Mise au point. Test rapide de diagnostic du paludisme : une curieuse discordance.

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1 Mise au point Test rapide de diagnostic du paludisme : une curieuse discordance. J. Maslin a, T. Coton b, C. Martinaud a, D. Lignac c, L. Journaux d, F. Grassin e, B. Chagneau f. a Fédération des Laboratoires, HIA Sainte-Anne, BP Toulon Cedex. b Service de Gastroentérologie, HIA Laveran, BP Marseille Cedex 13. c 2 e Régiment étranger parachutiste, Camp Raffali Calvi. d 1er Régiment parachutiste d Infanterie de Marine, Citadelle général Berge, BP Bayonne Cedex. e Service de médecine, Groupement médico-chirurgical Bouffard, SP Armées. f 2 e Régiment étranger d Infanterie, rue Vincent Faïta, Quartier col de Chabrières, BP Nîmes Armées. Article reçu le 27 aout 2008, accepté le 8 septembre Résumé Le diagnostic du paludisme est une urgence, l évolution du patient restant imprévisible et pouvant aboutir au décès. À côté de la mise en évidence directe du parasite dans le sang qui reste la référence, des tests rapides antigéniques ont été développés. Ces bandelettes sensibilisées par des anticorps monoclonaux sont simples d utilisation et rapides. D un apport précieux pour le médecin en opérations extérieures ou en poste isolé, leur interprétation reste délicate. Deux observations rapportées à Djibouti permettent de présenter un aspect méconnu de la surestimation diagnostique liée à un non respect des consignes d utilisation de ces tests et d en rappeler leur principe. Bien qu étant de bons outils complémentaires au sein d un faisceau d arguments, les tests rapides antigéniques ne doivent jamais être interprétés isolément. Mots-clés : Diagnostic biologique. Faux positif. Paludisme. Test antigénique. Abstract RAPID DIPSTICK TEST FOR MALARIA : A CURIOUS DISCREPANCY. Summary: Malaria is a burden in sub-saharian endemic countries and represent an urgent laboratory diagnosis, the evolution of the patient remaining unforeseeable. Besides the conventional test allowing the direct research of trophozoite in blood, which keeps being the reference, numerous rapid dipstick assays has been developed. They are based on the capture of parasite antigen using monoclonal antibodies and are of a great contribution for an isolated medical structure during overseas deployments. They contribute to ensure appropriate treatment and an early case management but their clinical usefulness and interpretation remains limited. We report two observations of French soldiers from Djibouti presenting a non described false positive aspect due to a wrong use of the procedure. The rapid dipsticks are effective tools for the diagnosis of malaria but their association with other tests should be considered. Keywords: Biological diagnosis. False positive. Malaria. Rapid dipstick test. Introduction. Le paludisme à P.falciparumest une urgence biologique et thérapeutique. On estime qu entre 60 % et 65 % des cas J. MASLIN, médecin en chef. T. COTON, médecin en chef. C. MARTINAUD, médecin principal. D. LIGNAC, médecin en chef. L. JOURNAUX, médecin en chef. F. GRASSIN, médecin en chef. B. CHAGNEAU, médecin principal. Correspondance : J. MASLIN, Fédération des laboratoires, HIA Sainte-Anne, BP Toulon Cedex. déclarés chaque année dans les armées, ont été diagnostiqués par des médecins en poste isolé (Le paludisme dans les armées, année 2008, Doc. N 72/IMTSSA/DESP/US2E/09). Le nombre de cas déclarés ces quatre dernières années était respectivement de 619, 568, 333 et 420 pour 2005, 2006, 2007, 2008 (Bulletin épidémiologique des armées N 01/2008, DCSSA/AST/TEC/EPID, mai 2008 et référence précédente). En 2008, le nombre de militaires français exposés au paludisme était de (personnels tournants et permanents). Avec 80 accès déclarés l année médecine et armées, 2010, 38, 1, xx-xx 137

