Diagnostic du paludisme : apports des tests de détection antigénique sur bandelette

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1 Diagnostic du paludisme : apports des tests de détection antigénique sur bandelette! A. Paugam* RÉSUMÉ. Depuis quelques années, de nouveaux tests diagnostiques du paludisme sont disponibles. Ils reposent sur la détection de protéines spécifiques de P. falciparum (ParaSight -F ; ICT Malaria Pf ), voire de P. falciparum et P. vivax (OptiMAL ). Simples de réalisation, ces tests peuvent être pratiqués par un personnel non spécialisé. À partir de quelques microlitres de sang et en moins de 15 minutes, le résultat est apprécié à l œil nu par l apparition ou non d une bande spécifique sur une bandelette de nitrocellulose. Si la sensibilité de ces tests est comparable à celle du frottis sanguin, elle reste inférieure à celle de la goutte épaisse. De plus, leur spécificité, actuellement réduite à une ou deux espèces de Plasmodium, et l absence de quantification de la densité parasitaire font que ces tests ne peuvent remplacer l examen microscopique qui reste la technique de référence pour le diagnostic du paludisme. Toutefois, en l absence de laboratoire, de personnel expérimenté ou en cas d épidémie, ces tests sont un apport essentiel dans la lutte contre le paludisme. Mots-clés : Paludisme - Plasmodium falciparum - ICT Malaria Pf - ParaSight -F - OptiMAL. Le paludisme est une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. Rien qu en Afrique, Plasmodium falciparum est responsable d au moins un million de morts par an. Pour les personnes non immunes infectées par P. falciparum et non traitées, la létalité varie de 1-2 % à plus de 20 % (1). En 1998, dans le Nord-Est du Kenya, après deux années de sécheresse, les inondations dues à El Niño ont provoqué une épidémie dont le taux brut de mortalité a été estimé, pour la seule ville de Wajir ( habitants), pendant une période de 2 mois, à 9,4 décès quotidiens pour habitants, soit un total de plus de morts (2). Le diagnostic du paludisme repose sur la mise en évidence du parasite lors de l examen microscopique d un prélèvement sanguin (frottis, goutte épaisse). Depuis plus d un siècle, date de la découverte de l hématozoaire par Alphonse Laveran (premier Français lauréat du prix Nobel de médecine en 1907), la technique n a que peu évolué. Si les colorants modernes tels que les colorants de Field (RAL, Diff-Quick ) agissent en quelques minutes, alors que le classique Giemsa nécessite plusieurs dizaines de minutes, le temps de lecture des lames reste inchangé. Il faut toujours compter au moins 20 minutes d examen avant de rendre un frottis négatif. Bien que cette technique soit facile à mettre en œuvre, il faut souligner qu elle nécessite un personnel expérimenté, un matériel fragile et un temps d examen non négligeable. La recherche de nouveaux tests diagnostiques, plus simples à mettre en œuvre, est devenue un axe essentiel de la stratégie de la lutte contre le paludisme menée par l OMS (3). *Laboratoire de parasitologie-mycologie, hôpital Cochin, Paris. NOUVEAUX TESTS De nouveaux tests biologiques, disponibles depuis peu, pourraient répondre à ce besoin. Le principe de ces tests repose sur la détection sanguine d antigènes spécifiques de Plasmodium. Il s agit d une réaction immunochromatographique sur bandelette de nitrocellulose. Le test fait intervenir deux anticorps, spécifiques de l antigène parasitaire à détecter. Le premier anticorps est immobilisé sur la bandelette : c est l anticorps qui va fixer l antigène parasitaire (anticorps récepteur). Le deuxième anticorps est couplé à un colorant (anticorps révélateur). Soit il migre le long de la bandelette jusqu au premier anticorps en même temps que l échantillon sanguin (ICT Malaria Pf ), soit l échantillon sanguin migre vers l anticorps récepteur, et dans un deuxième temps, c est au tour du réactif contenant l anticorps révélateur de migrer vers l anticorps