiel de la régulation de la pression artérielle et du métabolisme hydrosodique. Comme la plupart des enzymes agissant à l extérieur des cellules qui les synthétisent, la rénine existe sous deux formes : une forme inactive et une forme active. La rénine inactive (prorénine), qui se trouve dans le plasma, le liquide amniotique et dans le rein, peut être activée de différentes manières (cryoactivation, acidification ou protéolyse partielle), qui exposent le site actif de l enzyme. La rénine inactive peut représenter jusqu à 90 % de la rénine totale circulante. Cependant, c est la rénine active qui fournit le moyen par lequel l activité biologique s exerce. La rénine active humaine est aujourd hui bien définie : il s agit d une chaîne polypeptidique de 345 acides aminés, dont le poids moléculaire est d environ L angiotensinogène, le substrat de la rénine, est une protéine hépatique à partir de laquelle l angiotensine I est produite. Il doit être souligné que la concentration d angiotensinogène circulant influence le niveau d activité de la rénine plasmatique et par conséquent la concentration d angiotensine II. Cela montre l importance, pour la synthèse de l angiotensinogène, de ces facteurs directement actifs au niveau du foie. Il a été démontré que l action hypertensive in vivo de l angiotensine I était due à sa conversion en angiotensine II par l action d une carboxypeptidase (enzyme de conversion). L enzyme de conversion est régulée par les glucocorticoïdes et les hormones thyroïdiennes. L angiotensine II est le principal effecteur du système rénine-angiotensine, qui maintient l homéostasie circulatoire grâce à son effet direct sur les cellules musculaires lisses vasculaires et sur la stimulation de l aldostérone, ainsi qu à son effet stimulant sur le système nerveux sympathique. Dans le rein, l angiotensine II joue un rôle dans le contrôle de la filtration glomérulaire et le flux sanguin rénal. La rénine est sécrétée par les reins en réponse à une réduction de la perfusion de l artère rénale (barorécepteur intrarénal), une réduction de la réabsorption tubulaire distale du sodium (fuite de sodium), une hypokaliémie ou une stimulation bêta-adrénergique. En outre, la sécrétion de rénine est réduite (rétroaction négative), en cas d augmentation de la concentration plasmatique d angiotensine II. Le dosage de la rénine est nécessaire chez les patients hypertendus et au cours du suivi thérapeutique de l hypertension. La rénine doit être mesurée : lorsque la pression artérielle diastolique dépasse 110 mm Hg (pour identifier une hypertension d origine rénale) ; en cas d hypokaliémie (< 3,8 mm/l) : pour essayer d identifier un hyperaldostéronisme secondaire ou un hyperminéralocorticisme primaire ; si la réponse au traitement antihypertenseur est insuffisante ; afin de déterminer le caractère fonctionnel d une sténose de l artère rénale (en mesurant la rénine dans les veines rénales au cours d une inhibition aiguë de l enzyme de conversion) ; lorsqu un cancer est lié à une augmentation de la pression artérielle (afin de rechercher une production ectopique de rénine). 3. PRINCIPE La trousse RENIN-ELISA est un immunodosage ELISA de type sandwich. Un premier anticorps monoclonal, immobilisé sur la microplaque, capture les protéines de rénine contenues dans les calibrateurs (produits d étalonnage) et les échantillons. Après lavage, les protéines liées sont ensuite reconnues par un deuxième anticorps monoclonal conjugué à la peroxydase de raifort (horseradish peroxydase, HRP). Après une seconde incubation, les réactifs non liés sont éliminés par lavage. Ensuite, la réaction colorimétrique est mise en œuvre en ajoutant un substrat de l HRP, la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB). La réaction est par la suite interrompue en ajoutant une solution acide, la densité optique (DO) de chaque puits est lue tout d abord à 405 nm (intervalle étendu) et/ou 450 nm (intervalle de haute sensibilité). Les valeurs de la DO sont proportionnelles aux concentrations de rénine contenues dans les calibrateurs et les échantillons. La trousse de dosage permet d effectuer 96 tests : - 7 calibrateurs + 2 contrôles + 78 tests ou 39 échantillons inconnus en double en utilisant le mode haute sensibilité + intervalle étendu - 5 calibrateurs + 1 contrôle + 84 tests ou 42 échantillons inconnus en double en utilisant le mode haute sensibilité uniquement 1