2 dernière, le taux d incidence (2,4 p 100 h.an) était en augmentation par rapport à Il est communément admis que le devenir du patient dépend avant tout du délai diagnostique, et à côté de l examen du frottis sanguin, technique de référence et seule preuve formelle mettant en évidence directement le parasite, les tests rapides ont trouvés naturellement leur place. Ces tests ont l avantage de leur simplicité d utilisation et de leur rapidité mais leur interprétation reste délicate. Si l on craint surtout le résultat faussement négatif qui peut être dramatique pour le malade, la surestimation, bien que moins dangereuse, égare le diagnostic et n est pas sans conséquences notamment en terme de disponibilité opérationnelle, de coût, et de surveillance épidémiologique. À propos de deux observations, nous rappelons le principe de ces tests dont découle les précautions d emploi et présentons un aspect méconnu de leur limite : le résultat faux positif lié à un non respect des consignes d utilisation. Observations. La compagnie d infanterie de la 13 e Demi Brigade de Légion Étrangère (13 e DBLE), stationnée à Djibouti rentrait d une mission de deux mois à Birao en République Centrafricaine (RCA) à la fin du mois de mai2007 (saison chaude et sèche). La prophylaxie anti-palustre choisie était la doxycycline (100 mg/j). Le lendemain de leur retour à Djibouti, deux légionnaires consultaient au service médical d unité (SMU) de la 13 e DBLE pour une diarrhée fébrile. L hypothèse diagnostique du paludisme de retour de zone d endémie était naturellement évoquée, et un test de diagnostic rapide (TDR) de type Core Malaria Pan/Pv/Pf (Core-Diagnostics, Birmingham, UK) était réalisé en salle de soins sur une paillasse du SMU. Les tests étaient positifs pour Plasmodium falciparum pour les deux patients. Les deux légionnaires étaient adressés au service des urgences du Groupement médico-chirurgical Bouffard (GMCB). Un prélèvement sanguin était réalisé et adressé au laboratoire de biologie clinique du GMCB accompagné d une demande d hémogramme, numération plaquettaire, et d une confirmation du diagnostic d espèce avec calcul de la parasitémie. Les militaires étaient hospitalisés dans le service de médecine du GMCB. Au laboratoire, les taux de plaquettes étaient normaux et les deux tests de concentration à l acridine orange (QBC test) négatifs. Les frottis sanguins ne retrouvaient pas de parasites, l aspect cytologique étant normal hormis la présence de quelques lymphocytes activés. Les deux patients âgés respectivement de 25 et 29 ans, n étaient plus fébriles à leur admission dans le service de médecine, et leur examen clinique était non contributif. Ils avouaient n avoir suivi aucune chimioprophylaxie anti-palustre. Le reste du bilan biologique était sans particularités en dehors d un syndrome inflammatoire (CRP à 83 mg/l et 53 mg/l). Les contrôles des tests QBC et de la détection de l HRP2 restaient négatifs. Les coprocultures et recherche de kystes, œufs, parasites (KOP) ne mettaient pas en évidence d agent pathogène chez le premier patient, l absence de selles ne permettant pas de réaliser de coprocultures-kop chez l autre légionnaire. Dans les deux cas, l évolution était favorable, et autorisait un retour à l unité après 48 heures d observation. Bien que les CRP étaient supérieures aux valeurs attendues au cours des diarrhées associées aux virus entériques (moyenne = 34 mg/l), le diagnostic de sortie retenu était une gastroentérite aiguë probablement d origine virale. Devant cette discordance entre les TDR réalisés au SMU et les examens réalisés au laboratoire du GMCB, une enquête était menée. Elle mit en évidence une initiative de l infirmier ayant réalisé le test qui entraîna une mauvaise utilisation du test de diagnostic rapide au SMU. En effet, le flacon de tampon de lyse et migration fourni par le constructeur du coffret étant vide, le test avait été réalisé avec de l eau pour préparation injectable (PPI) à la place du réactif dédié. Discussion. Rappels : les tests de diagnostic rapide du paludisme. Principe des tests de diagnostic rapide. Tous les TDR reposent sur le même principe et permettent de mettre en évidence la présence de Plasmodium. Ils sont caractérisés par leur