récepteur (ParaSight -F). Si l échantillon contient l antigène parasitaire, le complexe anticorps révélateur-antigène-anticorps récepteur définit une bande visible à l œil nu. La réalisation du test nécessite un ou plusieurs réactifs, séparés ou associés (réactif de lyse, de migration, de révélation, de lavage). Dans tous les cas, le diagnostic est obtenu en moins de 15 minutes (10-15 minutes). Comparables pour leur réalisation et leur lecture aux tests de grossesse, ces tests diagnostiques peuvent être effectués par un personnel non spécialisé. On peut classer ces tests en deux catégories : ceux qui détectent une glycoprotéine spécifique de P. falciparum (HRP-2 : Histidin Rich Protein 2) et ceux qui détectent les isoenzymes de la lactate déshydrogénase (LDH). Cette deuxième catégorie de test détecte à la fois la LDH du genre Plasmodium (pldh) et la LDH spécifique de P. falciparum (pfldh). Tous ces tests peuvent être réalisés à partir de sang capillaire ou veineux (tubes avec EDTA ou héparine). La Lettre de l Infectiologue - Tome XV - n 6 - juin

2 Détection d HRP-2 En France, deux tests sont disponibles : le ParaSight -F (Becton Dickinson, Meylan, France) et l ICT Malaria Pf (Fumouze, Levallois-Perret, France) (figure 1). En termes d utilisation, la principale différence entre ces tests concerne la température de conservation des kits : 37 C pour ParaSight -F et +2 à + 8 C pour ICT Malaria Pf. Après environ dix minutes de manipulation, la présence de l HRP-2 se traduit par l apparition d un trait rose, visible à l œil nu, soit sur une bandelette libre (ParaSight -F), soit sur une bandelette enchâssée dans une carte-test (ICT Malaria Pf ). L apparition d une bande témoin, garantissant la bonne exécution du test, est nécessaire à toute interprétation du test. Lorsque l on compare les résultats obtenus avec le ParaSight -F et l ICT Malaria Pf, ceux-ci apparaissent similaires (4). ParaSight -F Détection de LDH Un seul test est commercialisé (non disponible en France) : l OptiMAL (Flow Inc, États-Unis) (figure 2). Le résultat est obtenu en une dizaine de minutes. Selon la localisation de la bande de détection sur la bandelette, le test permet de distinguer les LDH spécifiques de P. falciparum (pfldh) de celles spécifiques du genre Plasmodium (pldh) (figure 2). En fait, selon différentes études d évaluation, la LDH dite du genre Plasmodium n apparaît détectable que s il s agit des espèces falciparum et vivax. D ailleurs, pour le fabricant, la détection se limite à P. falciparum et P. vivax. Lorsque le test détecte P. falciparum, deux bandes sont visibles (pldh et pfldh), et lorsque le test détecte P. vivax, une seule bande apparaît (pldh). Comme pour les tests précédents, l apparition d une bande témoin, garantissant la bonne exécution du test, est nécessaire à toute interprétation. Ces différents tests ont été évalués en prenant le diagnostic microscopique comme référence (frottis et goutte épaisse). Positif Négatif OptiMAL Positif Positif Négatif C HRP-2 C P. falciparum ICT Malaria Pf pfldh pldh P. falciparum P. vivax Positif Négatif Figure 1. Représentation schématique du test de détection des isoenzymes de LDH (lactase déshydrogénase). c T P. falciparum C : contrôle de réaction T : test c T Figure 1. Représentation schématique des tests de détection de l antigène HRP-2 (Histidine-Rich Protein 2). Faux négatifs! Faible parasitémie. La sensibilité des tests varie en fonction de la parasitémie. Globalement, on peut considérer que leur sensibilité est comparable à celle obtenue avec un frottis sanguin. En dessous de 100 parasites/µl, il y a une nette diminution de la détection (5, 6) (tableau I). Le seuil de détection de ces techniques ne permet pas de détecter les faibles parasitémies (5-20 p/µl), dont le diagnostic n est possible que par l examen microscopique par la technique de la goutte épaisse. Parasitémie Sensibilité des tests (parasite/µl) OptiMAL P. falciparum P. falciparum P. vivax ICT Malaria Pf ParaSight -F % (12/22) 61 % (24/39) 71,4 % (15/22) 71,4 % (15/22) > ,8 % (13/14) 93,4 % (43/46) 96,4 % (55/57) 100 % (57/57) Tableau I. Sensibilité des tests en fonction de la parasitémie (5, 6). 226 La Lettre de l Infectiologue - Tome XV - n 6 - juin 2000