2 4. RÉACTIFS Chaque trousse contient les réactifs suffisants pour 96 tests. La date de péremption est indiquée sur l étiquette extérieure. RÉACTIFS SYMBOLES QUANTITÉ CONSERVATION MICROPLAQUE : Prête à l emploi. Anticorps monoclonal anti-rénine de souris immobilisé à la surface des puits. TAMPON D INCUBATION : Prêt à l emploi. Ce réactif est utilisé comme tampon d incubation. Solution tamponnée contenant des protéines d origine bovine et un conservateur. CONJUGUÉ : Prêt à l emploi. Solution tamponnée contenant des anticorps monoclonaux antirénine de souris liés à HRP, des protéines bovines, des stabilisateurs, un colorant vert et un conservateur. DILUANT CALIBRATEUR 0 (CAL 0) : Prêt à l emploi. Solution tamponnée contenant des protéines d origine bovine, un colorant jaune et un conservateur. MICROPLATE INC.BUF CONJ DIL.CAL 1 microplaque (96 puits) 6 barrettes de 16 puits (sachet avec dessicant) 1 flacon de 12 ml 1 flacon de 22 ml 1 flacon de 20 ml Après ouverture, toutes les barrettes inutilisées doivent être conservées pendant 6 semaines entre 2 et 8 C dans le sac plastique fourni, contenant un dessicant, correctement scellé. Après ouverture, la solution doit être conservée entre 2 et 8 C et utilisée dans un délai de 6 semaines. Après ouverture, la solution doit être conservée entre 2 et 8 C et utilisée dans un délai de 6 semaines. Après ouverture, la solution doit être conservée entre 2 et 8 C et utilisée dans un délai de 6 semaines. CALIBRATEURS (CAL 1 à CAL 6) : Lyophilisés. Solution tamponnée lyophilisée contenant de la rénine humaine recombinante, des protéines d origine bovine, un colorant jaune et un conservateur µui/ml * / ** Reconstituer avec 1 ml d eau distillée, replacer le capuchon, retourner plusieurs fois et passer au vortex pour assurer une reconstitution complète. CONTRÔLES 1 & 2 (Bas et Haut) : Lyophilisés. Plasma humain lyophilisé contenant de la rénine endogène et de l azoture de sodium à 0,1 %. Reconstituer avec 1 ml d eau distillée, replacer le capuchon, retourner plusieurs fois et passer au vortex pour assurer une reconstitution complète. Les valeurs seuils exactes d acceptation sont imprimées sur l étiquette du flacon. CAL CONTROL 6 flacons qsp 1 ml 1 flacon chacun qsp 1 ml Après reconstitution, ne pas conserver pendant plus de deux heures à température ambiante. Conserver entre 2 et 8 C pendant deux semaines ou diviser en parties aliquotes et congeler à une température inférieure à -16 C pendant une période de 6 semaines (au maximum deux étapes de congélation). Après reconstitution, ne pas conserver pendant plus de deux heures à température ambiante. Diviser en parties aliquotes et congeler à une température inférieure à -16 C pendant une période de 6 semaines (au maximum deux étapes de congélation). SOLUTION TAMPON PHOSPHATE (PBS) : Comprimés. Solution tampon phosphate. Solubiliser un comprimé dans l eau distillée pour préparer 100 ml de tampon PBS. MISE EN GARDE : Pour préparer le tampon de lavage, ajouter 0,3 ml de TWEEN 20 pour chaque quantité de 100 ml de tampon PBS et mélanger lentement. TWEEN 20 : Solution de Tween 20. SUBSTRAT : Prêt à l emploi. Réactif contenant de la 3,3,5,5 tétraméthylbenzidine (TMB). SOLUTION D ARRÊT : Prête à l emploi. Solution d acide sulfurique 0,5 M. FILM ADHÉSIF POUR MICROPLAQUE SAC PLASTIQUE BUF.WASH 4 plaquettes thermoformées de 5 comprimés chacune (quantité suffisante pour préparer 2 litres de tampon de lavage) TWEEN 20 1 flacon de 10 ml SUBS.TMB 1 flacon de 12 ml STOP.SOLN 1 flacon de 11 ml 3 1 Les trousses ouvertes gardent leur activité pendant six semaines si elles sont conservées dans les conditions indiquées ci-dessus. * Les valeurs indiquées ci-dessus ne sont que des valeurs cibles. La valeur réelle de chaque calibrateur est indiquée sur son étiquette. ** Les valeurs de rénine assignées de la trousse RENIN-ELISA sont exprimées en unités internationales et correspondent aux substances de référence de l OMS (68/356). 5. PRÉCAUTIONS D EMPLOI 5.1. Mesures de sécurité Les matières premières d origine humaine contenues dans les réactifs de cette trousse ont été testées avec des trousses agréées, et se sont avérées négatives pour les anticorps anti-vih 1, anti-vih 2 et anti-vhc et pour l antigène HBs. Cependant, il demeure impossible 2

