ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand

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1 A ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand A. Veyradier, M. Wolf, A. Stepanian, P. Coppo A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeats (ADAMTS13) est la protéase spécifique du facteur von Willebrand. En cas de brèche vasculaire, ce dernier permet, grâce à sa structure multimérique, l adhésion des plaquettes au sous-endothélium et l agrégation des plaquettes entre elles dans la microcirculation, où les forces de cisaillement sont élevées. ADAMTS13 régule l activité du facteur von Willebrand en réduisant la taille de ses multimères. Un déficit fonctionnel sévère en ADAMTS13 (activité inférieure à 10 %) est observé dans la majorité des cas de purpura thrombotique thrombocytopénique, une microangiopathie thrombotique définie par la formation spontanée dans la microcirculation sanguine de thrombi plaquettaires responsables d une anémie hémolytique mécanique, d une thrombopénie de consommation et de signes d ischémie multiviscérale. Il s agit d une maladie rare (quatre cas pour un million d habitants et par an) mais gravissime en l absence de traitement immédiat et spécifique (plasmathérapie). Dans 90 % des cas, le purpura thrombotique thrombocytopénique est acquis et dû à la présence d autoanticorps anti-adamts13. Dans les autres cas, il s agit d un déficit constitutionnel de transmission autosomique récessive appelé syndrome d Upshaw-Schulman. Les tests permettant l exploration biologique d ADAMTS13 comprennent la mesure de son activité, de son taux antigénique, du titre des immunoglobulines G anti-adamts13, ainsi que la recherche d une activité inhibitrice circulante anti-adamts13 et de mutations du gène d ADAMTS13. L ensemble de ces analyses fait appel à des techniques hyperspécialisées coûteuses et réservées à des centres experts. Outre les éléments de réponse qu elle peut apporter aux questions concernant la corrélation phénotype/génotype, une meilleure caractérisation structurale et fonctionnelle d ADAMTS13 est cruciale pour évaluer la pertinence d une forme purifiée plasmatique ou recombinante à visée thérapeutique Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : ADAMTS13 ; Facteur von Willebrand ; Autoanticorps anti-adamts13 ; Purpura thrombotique thrombocytopénique ; Syndrome d Upshaw-Schulman Plan Introduction 1 ADAMTS13 2 Propriétés biochimiques 2 Biosynthèse 2 Structure 2 Clivage protéolytique du VWF 2 Liaison au VWF 3 Régulation 3 Exploration biologique d ADAMTS13 4 Étapes préanalytiques 4 Méthodes biologiques 4 Variations physiologiques et déficits partiels en ADAMTS13 6 Variations physiologiques 6 Déficits partiels en ADAMTS13 6 Déficits sévères en ADAMTS13 6 Définition, épidémiologie, clinique et traitement du purpura thrombotique thrombocytopénique 6 Physiopathologie du purpura thrombotique thrombocytopénique 6 Indications et interprétation de l exploration biologique d ADAMTS13 dans le PTT 7 Conclusion et perspectives 8 Biologie médicale Introduction L hémostase primaire correspond à la formation du clou plaquettaire comme première étape à la réparation d une brèche vasculaire. Le facteur von Willebrand (VWF) est une glycoprotéine plasmatique qui joue un rôle clé dans l hémostase primaire puisqu il est indispensable à l adhésion des plaquettes au sous-endothélium mis à nu par la brèche vasculaire et à l agrégation des plaquettes entre elles à des taux de cisaillement élevés du flux sanguin (microcirculation sanguine) [1].LeVWF est synthétisé dans les cellules endothéliales et dans les mégacaryocytes (où il est stocké respectivement dans les corps de Weibel-Palade et les granules alpha), compartiments cellulaires à partir desquels il est sécrété dans le plasma. La particularité du VWF est d avoir une structure multimérique organisée en association de dimères (eux-mêmes