3 ! Forte parasitémie. Récemment, une publication a fait état d un test ParaSight -F négatif chez un malade symptomatique pour lequel la microscopie avait retrouvé 30 % d hématies parasitées par P. falciparum (7). D autres études ont également rapporté des négativités pour des parasitémies élevées, que ce soit pour la détection d HRP-2 ou de LDH. Ces parasitémies étaient nettement au-dessus du seuil de détection : parasites/µl (8) :1400 p/µl (9), p/µl (10), p/µl (11). Il faut noter que la répétition du test à un jour d intervalle (9), ou encore la dilution de l échantillon (7) ont pu parfois permettre de lever la fausse négativité des tests. Toutefois, la raison de ces faux négatifs reste obscure. Parmi les différentes hypothèses avancées, la possibilité de souches déficitaires en HRP-2 a été confirmée par l étude de neuf isolats de P. falciparum provenant du Mali et issues de malades pour lesquels le Para- Sight -F était négatif. Pour six de ces neuf souches, le gène HRP-2 n a pas été détecté par PCR (12). Faux positifs! Circulation prolongée de l antigénémie. Le suivi en parallèle, par microscopie et détection de l antigène HRP-2, de malades infectés par P. falciparum et traités, a mis en évidence une détection prolongée d HRP-2, après disparition de la parasitémie. Cette détection a pu être observée plus de 15 jours après la négativité microscopique (13). La circulation prolongée d HRP-2 ne permet pas d utiliser ces tests pour surveiller l évolution d un traitement ou pour détecter les souches résistantes de P. falciparum. En revanche, la détection de LDH, bien corrélée avec la parasitémie, semble adaptée au dépistage de résistances aux antipaludéens (14).! Facteur rhumatoïde. Le facteur rhumatoïde (FR) a été rapidement identifié comme pouvant être à l origine de fausses positivités (15, 16). Bien que ces faux positifs aient été rapportés pour tous les tests, leur fréquence varie selon la nature du test. Sur 79 prélèvements sanguins positifs pour le FR, issus d autant d individus (sans antécédents de paludisme, non originaires de zone d endémie et n ayant pas séjourné en zone d endémie depuis au moins 5 ans), les pourcentages de fausses positivités observés avec les tests ParaSight -F, ICT Malaria Pf et OptiMAL sont respectivement de 19 %, 8 % et 4% (17). Pour expliquer le plus faible pourcentage de fausses positivités avec l ICT Malaria Pf par rapport au ParaSight -F, qui détectent le même antigène, la nature du premier anticorps a été évoquée : respectivement IgM et lgg (18). Ces différences de fréquence de fausses positivités selon la nature du test ont récemment été confirmées par une étude portant sur 133 échantillons sanguins positifs pour le facteur rhumatoïde et sans infection palustre, 26 % étaient positifs pour le test ICT Malaria Pf et 3,5 % pour le test OptiMAL (19). Les principales caractéristiques de ces tests sont résumées par le tableau II. UTILISATION DES TESTS EN ZONE D ENDÉMIE En zone d endémie, le manque de structures médicalisées et le manque de personnel qualifié limitent le recours au diagnostic microscopique du paludisme et favorisent les traitements présomptifs devant tout syndrome fébrile. Ces traitements généralisés, à l aveugle, contribuent à sélectionner des souches de P. falciparum résistantes à des molécules, par ailleurs de plus en plus coûteuses, sans compter qu ils retardent d autant la recherche du bon diagnostic. C est pour ces raisons que l OMS préconise la mise au point de tests biologiques simples, moins contraignants que la microscopie (3). En zone de transmission, le manque de sensibilité des tests de détection antigéniques apparaît moins crucial que pour le diagnostic d