3 de garantir de façon stricte que ces produits ne sont pas en mesure de transmettre une hépatite, le virus VIH ou toute autre infection virale. Par conséquent, toutes les matières premières d origine humaine, y compris les échantillons à examiner, doivent être traitées comme potentiellement infectieuses. Ne pas pipetter avec la bouche. Ne pas fumer, ne pas manger ou ne pas boire dans les zones où les échantillons et les réactifs de la trousse sont manipulés. Porter des gants jetables pendant la manipulation des réactifs de la trousse ou des échantillons et se laver les mains avec soin ensuite. Éviter toute éclaboussure. Décontaminer et éliminer les échantillons et tous les matériels potentiellement contaminés comme s ils contenaient des agents infectieux. La meilleure méthode de décontamination est un passage à l autoclave pendant au minimum une heure à 121,5 C. L azoture de sodium peut réagir avec les canalisations de plomb ou de cuivre et former des azotures métalliques hautement explosifs. Lors de l élimination des déchets, diluer les produits de manière suffisante pour empêcher la formation de ces substances. Éviter le contact avec la Solution d arrêt qui contient de l H 2SO 4 0,5 M. Elle peut provoquer des irritations et des brûlures cutanées Précautions d utilisation Ne pas utiliser les composants de la trousse après leur date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Éviter toute contamination microbienne des réactifs et de l eau. Respecter les durées d incubation. 6. PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Le dosage est effectué directement sur du plasma traité par EDTA. Si les échantillons peuvent être testés dans un délai de quatre heures après leur prélèvement, les récipients peuvent être bouchés et conservés à température ambiante (jamais entre 2 et 8 C) avant leur traitement. Si le test n est pas effectué dans un délai de quatre heures après le prélèvement, les échantillons doivent être distribués en parties aliquotes et conservés congelés à -20 C. Dans ces conditions, les échantillons peuvent être conservés quatre semaines. Après décongélation, le plasma doit être agité et centrifugé avec soin pour éliminer toute trace de fibrine. Éviter des procédures successives de congélation et de décongélation. MISE EN GARDE : Les échantillons ne doivent JAMAIS être conservés ou décongelés entre 2 et 8 C car une cryoactivation de la prorénine peut se produire à ces températures, et donner des concentrations de rénine active plus élevées et des résultats potentiellement faux positifs. Dilutions Si des concentrations élevées de rénine sont suspectées (> 250 µui/ml ou > 100 µui/ml si l intervalle étendu n est pas utilisé), le réactif Diluant Calibrateur 0 fourni dans la trousse doit être utilisé pour une dilution. Il est recommandé d utiliser des tubes en plastique jetables pour effectuer les dilutions. 7. PROCÉDURE DU DOSAGE 7.1 Équipement nécessaire Micropipettes de précision ou équipement similaire munis d embouts jetables pour la distribution de quantités de 20, 50, 100, 200, et µl (± 1 %). L étalonnage de ces instruments doit être régulièrement vérifié. Eau distillée. Tubes en plastique jetables. Agitateur vortex. Agitateur à plaques à translation horizontale circulaire (700 rpm). Laveur de microplaques (facultatif). Lecteur de microplaques, pouvant mesurer une absorbance à 450 nm. Si l intervalle étendu est utilisé, le lecteur doit être muni d un filtre de 405 nm. En option, le lecteur doit être muni d un filtre permettant de lire l absorbance à une longueur d onde comprise entre 610 nm et 650 nm. Cette seconde lecture permet de corriger les imperfections de la microplaque. 7.2 Protocole Tous les réactifs doivent être amenés à température ambiante (18 à 25 C) au moins 30 minutes avant leur utilisation. Les réactifs sont prélevés et distribués dans les puits à température ambiante (18 à 25 C). Tous les calibrateurs, tous les contrôles ou les échantillons doivent être testés en double. Déterminer le nombre de puits nécessaires pour le dosage et retirer les barrettes inutilisées. Conserver entre 2 et 8 C dans le sac plastique fourni à cet effet correctement scellé, contenant un dessiccatif. Reconstituer les flacons de calibrateurs et de contrôle. Vérifier soigneusement que tout le lyophilisat soit dissous, et utiliser les produits dans l heure suivant leur reconstitution. Pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, il est recommandé que les étapes de lavage soient effectuées conformément aux indications ; le volume résiduel de solution de lavage doit être aussi faible que possible. L utilisation d un laveur de microplaque est recommandée. AVERTISSEMENT : Les comprimés de BUF.WASH sont destinés à préparer une solution tampon phosphate. Il est obligatoire d ajouter 0,3 ml d une solution de TWEEN 20 pour chaque quantité de 100 ml de solution tampon phosphate afin de constituer le tampon de lavage mentionné dans le protocole au cours des étapes de lavage. 3