constitués de l association de deux monomères dont le poids moléculaire est de l ordre de 250 kda) : le plus petit multimère est un dimère de 500 kda et les plus grands multimères peuvent atteindre un poids moléculaire de kda. Cette organisation multimérique a une conséquence directe sur sa fonction puisque le pouvoir adhésif du VWF vis-à-vis du sous-endothélium et des plaquettes est proportionnel à la taille du multimère. Dans le plasma circule un éventail de multimères du VWF de différentes tailles classiquement classés en trois groupes : les bas poids moléculaire, les poids moléculaire intermédiaires et les hauts poids moléculaire. 1

2 A ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand Dans les compartiments cellulaires, il existe en plus des multimères de très haut poids moléculaire du VWF qui ne sont pas retrouvés dans le plasma dans les conditions physiologiques. La régulation de la taille des multimères de VWF dans le plasma repose essentiellement sur l action d une protéase spécifique de clivage du VWF appelée A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeats, treizième membre (ADAMTS13) [1]. Cette régulation est cruciale pour prévenir la formation de thrombi plaquettaires au sein de la microcirculation sanguine. ADAMTS13 Propriétés biochimiques En 1996, deux groupes indépendants [2, 3] purifient partiellement la protéase spécifique de clivage du VWF à partir de plasma humain. Cette enzyme est identifiée comme une métalloprotéase d environ 200 kda différente des métalloprotéases matricielles ou des sérine-protéases plasmatiques puisque leurs inhibiteurs habituels n ont aucun effet sur sa propre activité enzymatique in vitro. Son spectre d action apparaît étroit puisqu elle ne dégrade ni le fibrinogène, ni l albumine, ni le collagène ; en revanche, elle hydrolyse spécifiquement le VWF par scission du pont peptidique Tyr1605-Met1606 situé dans son domaine A2. In vitro, son activité enzymatique est potentialisée par les cations divalents (en particulier le Ca 2+ )et par un ph optimal compris entre 8 et 9 ; elle est bloquée en présence d éthylène diamine tétracétique (EDTA). Sa concentration plasmatique est de l ordre de 1 µg/ml. Sa demi-vie dans le plasma, comprise entre 2 et 3 jours, est inhabituellement longue pour une protéase [4], ce qui suggère l existence, en plus de sa forme soluble plasmatique, d une forme liée à un récepteur cellulaire et/ou à un transporteur plasmatique qui n est pas encore identifié. Biosynthèse Le gène de la protéase spécifique du VWF a été identifié simultanément grâce au séquençage de l extrémité N-terminale de la protéine [5-7] et à une stratégie de clonage positionnel [8] conduisant ainsi à la découverte du treizième membre de la famille ADAMTS, dont une vingtaine de membres sont identifiés. Le gène codant ADAMTS13 (ADAMTS13) est localisé sur le chromosome 9q34 et s étend sur 37 kb incluant 29 exons. L acide ribonucléique messager complet comprend 4,6 kb mais il existe un épissage alternatif du gène conduisant à plusieurs variants dont la signification demeure inconnue. ADAMTS13 est synthétisée dans les cellules stellaires périsinusoïdales (ou cellules de Ito siégeant entre les hépatocytes et les cellules endothéliales) du foie [8-10], les cellules endothéliales [11, 12] et les cellules de la lignée mégacaryocytaire [13, 14]. Elle est sécrétée dans le plasma sous forme d une enzyme active. Structure La pré-pro-adamts13 est une monochaîne de acides aminés [6]. Elle comprend un peptide signal (33 acides aminés) et un propeptide (41 acides aminés) dont la séquence C-terminale est compatible avec une protéolyse par la furine. La protéase mature est glycosylée, et cela explique probablement la différence entre sa masse moléculaire calculée (145 kda) et la masse moléculaire apparente de son produit de purification plasmatique (190 kda). Après clivage du propeptide, la forme mature d