importation puisque, dans les populations ayant une prémunition vis-à-vis du paludisme, les seuils de parasitémie à l origine de la symptomatologie sont plus élevés que dans une population non immune (20). En revanche, l absence quasi totale de quantification du résultat est un inconvénient par rapport à la microscopie. Une interprétation semi-quantitative, selon l aspect de la bande (plus ou moins nette), ne donne qu une faible corrélation avec la parasitémie. La persistance de l antigène HRP-2 plusieurs semaines après disparition de la parasitémie ne permet pas de détecter les résistances de P. falciparum au traitement. Mais, par ailleurs, cette circulation prolongée de l antigène HRP-2, détectable en l absence de parasitémie, semble être un atout pour le dépistage du paludisme chez la femme enceinte. L infection par P. falciparum au cours de la grossesse, rarement responsable de paludisme congénital, accroît le risque de prématurité et de petit poids de naissance. Pour ces femmes, asymptomatiques pour la plupart, l examen microscopique de sang périphérique ne permet de dépister que 80 % des cas. Pour une femme sur cinq, le diagnostic n est porté qu à l accouchement par mise en évidence microscopique du parasite sur frottis placentaire. Dans une étude prospective réalisée au Came- Caractéristique ParaSight -F ICT Malaria Pf OptiMAL Nature de l antigène détecté Glycoprotéine : HRP-2 Enzymes : LDH Espèce plasmodiale diagnostiquée P. falciparum P. falciparum et P. vivax Volume de sang par test 50 µl 10 µl 10 µl Fausse positivité avec le FR* Surveillance du traitement Non Oui Commercialisation en France Oui Non *FR : facteur rhumatoïde. Tableau II. Principales caractéristiques des tests de détection d antigène plasmodial par immunochromatographie sur bandelette. La Lettre de l Infectiologue - Tome XV - n 6 - juin

4 roun pour 181 femmes enceintes (21), l infection par P. falciparum a été recherchée dans le sang périphérique par examen microscopique (frottis, goutte épaisse) et par détection antigénique d HRP-2 (ICT Malaria Pf ). À l accouchement, des frottis placentaires étaient systématiquement réalisés. On a diagnostiqué une infection à P. falciparum chez 64 femmes. Cinquante-quatre ont pu être dépistées par la microscopie du sang périphérique, alors que pour dix, seuls les frottis de sang placentaires ont permis le diagnostic. L ICT Malaria Pf a permis de dépister 59 des 64 cas. Dans cette indication, si la détection antigénique n apparaît que modérément plus sensible que la microscopie (89 % versus 84 %), l association ICT Malaria Pf et microscopie permet d obtenir une sensibilité de 93,8 %. Le plus grand obstacle à l utilisation de ces tests reste leur coût, variable selon les pays mais en moyenne compris entre 2 et 10 dollars le test, alors que l OMS préconise un coût inférieur à 0,4 dollar pour inclure véritablement ces tests dans la stratégie de lutte contre P. falciparum (18). D ores et déjà, deux tests de détection d HRP-2 sont commercialisés à moins de 1 dollar, comme le Paracheck Pf, de fabrication indienne (Nosten F. Shoklo Malaria Reseach Unit, Thailand, communication personnelle) et le PATH Falciparum Malaria test (22). UTILISATION POUR LE DIAGNOSTIC DE PALUDISME D IMPORTATION D après différentes études, la sensibilité et la spécificité des tests de détection antigéniques restent, là encore, inférieures à la microscopie (23, 24) (tableau III). En France, ces tests sont encore peu répandus, comme en témoignent les extraits suivants concernant le diagnostic biologique du paludisme, issus de la conférence de consensus de la Société de pathologie infectieuse de langue française (SPILF) de 1999 consacrée à la prise en charge et à la prévention du paludisme d importation à P. falciparum (25) : Le jury propose la technique du frottis sanguin en première intention pour le diagnostic du paludisme [...]. La goutte épaisse, plus sensible, est l examen de référence, mais sa lecture est plus délicate [...]