4 Préparation du tampon de lavage Solubiliser un comprimé de BUF.WASH dans de l eau distillée afin de préparer 100 ml de solution tampon phosphate. Ajouter 0,3 ml de réactif TWEEN 20 à chaque quantité de 100 ml de solution et mélanger lentement. La solution de lavage est stable pendant une semaine entre 2 et 8 C. PROTOCOLE Respecter l ordre d addition des réactifs : Le cas échéant, prédiluer les échantillons avec le diluant DIL.CAL0 fourni dans la trousse. 1 - Placer un nombre suffisant de barrettes de puits de microtitrage dans le support du cadre. 100 µl INC BUF 2 - Distribuer 100 µl de tampon d incubation INC.BUF dans tous les puits. 3 - Ajouter 100 µl de calibrateurs CAL, de contrôles CONTROL et d échantillons dans les puits appropriés en double. Observer que les calibrateurs sont colorés en jaune. Si le mode d intervalle étendu n est pas utilisé, distribuer uniquement le contrôle CONTROL 1, les calibrateurs CAL0 à CAL4 correspondant à l intervalle sensible ( 0 à 100 µui/ml). Si un filtre de 405 nm est disponible sur le lecteur de microplaque et que le mode d intervalle étendu est utilisé ( µui/ml), distribuer également le CONTROL 2 et les calibrateurs CAL 5 et CAL Couvrir avec le film adhésif et mettre en incubation pendant 1 h ± 5 mn à température ambiante (18 à 25 C) sous agitation sur un agitateur de plaque à 700 rpm. 5 - Laver les puits de la façon suivante : a. Retirer le contenu des puits b. Distribuer 300 µl de solution de lavage c. Répéter cette opération encore quatre fois pour effectuer au total cinq cycles de lavage. d. Terminer en aspirant les puits. Le volume résiduel de solution de lavage doit être aussi faible que possible. 100 µl CAL ou CONTROL ou Échantillons 1 h à C sous agitation à 700 rpm Laver 5 fois avec 300 µl de tampon de lavage 6 - Distribuer 200 µl de conjugué anticorps-hrp CONJ dans les puits. Noter que la couleur de ce réactif liquide est verte. 200 µl CONJ 7 - Couvrir avec le film adhésif et mettre en incubation pendant 1 h 30 ± 5 mn à température ambiante (18 à 25 C) sous agitation sur un agitateur de plaque à 700 rpm. 1 h 30 à C sous agitation à 700 rpm 8 - Laver les puits de la façon suivante : a. Retirer le contenu des puits b. Distribuer 300 µl de solution de lavage c. Répéter cette opération encore quatre fois pour effectuer au total cinq cycles de lavage. d. Terminer en aspirant les puits. Le volume résiduel de solution de lavage doit être aussi faible que possible. Laver 5 fois avec 300 µl de tampon de lavage 4

5 9 - Distribuer 100 µl de substrat TMB SUBS.TMB dans tous les puits. 100 µl SUBS TMB 10 - Couvrir avec le film adhésif et mettre en incubation pendant 20 mn à température ambiante (18 à 25 C) sous agitation sur un agitateur de plaque à 700 rpm. 20 mn à C sous agitation à 700 rpm 11 - Interrompre la réaction en ajoutant 100 µl de solution d arrêt STOP.SOLN dans tous les puits. 100 µl STOP SOLN 12 - Il est recommandé de nettoyer la face extérieure du fond des puits avec un tissu souple non pelucheux afin d éliminer les traces de doigts ou les taches éventuelles Retirer le film adhésif et mesurer l absorbance (DO) dans un délai de 10 minutes après avoir ajouté la solution d arrêt : Lecture de l absorbance à 405 & 450 nm Le cas échéant, effectuer une première lecture en utilisant un filtre de 405 nm (la lecture à 405 nm doit être effectuée en premier) Effectuer une lecture à 450 nm Facultatif : effectuer une lecture à une longueur d onde comprise entre 610 et 650 nm (620 nm est recommandée) Remarque : Si un filtre de 405 nm n est pas disponible, utiliser uniquement l intervalle de haute sensibilité (CAL0-CAL4) et les échantillons dont les valeurs de la rénine sont supérieures au calibrateur 4 ( 100 µui/ml) doivent être à nouveau dilués ou mesurés comme supérieurs à cette valeur. Remarque : la lecture facultative à 405 nm permet d étendre l intervalle des concentrations de la courbe d étalonnage du dosage du calibrateur 4 ( 100 µui/ml) au calibrateur 6 ( 250 µui/ml). La valeur réelle de chaque calibrateur est indiquée sur l étiquette du flacon. 405 nm 450 nm DIAGRAMME DU DOSAGE DURÉE TOTALE D INCUBATION = 2 h 50 Puits INC.BUF Test CONJ SUBS.TMB STOP.SOLN Vert 100 µl 100 µl Mettre en incubation 200 µl Mettre en incubation 100 µl 100 µl Calibrateurs 1 h 700 rpm 18 à 25 C 1 h rpm 18 à 25 C Mettre en incubation 20 mn Contrôles 100 µl 100 µl 200 µl 100 µl 700 rpm 100 µl Laver 5 Laver 5 18 à 25 C avec avec 300 µl 300 µl Échantillons 100 µl 100 µl tampon de 200 µl tampon de lavage lavage 100 µl 100 µl et aspirer et aspirer Lire la DO dans les 10 mn 1) 405 nm 2) 450 nm Facultatif 620 nm 5