facilité d emploi et d interprétation, l absence de traitement initial de l échantillon (sang total), et l obtention d un résultat en moins de 30 minutes (1). Ces tests sont basés sur la détection d antigènes circulants (protéines ou enzymes) spécifiques de l hématozoaire. Ils mettent en évidence, d une part, la glycoprotéine HRP-2 (histidine rich protein-2) spécifique de l espèce Plasmodium falciparum; d autre part, l isoenzyme LDH dans sa conformation pan-ldh : commune à toutes les espèces plasmodiales, ou spécifique de l espèce Plasmodium vivax(pv LDH), ou de l espèce Plasmodium falciparum (Pf LDH). Le principe des TDR est l immunochromatographie sur membrane. Ils se présentent sous forme de petit boîtier type «savonnette». Le sang total, recueilli la plupart du temps au niveau de la pulpe du doigt est déposé à l une des extrémités d une membrane de nitrocellulose. Si l antigène recherché est présent, il se lie avec des anticorps monoclonaux spécifiques (Ac anti-hrp-2, Ac anti-pan LDH, Ac anti- Pf LDH, Ac anti-pv LDH) d origine animale et préalablement déposés sur la membrane. Ces anticorps sont marqués d un chromogène, le plus souvent à l or colloïdal. L addition d un tampon de lyse permet aux complexes antigènes anticorps de migrer par capillarité. Ils sont arrêtés par d autres anticorps fixés à la membrane, dirigés contre le même antigène. Il se forme alors un sandwich : un résultat positif se traduit par l apparition d une bande colorée. L excès d anticorps d origine animale va continuer à migrer et sera arrêté plus en aval par un anticorps anti-anticorps animal fixé à la membrane, une nouvelle ligne colorée valide ainsi le bon fonctionnement du test et sert de contrôle interne. 138 j. maslin

3 Il peut exister plusieurs anticorps reconnaissant plusieurs antigènes et permettant la mise en évidence de plusieurs épitopes parasitaires. Tests commerciaux disponibles. Actuellement huit principaux tests immunochromatographiques sont disponibles. Il s agit de Core Malaria, Palutop+4, Now ICT Malaria, ICT Malaria, Palutop, Kat-Quick Malaria, OptiMAL Pf 1, OptiMAL Pf 2 (tab. I). Ces tests rapides peuvent être classés en de Plasmodium falciparum exposée à la surface du globule rouge parasité et, en même temps, sécrétée par les formes sexués et les jeunes gamétocytes au cours du cycle érythrocytaire avec un pic au moment de la rupture des schizontes. Il existe une circulation prolongée d HRP-2 détectable une quinzaine de jours après la disparition du parasite du sang. Cette persistance autorise un diagnostic rétrospectif mais ne permet donc pas de juger de l efficacité d un traitement. À l inverse, les LDH sont produites exclusivement Tableau I. Caractéristiques des tests de diagnostic rapide du paludisme. Nom du test Core Malaria Palutop+4 Now ICT Malaria ICT Malaria Palutop Kat-Quick Malaria Fabriquant Core diagnostics All diag Fumouze Fumouze All diag AES OptiMAL Pf 1 OptiMAL Pf 2 Diagnostics laboratories Diagnostics laboratories Antigène HRP Pan-LDH Pf-LDH + + Pv-LDH+ + + Température de Conservation ( C) Durée de réalisation +2 ; ; ; ; ; ; ; min 15 min 20 min 5 min 15 min 15 min 20 min 20 min fonction du nombre d antigènes détectés, de leur temps de réalisation ou de leur intervalle de température de conservation (2). La plupart, à l exception de la série OptiMAL permettent la mise en évidence de l HRP-2 ; certains dont le Core Malaria autorisent la mise en évidence précise d une autre espèce (Plasmodium vivax) en plus de la mise en évidence «générique» d un plasmodium. La sensibilité et la spécificité revendiquées par les constructeurs de ces tests sont comparables (3). D une manière générale, la sensibilité des tests peut être prise en défaut lors de parasitémies basses (inférieures au seuil de détection) et des absences de bandes Pan-LDH ont été observées dans certaines infections à Plasmodium ovale (4). Test disponible dans les unités : core malaria pan/pv/pf. Principe du test. Il s agit d un test qualitatif utilisant du sang total et détectant la protéine «histidine rich protein-2» de Plasmodium falciparum (Pf HRP-2), l isoenzyme LDH spécifique de Plasmodium vivax et l isoforme LDH commune aux quatre espèces de Plasmodiumpathogènes. Il permet donc le diagnostic de paludisme et la différenciation d espèce entre falciparum, vivax et ovale/ malariae. La protéine HRP-2 est une protéine spécifique pendant le stade érythrocytaire du parasite et ne persistent pas après disparition du parasite, rendant possible un «suivi» de l efficacité du traitement (tab. II). Limites du test. Faux négatifs (tab. III). La limite de détection, qui est commune à l ensemble des TDR, est de l ordre de 100 parasites par μl soit Tableau II. Interprétation des résultats du test Core Malaria Pan/Pv/Pf. Contrôle Pan (Pan LDH) Pv (pldh P.vivax) Pf (HRP2) P falciparum Interprétation Absence de parasite Présence de P.falciparum Présence de P.vivax Infection mixte P.falciparum / P.vivax Infection P.ovale ou P.vivax Traitement en cours d une infection à P.falciparum test rapide de diagnostic du paludisme : une curieuse discordance 139

4 Tableau III. Synthèse des principaux risques de faux négatifs et faux positifs lors de l interprétation des résultats des tests de diagnostic rapide. Risques de faux négatifs Faible parasitémie : seuil HRP2 = 100 hp* / μl seuil pldh = 100 à 500 hp / μl Présence d anticorps anti HRP2 (rare) Mutation du gène codant l HRP2 (rare) Mauvaise conservation ou kit périmé Phénomène de prozone** à très forte parasitémie Risques de faux positifs Lecture trop tardive après le dépôt des réactifs Présence d auto anticorps ou facteurs rhumatoïdes Remplacement du tampon de lyse par une autre solution * HP : hématies parasitées. ** : phénomène observé en cas de trop forte concentration antigénique aboutissant à une saturation de la réaction. 0,002 % d hématies infectées, ce qui est comparable à la sensibilité de la lecture du frottis par un biologiste expérimenté. Une faible parasitémie risque donc de conduire à un résultat faux négatif. Le recours à une méthode de concentration est, dans ce cas, indispensable. Suivant les études, la sensibilité est comprise entre 88 % et 95 %, elle n est donc jamais de 100 %, et il faut garder à l esprit qu elle est classiquement bien moindre pour P. ovale (3). Faux positifs (tab. III). La présence d anticorps anti-anticorps d origine animale, ou de facteur rhumatoïde à des taux élevés peut être à l origine de faux positifs (5, 6). Une lecture trop tardive peut également conduire à l apparition d un signal positif (7). Dans notre observation, nous décrivons une nouvelle cause de faux positif, liée à l utilisation de l eau PPI à la place du tampon de migration-lyse. Les TDR réalisés à l unité n ayant pu être contrôlés et pour confirmer le rôle de l eau PPI dans ces faux positifs, nous avons effectué au Laboratoire de biologie clinique du GMC Bouffard des tests de diagnostic rapide à partir de sang de patients asymptomatiques, non exposés au risque paludique et dont les résultats des QBC tests réalisés à titre systématique étaient négatifs. Dix tests ont été réalisés en double avec utilisation de l eau PPI, dans un cas et de tampon du kit dans l autre cas. Les tests faits avec de l eau PPI étaient tous positifs et ceux faits avec du solvant étaient tous négatifs (fig. 1). La recherche du mécanisme de cette réaction auprès du fabriquant du kit, s est soldée par une fin de non-recevoir: le kit devant être utilisé dans le strict respect de sa notice. Il s avère que le tampon de migration n est pas un élément neutre de la réaction antigène-anticorps qui se produit au cours de la migration de l échantillon sur la bandelette de nitrocellulose. Il possède en particulier un ph constant optimisé pour la réaction, ce qui n est pas le cas de l eau PPI dont le ph peut même être acide. Un deuxième élément est la composition du tampon : celui-ci contient des éléments détergents et saturants. Ces molécules permettent d éviter les interactions non spécifiques qui peuvent se produire entre toutes les protéines