. Les autres techniques (telles que la détection d antigènes solubles spécifiques de P. falciparum) ne sont pratiquement pas utilisées dans les laboratoires polyvalents du fait de leur coût et de leur non-remboursement par la Sécurité sociale. Par contre, dans les services spécialisés, elles peuvent être un apport au diagnostic immédiat de P. falciparum, soit une aide à un diagnostic rétrospectif. Bien que cette dernière phrase n ait pas été explicitée, il nous semble licite de proposer les indications suivantes d utilisation des tests pour le diagnostic immédiat et rétrospectif pour un laboratoire spécialisé comme cela a été énoncé par la conférence de consensus. Pour le diagnostic immédiat, le manque de sensibilité de ces tests en cas de faibles parasitémies limite d autant leur seule utilisation en première intention ; aussi ne peuvent-ils être qu un complément du diagnostic microscopique, par exemple, lorsque le diagnostic microscopique d espèce est difficile (absence de gamétocytes et parasites asexués en trop faible nombre pour conclure sur l aspect général du frottis ; morphologie parasitaire altérée ou pouvant avoir été altérée par une chimioprophylaxie antipaludéenne). Pour le diagnostic rétrospectif, la persistance prolongée de l antigène HRP-2 peut permettre un diagnostic à distance de l accès lorsque la parasitémie n est plus détectable par microscopie ; ce diagnostic rétrospectif antigénique a l avantage d une réponse plus rapide que la classique sérologie. UTILISATION PAR LE VOYAGEUR Les séjours touristiques en zones d endémies palustres sont de plus en plus fréquents. Les voyageurs peuvent désormais choisir des destinations très éloignées de toute structure médicale. Dans ces situations, compte tenu des résistances de P. falciparum aux principaux antipaludéens et de la gravité potentielle de l infection, il est fréquent que le voyageur bénéficie, en plus des recommandations générales concernant la prophylaxie des piqûres de moustiques et du traitement prophylactique médicamenteux, de la prescription d un traitement curatif à utiliser en cas de fièvre. Dans ces situations, la question de l intérêt de l utilisation des tests de détection antigénique par le voyageur a rapidement été posée. Différentes études prospectives ont évalué l utilisation des tests antigéniques comme moyen d autodiagnostic pour le voyageur. Quel que soit le test utilisé, celui-ci nécessite un prélèvement sanguin. Les difficultés rencontrées pour recueillir le sang et remplir le tube capillaire sont le principal obstacle à la réalisation du test. Cela peut expliquer jusqu à 71 % (22/31) des échecs techniques rapportés par les voyageurs (26). L utilisation du ParaSight -F, en consultation, par le médecin, a confirmé la difficulté de recueil des 50 µl de sang total. Sur 140 prélèvements, pour 42 (30 %), le médecin a dû s y prendre à deux fois pour remplir le capillaire (27). Plus généralement, les défauts de manipulation des tests sont, en grande partie, à rapporter à la mauvaise compréhension des notices rédigées par les fabricants. Si l on fournit un mode d emploi adapté aux touristes (sans termes techniques et en tenant compte des remarques des utilisateurs) (28), si l on associe instructions écrites et orales en remettant le kit au voyageur (29), les proportions d échec ne sont plus que de l ordre de 9 % à 10 % respectivement, alors qu elles peuvent atteindre 25 (29) Paramètre ParaSight -F ICT Malaria Pf ParaSight -F ICT Malaria Pf Sensibilité 95 % (116/122) 95 % (116/122) 96 % (51/53) 96 % (51/53) Spécificité 90 % (116/129) 89 % (115/129) 6 % (95/99) 98 % (99/101) Tableau III. Paludisme d importation : performances comparées du ParaSight -F et de l ICT Malaria Pf par rapport à la microscopie (23, 24). 228 La Lettre de l Infectiologue - Tome XV - n 6 - juin 2000