6 8. CONTRÔLE QUALITÉ Les Bonnes pratiques de laboratoire (BPL) exigent que des échantillons de contrôle qualité soient utilisés dans chaque série de dosages afin de vérifier la qualité des résultats obtenus. Tous les échantillons doivent être traités de manière identique, et il est recommandé d analyser les résultats avec les méthodes statistiques appropriées. 9. CALCUL DES RÉSULTATS 1- Correction facultative de la DO * : soustraire les lectures effectuées à 620 nm (610 à 650 nm) des lectures effectuées à 405 nm et/ou 450 nm. 2- Pour chaque échantillon mesuré en double, calculer l absorbance moyenne (DO) des calibrateurs, des contrôles et des échantillons. 3- Tracer une ou deux courbes d étalonnage selon que le mode d intervalle étendu est utilisé ou non à partir des données à 405 nm : Courbe d étalonnage pour l INTERVALLE DE HAUTE SENSIBILITÉ ( µui/ml) Préparer une courbe d étalonnage en inscrivant les valeurs moyennes de la DO (corrigées *) à 450 nm des calibrateurs CAL0, CAL1, CAL2, CAL3 et CAL4 (axe des ordonnées, Y) par rapport à leur concentration (axe des abscisses, X) indiquée sur le flacon. Les concentrations des échantillons avec les valeurs moyennes de la DO (corrigées *) à 450 nm comprises entre CAL0 et CAL4 doivent être lues directement à partir de cette courbe d étalonnage. Facultatif : courbe d étalonnage pour le MODE INTERVALLE ÉTENDU ( µui/ml) Préparer une courbe d étalonnage en inscrivant les valeurs moyennes de la DO (corrigées *) à 405 nm des calibrateurs CAL0, CAL3, CAL4, CAL5 et CAL6 (axe des ordonnées, Y) par rapport à leur concentration (axe des abscisses, X) indiquée sur le flacon. Les concentrations des échantillons avec les valeurs moyennes de la DO (corrigées *) à 405 nm comprises entre CAL4 et CAL6 doivent être lues directement à partir de cette courbe d étalonnage. Remarque : La courbe d étalonnage de l intervalle étendu ne doit pas être utilisée pour lire les échantillons présentant une DO à 450 nm < CAL4. 4- Le modèle d ajustement mathématique polynomiale du troisième ordre est recommandé pour les deux courbes d étalonnage. Les autres fonctions de réduction des données peuvent donner des résultats légèrement différents. Lire les valeurs des échantillons sur la courbe, en corrigeant par le facteur de dilution le cas échéant. Ne pas extrapoler les données pour des valeurs de DO supérieures au calibrateur le plus élevé de l intervalle sélectionné. Exemple de données de dosage : donné exclusivement à titre d exemple. Cet exemple ne doit en aucune circonstance être substitué aux résultats obtenus dans le laboratoire. Concentration µui/ml Intervalle de haute sensibilité DO 450 nm Intervalle étendu DO 405 nm CAL0 0 0,023 0,016 CAL1 4,2 0,131 CAL2 25 0,68 CAL3 50 1,31 0,42 CAL4 91 2,38 0,76 CAL ,24 CAL ,49 CONTRÔLE 1 37,4 0,99 CONTRÔLE ,02 DO corrigée 450 nm nm Courbe d étalonnage de la rénine active Haute sensibilité : 450 nm 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0, Rénine active µul/ml DO corrigée 405 nm nm 2,0 1,5 1,0 0,5 Courbe d étalonnage de la rénine active Intervalle étendu : 405 nm 0, Rénine active µul/ml 10. LIMITATIONS DE LA PROCÉDURE Les échantillons présentant un aspect trouble, une hémolyse, une hyperlipidémie ou contenant de la fibrine peuvent donner des résultats inexacts. La signification des mesures de la rénine active ne peut être interprétée de manière significative que si le patient fait l objet de l exploration sous des conditions contrôlées et avec un équilibre sodique défini. 6

7 Dans la mesure où un certain nombre de facteurs physiologiques peuvent influencer la sécrétion de la rénine, les conditions sous lesquelles les échantillons sont collectés doivent être soigneusement contrôlées : a. Le patient ne doit avoir pris aucun traitement antihypertenseur depuis huit jours. b. La position doit être contrôlée : le patient doit être allongé depuis plus d une heure ou debout depuis plus d une heure. c. La teneur en sodium de l alimentation doit être connue et finalement vérifiée par la mesure de la natriurie au cours d une période de 24 heures (60 à 200 meq/24 h). Certains facteurs physiologiques peuvent affecter la sécrétion de la rénine : a. Les concentrations de rénine active et inactive augmentent au cours de la grossesse. b. Cycle menstruel : augmentation