et donc entre les anticorps fixés et les molécules migrants sur la bandelette (notamment les anticorps marqués et les protéines contenues dans le prélèvement). Conclusion. Les TDR sont adaptés au contexte d urgence, en zone d endémie, dans des conditions précaires. Leur utilisation, si elle est simple, doit être confiée à des professionnels de santé formés, connaissant les règles d interprétation, d emploi, et les limites des tests. La connaissance des faux négatifs est classique, celle des faux positifs est plus rare. Figure 1. Résultats de patients non impaludés (eau PPI versus tampon fabriquant). Tests réalisés sur les mêmes échantillons avec de l eau PPI (a) et avec le tampon adéquat (b). Les tests réalisés en eau PPI sont tous positifs (a), les tests réalisés avec le tampon sont tous négatifs (b). Dans les deux cas, les tests sont validés par la ligne de contrôle C. (Pour une lecture plus aisée seuls 4 résultats sur 10 sont montrés). 140 j. maslin

5 Nous rappelons, à l appui de cette observation, que la validation de ces tests n est valable que dans la mesure où ils sont conservés et utilisés en stricte conformité avec les indications du fabriquant. Toute dérive dans leur emploi doit être immédiatement rectifiée. Dans tous les cas, ces tests ne dispensent pas de réaliser un examen du frottis sanguin par un biologiste qui permet seul de confirmer la présence de Plasmodium, d en préciser l espèce en cause et d établir la parasitémie en cas de P. falciparum. D une manière générale ces tests doivent être inclus dans un algorithme décisionnel et ne pas être employés seuls (8, 9). Il est par ailleurs souhaitable, au moindre doute, d adresser les lames à un laboratoire de parasitologie de référence pour obtenir un avis d expert. Ces rappels nous paraissent importants si l on considère l apport des TDR à la fois comme aide au diagnostic, mais également comme preuve parasitologique pour la surveillance épidémiologique du paludisme au même titre que le frottis sanguin, la goutte épaisse, ou le test de concentration à l acridine orange. En effet leur utilisation non conforme peut avoir des conséquences multiples: diagnostiques, économiques, opérationnelles (indisponibilité du militaire) et épidémiologiques (déclarations erronées). RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. A Moody. Rapid Diagostic Tests For Malaria Parasites. Clinical Microbiology Reviews : Chakour M, Koeck JL, Maslin J, Nicand E, Chadli M, Nizou JYet al. Diagnostic biologique rapide en contexte épidémique : états des lieux, perspectives. Médecine et Maladies Infectieuses 2003 ; 33 : Hance P, Garnotel E, De Pina JJ, Vedy S, Ragot C, Chadli M et al. Tests immunochromatographiques rapides de détection du paludisme, principes et stratégies d utilisation. Médecine tropicale 2005; 65: Moody A, Hunt-Cooke A, Gabbette E, Chiodini P. Performance of the Optimal malaria antigen capture dipstick for malaria diagnosis and treatment monitoring at the Hospital for Tropical disease, London. British Journal of Haematology 2000 ; 109 : Grobusch M, Alpermann U, Schwenke S et coll. False positive rapid tests for malaria in patients with rheumatoid factor. Lancet 1999 ; 353 : Bartoloni A, Sabatinelli G, Benucci M. Performance of two rapid tests for Plasmodium falciparum malaria in patients with rheumatoid factors. New England Journal of Medicine 1997 ; 22 : XIII e conference de consensus : paludisme à Plasmodium falciparum. Actualisation documents/consensus/2007-paludisme-court.pdf. 8. Wongsrichanalai C, Barcus M-J, Muth S, Sutamihardja A, Wernsdorfer W-H. A review of malaria diagnostic tools : microscopy and rapid diagnostic test (RDT). American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2007 ; 77 : Delaunay P, Estran-Pomares C, Marty P. Diagnostic du paludisme : frottis sanguin, goutte épaisse et tests antigéniques. Médecine et Maladies Infectieuses 2008 ; 38 : S121-S123. test rapide de diagnostic du paludisme : une curieuse discordance 141

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