5 à 32 % (26) si la notice du fabricant est fournie sans explication. L utilisation de vidéo pourrait encore abaisser les erreurs. Enfin, les difficultés d interprétation des tests en cas de faible (< 0,1 % d hématies parasitées) ou de forte parasitémie (> 2 %) limitent d autant l utilisation de ces tests par le voyageur (30). CONCLUSION Les tests de détection antigénique par immunochromatographie sur bandelette ne peuvent prétendre remplacer le diagnostic microscopique. Ils sont moins sensibles que la goutte épaisse, ne sont pas ou peu quantitatifs et ne permettent le diagnostic que d une (P. falciparum) ou deux (P. falciparum et P. vivax) espèces. Toutefois, leur sensibilité, proche de celle obtenue par frottis, permet un diagnostic rapide de P. falciparum, même par un personnel peu qualifié et dans un environnement démuni de toute structure sanitaire. La commercialisation de tests à moins d un dollar peut permettre d envisager l utilisation de ces tests dans la stratégie de lutte contre le paludisme, en limitant notamment les traitements injustifiés, qui retardent d autant les vrais diagnostics et qui participent, par la prescription d antipaludéens de plus en plus coûteux et inutiles, à la progression de la résistance des antipaludéens vis-à-vis de P. falciparum. " 11. Jelinek T., Grobush M., Schwenke S., Steildl S., von Sonnenburg F., Nothdurft H., Klein E., Loscher T. Sensitivity and specificity of dipstick tests for rapid diagnosis of malaria in noimmune travellers. J Clin Microbiol 1999 ; 37 : Traore I., Koita O., Doumbo O., Kassambara L., Ouattara A., Diakite M., Sagara I., Diallo M., Krogstad D. Field studies of the Parasight F test in a malaria endemic area : cost, feasibility, sensitivity, specificity, predictive value and deletion of the hrp2 gene among wild type Plasmodium falciparum in Mali. 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6 Formation Médicale Continue M C I. Lors d une épidémie de paludisme à Plasmodium falciparum dans une population non immune, et en l absence de prise en charge thérapeutique, la létalité varie de : II. Les tests diagnostiques du paludisme par détection immunochromatographique de l antigène HRP-2 de P. falciparum (ParaSight -F, ICT Malaria Pf ): a. 0 à 1 % b. 1 à 20 % c. 20 à 40 % d. 40 à 60 % e. 60 à 80 % a. permettent également le diagnostic des trois autres espèces de Plasmodium b. nécessitent une prise de sang par ponction veineuse c. peuvent être réalisés en l absence de toute structure sanitaire d. peuvent être faussement négatifs en raison de l existence d une souche de P. falciparum déficitaire en HRP-2 e. peuvent être positifs alors que la parasitémie a disparu à l examen microscopique III. Le test diagnostique par détection immunochromatographique des isoenzymes de LDH : LDH de P. falciparum et LDH du genre Plasmodium (OptiMAL ): IV. En zone d endémie, l infection à P. falciparum au cours de la grossesse : a. permet le diagnostic des quatre espèces de Plasmodium b. permet seulement le diagnostic de P. falciparum et P. vivax c. peut détecter les souches de P. falciparum résistantes au traitement d. est négatif lorsque la parasitémie est indétectable par la microscopie e. est moins sensible au facteur rhumatoïde (fausse positivité) que les tests de détection d HRP-2 a. est souvent asymptomatique b. peut être responsable d un petit poids à la naissance c. n est parfois diagnostiquée que sur le frottis de sang placentaire d. peut être responsable de prématurité e. semble plus souvent diagnostiquée par la détection dans le sang périphérique de l antigène HRP-2 que par la mise en évidence microscopique du parasite Voir réponses page 251 Les articles publiés dans La Lettre de l Infectiologue le sont sous la seule responsabilité de leurs auteurs. Tous droits de reproduction, d'adaptation et de traduction par tous procédés réservés pour tous pays. octobre EDIMARK S.A. Imprimé en France - Differdange S.A Sannois - Dépôt légal 2 e trimestre La Lettre de l Infectiologue - Tome XV - n 6 - juin 2000

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