de la concentration au cours de la deuxième phase du cycle (le prélèvement doit être effectué si possible au cours de la première phase). c. La concentration de rénine active diminue avec l âge. d. Le cycle nycthéméral affecte également la concentration : le prélèvement doit être effectué le matin entre 7 h et 10 h si possible. Différents médicaments peuvent également affecter la sécrétion de la rénine : a. Les diurétiques, les inhibiteurs de l enzyme de conversion de l angiotensine (captopril, énalapril), les vasodilatateurs (dihydralazine, minoxidil, prazosine, etc.) peuvent entraîner une stimulation du système rénine-angiotensine. b. Les bêtabloquants (labétalol, clonidine, méthyldopa, etc.) peuvent entraîner une inhibition du système rénine-angiotensine. c. Il a été observé que la cathepsine B (0,1 U/ml) interférait avec ce test. Ne pas utiliser ce test chez les patients ayant reçu de la cathepsine B. Ne pas extrapoler les valeurs d échantillons inférieures au dernier calibrateur de l intervalle utilisé (CAL4 pour les données obtenues à 450 nm ou CAL6 pour les données à 405 nm). Diluer les échantillons concernés et réeffectuer le test. Ne pas utiliser le mode d intervalle étendu à partir des données obtenues à 405 nm pour lire les valeurs d échantillons inférieures à CAL4, utiliser en revanche les données obtenues à 450 nm. Ne pas utiliser les résultats si la lecture est effectuée plus de 10 minutes après avoir ajouté la solution d arrêt. 11. VALEURS NORMALES ATTENDUES Il est extrêmement important de savoir que plusieurs facteurs (posture, âge, consommation de sodium, cycle menstruel) peuvent influencer la concentration de rénine active. Par conséquent, pour chaque test diagnostique, il est recommandé que chaque laboratoire établisse son intervalle de valeurs normales en fonction de sa propre population. Afin de déterminer l intervalle normal du coffret RENIN-ELISA, 124 échantillons provenant de sujets hommes et de femmes à jeun, sans traitement œstroprogestatif, apparemment sains, âgés de 4 à 89 ans, ont été analysés. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous : POSITION n Moyenne (µui/ml) 5 e percentile (µui/ml) 95 e percentile (µui/ml) DÉCUBITUS Moyenne hommes 22 19,0 2,2 42,4 Moyenne femmes 33 15,2 2,2 44,0 DEBOUT Moyenne hommes 25 19,0 2,7 60,3 Moyenne femmes 44 24,4 6,2 68,0 12. PERFORMANCES 12.1 Intervalle de mesure du dosage Les échantillons doivent être mesurés dans l intervalle compris entre le seuil inférieur de détection et la concentration maximale de l intervalle d étalonnage, c est-à-dire entre 1,5 µui/ml et 100 µui/ml (sensibilité élevée) ou 250 µui/ml (mode étendu) Traçabilité Les valeurs de rénine assignées de la trousse RENIN-ELISA sont exprimées en unités internationales et correspondent aux substances de référence de l OMS (68/356) Précision Intradosage La variation intradosage (intrasérielle) a été déterminée par 27 à 30 mesures de 3 échantillons couvrant l intervalle de mesure complet de la courbe d étalonnage. Variation intrasérielle Échantillon n Valeur moyenne (µui/ml) 31,7 99,4 191 CV (%) 6,8 5,1 3,0 7

8 Interdosages La variation interdosages (intersérielle) a été déterminée en utilisant trois échantillons mesurés lors de 15 à 45 sessions en double. Variation intersérielle Échantillon CONTRÔLE 1 CONTRÔLE 2 n Valeur moyenne (µui/ml) 33,4 63, ,0 133 CV (%) 6,6 5,0 5,3 5,1 4, Seuil de détection Le Seuil de détection (SdD ou sensibilité analytique) de la trousse RENIN- ELISA est défini comme la plus faible concentration détectable qui diffère de zéro avec une probabilité de 95 %, calculée en additionnant deux écarts types à la moyenne de l analyse de 30 échantillons dupliqués du calibrateur zéro (CAL0). Sensibilité analytique (Seuil de détection) SdD 0,5 µui/ml Le Seuil de quantification (SdQ ou sensibilité fonctionnelle) de la trousse RENIN-ELISA est défini comme la concentration mesurée par le profil d imprécision à un coefficient de variation égal à 15 %. Il a été calculé en testant 10 échantillons en double au cours de 30 séances en utilisant trois lots de trousses différents. La moyenne, l écart type et le coefficient de variation (CV exprimé en %) ont ensuite été déterminés pour chaque échantillon. Sensibilité fonctionnelle (Seuil de quantification) SdQ 1,5 µui/ml 12.5 Récupération Des solutions de rénine provenant de sept calibrateurs ont été mélangées selon une proportion de 1:1 à trois pools d échantillons de plasma présentant différentes concentrations initiales de rénine. Chaque