ADAMTS13 (Fig. 1) comprend un domaine métalloprotéase, un domaine de type désintégrine, un domaine thrombospondine de type 1 (TSP-1), un domaine riche en cystéines contenant une séquence RGDS potentiellement impliquée dans des interactions avec des intégrines, un domaine de type ADAMTS spacer. L arrangement séquentiel spécifique de ces précédents domaines définit les protéines de la famille ADAMTS. En outre, les membres de la famille ADAMTS comprennent une combinaison propre de domaines TSP-1 additionnels et d autres motifs C-terminaux. Après son domaine spacer, ADAMTS13 contient sept autres domaines TSP-1 et deux domaines CUB (Fig. 1). En particulier, ADAMTS13 se distingue des autres membres de la famille ADAMTS par son propeptide particulièrement court et la présence de domaines CUB. La signification fonctionnelle de ces caractéristiques distinctives est inconnue jusqu à présent. Clivage protéolytique du VWF À ce jour, la seule fonction connue d ADAMTS13 est de cliver spécifiquement le VWF (au niveau du pont peptidique Tyr1605- Met1606) afin de limiter la taille (et ainsi le pouvoir adhésif visà-vis des plaquettes) des multimères de VWF circulant dans le plasma, et par conséquent de réguler la formation du clou plaquettaire en réponse à une brèche vasculaire. Le clivage de son propeptide n apparaît pas indispensable à l activité enzymatique d ADAMTS13 [15]. Le domaine catalytique d ADAMTS13 (métalloprotéase) inclut le site actif enzymatique H 224 EXXHXXGXXHD 235 de type adamalysine qui contient des sites de liaison aux ions Ca 2+ et Zn 2+[16,17]. Figure 1. Domaines structuraux et fonctionnels d ADAMTS13. ADAMTS13 est une glycoprotéine monocaténaire composée de la succession des domaines structuraux suivants : un peptide signal (PS), un propeptide (P), un domaine métalloprotéase qui contient des sites de fixation au calcium et au zinc, un domaine désintégrine, un premier domaine thrombospondine de type 1 (TSP-1), un domaine riche en cystéines, un domaine spacer, une succession de sept domaines TSP-1 et deux domaines CUB. La partie N-terminale d ADAMTS13 (allant du domaine métalloprotéase jusqu au domaine spacer inclus) est indispensable au clivage du facteur von Willebrand (VWF) in vitro et in vivo. La partie C-terminale d ADAMTS13 n est pas indispensable à ce clivage in vitro, mais elle l est probablement in vivo puisqu elle est indispensable à la liaison d ADAMTS13 au VWF d une part et à son récepteur endothélial, le CD36, d autre part. 2 Biologie médicale

3 ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand A Figure 2. Clivage protéolytique du facteur von Willebrand (VWF) par ADAMTS13. ADAMTS13 intervient dans la régulation de la taille des multimères du VWF afin de limiter son pouvoir adhésif, dans deux situations distinctes. A. À la phase initiale de la sécrétion du VWF par les cellules endothéliales, ADAMTS13 clive les multimères de très haut poids moléculaire du VWF (limitation immédiate de la taille des multimères du VWF avant sa mise en circulation dans le plasma). B. Deuxièmement, au sein du clou plaquettaire formé pour réparer une brèche vasculaire, ADAMTS13 clive les multimères de haut poids moléculaire du VWF liés aux plaquettes (résorption du clou plaquettaire une fois la brèche vasculaire réparée). En outre, des études réalisées en conditions statiques in vitro à partir de protéines recombinantes tronquées ont montré que l activité enzymatique d ADAMTS13 vis-à-vis du VWF ne peut être assurée par le seul domaine métalloprotéase mais requiert au contraire la présence additionnelle d un domaine riche en cystéines et d un domaine spacer [16, 17]. Ces domaines sont donc des sites potentiels de fixation d ADAMTS13 au VWF et sont probablement impliqués dans le mécanisme de reconnaissance du substrat [18, 19]. En revanche, les domaines TSP et les domaines CUB ne sont pas indispensables au clivage du VWF in vitro [16, 17]. Liaison au VWF En conditions statiques in vitro, ADAMTS13 est incapable de se lier au VWF en solution en l absence de traitement préalable du substrat, soit par des contraintes de cisaillement élevées, soit par des agents dénaturants comme l urée ou l hydrochlorure de guanidine, ou encore par son immobilisation sur une surface plastique [20]. Ces conditions induisent donc une modification de conformation du site de liaison du VWF à ADAMTS13 indispensable à la liaison du substrat à son enzyme in vitro (le K d de la liaison d ADAMTS13 au VWF immobilisé est de l ordre de 14 nm) [20]. En conditions hémodynamiques in vitro (système BIAcore), l affinité de la liaison entre le VWF et ADAMTS13 est forte, avec un K d de l ordre de 50 nm. Des expériences réalisées avec des ADAMTS13 recombinantes tronquées confirment le rôle essentiel et coopératif des domaines TSP et CUB dans le phénomène de reconnaissance du substrat [21-23]. Ainsi, les domaines TSP-1 et CUB pourraient permettre à ADAMTS13 de se fixer in vivo aux cellules endothéliales (le CD36 endothélial est un récepteur candidat [24] ) ou aux plaquettes par son extrémité C-terminale, cet ancrage cellulaire pouvant alors être un prérequis à son interaction avec le VWF. Les sites précis de liaison entre le VWF et ADAMTS13 restent à identifier, tant sur le substrat que sur l enzyme. Des indications sont néanmoins disponibles grâce à une approche reposant sur des expériences de liaison de protéines tronquées in vitro. En conditions de flux, les domaines A1, A2 et A3 du VWF se lient à ADAMTS13, mais seul le domaine A2 semble contenir Biologie médicale des petites séquences plus spécifiquement impliquées dans cette liaison [25]. Tous les domaines d ADAMTS13 sont capables de se lier indépendamment au VWF, mais il existe un phénomène de synergie entre certains domaines d ADAMTS13 permettant une liaison de haute affinité [18]. Régulation La régulation de l activité d ADAMTS13 sur le VWF fait intervenir des propriétés intrinsèques au VWF et aussi des facteurs plasmatiques extérieurs. La modélisation du domaine A2 du VWF suggère que le pont peptidique Tyr1605-Met1606, qui constitue le site spécifique de clivage par ADAMTS13, est cryptique au sein de la molécule de VWF native [26]. In vivo, seul le dépliement du VWF induit par les forces de cisaillement élevées du flux sanguin dans les microvaisseaux permet l exposition de ce pont peptidique et le rend donc accessible à ADAMTS13. De plus, cet accès est modulé par la liaison du VWF à certains ligands comme la P-sélectine (intervenant dans la fixation du VWF à la surface des cellules endothéliales à la phase initiale de sa sécrétion dans le plasma [27] ) ou la glycoprotéine Ib plaquettaire (qui permet la liaison du VWF aux plaquettes au sein du clou plaquettaire formé pour réparer une brèche vasculaire [28] ). La liaison du VWF à ces deux ligands faciliterait l accès du VWF à ADAMTS13, expliquant ainsi pourquoi, physiologiquement, le rôle d ADAMTS13 dans la régulation de la taille des multimères du VWF est prédominant dès l étape de sécrétion du VWF par les cellules endothéliales (limitation immédiate de la taille des multimères avant la mise en circulation du VWF dans le plasma) et aussi au sein du clou plaquettaire (résorption du clou plaquettaire une fois la brèche vasculaire réparée) (Fig. 2) [27, 28]. Parmi les facteurs plasmatiques capables de modifier l activité d ADAMTS13 vis-à-vis du VWF, il faut retenir l hémolyse et certaines cytokines inflammatoires, notamment l interleukine 6 (IL6) qui inhibent l activité protéolytique d ADAMTS13 par des mécanismes non élucidés [29, 30]. La thrombine, le facteur Xa, l élastase leucocytaire et la plasmine sont capables de cliver ADAMTS13 et donc de l inactiver par dégradation [31, 32]. 3