échantillon (surchargé et non surchargé) a été dosé en double au cours d une séance. Les concentrations de rénine ont été mesurées et le pourcentage de récupération a été calculé. Récupération Échantillon Pool A Pool B 119 Concentration (µui/ml) 49, Récupération moyenne (%) 96,9 94,4 97,8 Intervalle de récupération (%) 92,5-99,2 87,8-98,0 89, Dilution Linéarité Des études ont été effectuées pour évaluer la linéarité du dosage en utilisant trois échantillons de plasmas traités par EDTA présentant différentes concentrations. Les échantillons ont été dosés purs et dilués en série avec DIL-CAL0 jusqu au SdQ (facteur de dilution descendant de 1:64 à 1:128) Dilution Échantillon Pool 1 Pool 2 Pool 3 Concentration (µui/ml) 96, Intervalle de dilution 1:2 à 1:64 1:2 à 1:128 1:2 à 1:128 Récupération moyenne (%) Intervalle de récupération (%) Linéarité Ordonnée à l origine 1,31 0,45-0,39 Pente (Y = mesuré) 1,01 1,00 0,99 R² 0,99 0,99 0,99 Ces résultats montrent la bonne linéarité du test de dilution sur l intervalle de mesure rapporté de ce dosage (SdQ jusqu au calibrateur le plus élevé) Spécificité La spécificité du dosage est garantie par l utilisation de deux anticorps monoclonaux complémentaires. La rénine humaine est reconnue. Une étude a été effectuée pour évaluer l effet de la prorénine sur le dosage de la rénine en utilisant des concentrations molaires des deux molécules pour prendre en compte les différences de poids moléculaire. 8

9 La réaction croisée avec la prorénine est inférieure à 0,007 % (valeur moyenne obtenue lors d une surcharge en prorénine à une concentration de 10 ng/ml dans trois échantillons différents de plasmas traités par EDTA présentant des concentrations de rénine connues) Effet crochet Aucun effet crochet n a été observé avec ce dosage jusqu à µui/ml Interférences Une étude d interférences a été effectuée selon la directive CLSI EP17-A2. Aucune interférence significative* n a été observée lorsque les échantillons de plasma ont été surchargés avec l une quelconque des substances suivantes à la concentration indiquée. - Hémoglobine humaine (2 mg/ml) - Triglycérides provenant d un plasma hyperlipidémique traité par EDTA (7,4 g/l) - Triglycérides provenant d une solution commerciale Intralipid (5 g/l) - Albumine humaine (surchargée jusqu à 60 mg/ml) - Bilirubine (0,15 mg/ml) - Cathepsine D (0,5 U/ml) - Différents traitements antihypertenseurs : Captopril (5 µg/ml), Renitec (0,3 µg/ml), Loxen (60 µg/ml) ou Lasilix (60 µg/ml) * L absence d interférence significative fait référence à une variation des concentrations de rénine entre des échantillons surchargés et non surchargés (contrôles) comprise entre ± 10 %. AVERTISSEMENT 1 - Il a été observé que la cathepsine B interférait avec ce test (testée à 0,1 U/ml). Ne pas utiliser ce test chez les patients ayant reçu de la cathepsine B. AVERTISSEMENT 2 - L immunodosage est protégé contre des interférences potentielles provoquées par des anticorps hétérophiles, notamment anticorps humains anti-souris (HAMA) et facteurs rhumatoïdes (FR) par l addition d une protection. Néanmoins, nous ne pouvons pas garantir qu il n existera jamais de résultat «faux positif» dû à la présence d anticorps hétérophiles dans un échantillon de patient. 13. COMPARAISON DES MÉTHODES Une étude a été effectuée pour comparer les résultats obtenus avec la trousse RENIN-ELISA et un dosage radioimmunologique de troisième génération de la rénine (RENIN III GENERATION RIA) (Cisbio Bioassays) sur 299 échantillons de plasmas traités par EDTA et trois lots de trousses différents. L équivalence de la concentration rapportée par le dosage RENIN III GENERATION RIA par rapport à la norme internationale (OMS 68/356) a été obtenue en multipliant les résultats obtenus avec le coffret RIA (µg/ml) par un facteur de 1,8 afin d obtenir des µui/ml. L analyse de régression de Passing et Bablok et les courbes de différences utilisées pour ces échantillons ont abouti à la régression suivante : RENIN - ELISA = 0,98 RENIN III GENERATION RIA 1,44 µui/ml L intervalle de confiance à 95 % pour la pente a été de 0,95 à 1,01, et l intervalle de confiance à 95 % pour l ordonnée à l origine a été de -2,24 à -0,70 µui/ml pour les 299 échantillons de patients présentant des concentrations de rénine comprises entre 2,4 et 234 µui/ml. 14. Bibliographie Blazy I, Guillot F, Laborde K and Dechaux M. Comparison of plasma renin and prorenin in healthy infants and children as determined with an enzymatic method and a new direct immunoradiometric assay. Scand J Clin Lab Invest. 1989;49 : Corbin and al. Active renin mass concentration to determine aldosterone-to-renin ratio in screening for primary aldosteronism. Int J of Nephr and renovasc disease. 2011; 4: Derkx EH, Tan-Tjiong JL, Seyen Van AJ, Wenting Gj, Schalekamp M. Renal vein immunoreactive renin in patients with renal arterystenosis and essential hypertension. Clin Exp Hypertension. 1987;9(8-9): Diederich and al. The simultaneous measurement of plasma-aldosterone-and-renin concentration allows rapid classsification of all dissorders of the renin aldosterone system.exp Clin Endocrinol Diab. 2007; 115: Ferrari and al. Active Renin versus plasma renin activity to define aldosterone-to-renin ratio for primary aldosteronism. J of Hypertension. 2004; 22: Funder JW and al. Case detection, Diagnosis, and Treatment of Patients with Primary Aldosteronism: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 2008; 93(9): Galen Fx, Devaux C, Atlas S, Guyenne TT, Menard J, Corvol P et al. New monoclonal antibodies directed againts human renin powerfull tools for the investigation of the renin system. J Clin Invest. 1984;74: Komukai and al. Gender and the renin-angiotensin-aldosterone system. Fund Clin Pharm. 2010; 24:

10 Locsei Z.and al. Influence of sampling and storage conditions on plasma renin activity and plasma renin concentration. Clin Chim Acta 2009; 402: Menard J, Guyenne TT, Chatellier G, Kleinbloesem CH, Bernadet P. Renin release regulation during acute renin inhibition in normal volunteers. Hypertension. 1991;18: Morganti A, Turolo L, Pulazzini E, Zanchetti A. Comparative measurements of immunoreactive renin, plasma renin activity and angiotensin II in human plasma. Clin and Exper Theory and Practice. 1987;A9(8-9): Pau B, Cazaubon, Simon D, Galen Fx, Gaillard I, Guyenne TT et al. Monoclonal antibodies as probs to investigate human renin. Immunol. of cardio vasc. Diseases. 1987; Perschel and al. Rapid screening test for primary Hyperaldosteronism : ratio aldosterone to renin concentration determined by fully automated chemiluminescence immunoassays. Clin Chem. 2004; 50(9): Plouin FP, Corvol P, Chatellier G, Guyenne TT, Alhenc-Gelas F. Direct measurement of renin substrate, active and inactive renin, and angiotensin converting enzyme in normal subjects : effects of posture and age. Inter. Society of Hypert. 12th Scientific Meeting Nov. 1987:20. Reid IA, Morris BJ, Ganong WP. The renin angiotensin system. Am Rev Physiol. 1978;40: Rossi G.P. and al. The aldosterone-renin ratio based on the plasma renin activity and the direct renin assay for diagnosing aldosterone-producing adenoma. J of Hypertens. 2010; 28: Sealey JE, Steven A, Atlas A, Laragh JH. Plasma prorenin : Physiological and biochemical characteristics. Clin Sci ; Simon D, Badouaille G, Pau B. Measurements of active renin by the 4G1 anti human renin monoclonal antibody. Clin Exp Hypertens. Part A : Theory and Practice. 1987;A9: Simon D, Hartmann D, Badouaille G, Caillot G, Guyenne TT, Corvol P et al. A two site direct immunoassay as a tool for the specific exploration of active renin. Clin Chem. 1992;38/10: Sy and al. Primary Hyperaldosteronism among Chinese hypertensive patients: how are we doing in a local district in Hong Kong. Hong Kong Med J. 2012; 18: Toffelmire E, Scater K, Corvol P and Schambelan M. Response of Plasma Prorenin and Active Renin to Chronic and Acute Alterations of Renin Secretion in normal Humans. J Clin Inverst. 1989;83: Tsunoda K, Abe K, Goto T, Yasyjima M, Sato M, Omata K et al. Effect of age in the renin angiotensin aldosterone system in normal subjects : simultaneous measurement of active and inactive renin, renin substrate and aldosterone in plasma. J Clin Endocrinol Metab. 1986;62: Tsutamoto T. and al, Comparison of Active Renin Concentration and Plasma Renin Activity as a prognostic Predictor in patients with Heart Failure. Circ J 2007; 71: Unger N and al, Comparison of active renin concentration and plasma renin activity for the diagnosis of primary hyperalsteronism in patients with adrenal mass. Eur J of Endocrinol 2004; 150: Vin-Cent Wu and al. Diagnosis of primary aldosteronism: Comparison of post-captopril active renin concentration and plasma renin activity. Clin Chim Acta 2010; 411: Wathen LK, Wuorala KW, Wathen MW. Validation of an Immunoradiometric Assay to measure Plasma levels of Active. Renin. J Clin Lab. 1991;Analysis 5: Copyright 2014 Cisbio Bioassays, France 10

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