4 A ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand Exploration biologique d ADAMTS13 Étapes préanalytiques Tests biochimiques Les tests biochimiques relatifs à ADAMTS13 (activité, antigène, titrage d immunoglobulines G [IgG] et recherche d activité inhibitrice circulante [AIC]) sont réalisés uniquement à partir de plasma citraté (tubes d hémostase classiques) ou de sérum. Les tubes doivent être centrifugés à g pendant 20 minutes dans un délai maximal de 4 heures après le prélèvement sanguin veineux périphérique (le patient n a pas besoin d être à jeûn). Le plasma citraté ou le sérum doit être décanté. Si les dosages ne peuvent pas être réalisés extemporanément, le plasma citraté ou le sérum doit être aliquoté et congelé à -20 C ou -80 C jusqu au dosage. En cas d exploitation des prélèvements sur un site extérieur, les tubes doivent être envoyés dans la carboglace. Un certain nombre de limites préanalytiques, s appliquant principalement à la mesure de l activité d ADAMTS13, doivent être soulignées. Limites communes à toutes les techniques L EDTA inactive totalement l activité d ADAMTS13 in vitro [2, 3] ; en cas d erreur de prélèvement sur tube EDTA, l activité d ADAMTS13 est retrouvée faussement effondrée. L hémoglobine libre inactive également l activité d ADAMTS13 [29], d où le caractère inexploitable de tout prélèvement hémolysé. Limites propres à certaines techniques Pour les techniques utilisant du VWF natif (VWF full-length purifié ou recombinant) comme substrat, il existe un risque d interférence avec le VWF endogène du patient si son taux de VWF:Ag plasmatique/sérique est supérieur à 300 UI/dl. Dans ce cas, il est recommandé de recourir à une technique utilisant un petit substrat (peptides synthétiques de VWF). Les techniques fluorimétriques sont parfois irréalisables en cas de plasmas autofluorescents dès le début de la mesure, avant addition de substrat. Dans certains cas également, une hyperbilirubinémie très importante peut interférer avec la lecture en fluorimétrie [33, 34]. Étude génétique Pour l étude génétique, l acide désoxyribonucléique est classiquement extrait à partir des culots cellulaires provenant de tubes de sang total prélevé sur EDTA ou citrate. Les tubes sont conservés à +4 C s ils peuvent être traités dans un délai de 72 heures ou sinon à -20 C. Un consentement éclairé du patient est nécessaire. Méthodes biologiques Activité d ADAMTS13 (activité protéolytique vis-à-vis du VWF) Depuis 1998, plusieurs méthodes de mesure de l activité d ADAMTS13 ont été développées. Elles sont relativement bien standardisées et leur objectif principal est d avoir une sensibilité suffisante pour la détection des déficits enzymatiques sévères (taux inférieurs à 10 %). Toutes ces méthodes sont basées sur la dégradation d un substrat exogène, soit du VWF natif (molécule entière ou VWF full-length) purifié à partir de plasma humain ou recombinant, soit de courts peptides synthétiques de VWF (substrat minimal pour ADAMTS13 composé d une séquence de quelques acides aminés incluant le site de clivage par ADAMTS13), par l ADAMTS13 du plasma testé [35-53] (Tableau 1). Les produits de dégradation du VWF sont mesurés soit par électrophorèse, soit par des techniques immunologiques, soit par des techniques d agrégation plaquettaire [35-53] (Tableau 1). Ces techniques, outre les limites préanalytiques déjà citées (cf. supra), présentent les limites suivantes : les tests précités sont réalisés en conditions statiques (ce qui ne reflète pas les conditions de flux nécessaires in vivo pour l exposition du VWF dans une conformation optimale à son clivage par ADAMTS13) et nécessitent donc l utilisation d agents dénaturants (urée-guanidine) pour promouvoir la susceptibilité du VWF au clivage par ADAMTS13 ; selon le type de substrat utilisé, le temps d hydrolyse peut varier de quelques heures à plusieurs jours ; les techniques utilisant des peptides synthétiques courts (ne contenant donc pas les domaines de liaison du VWF à ADAMTS13) ne sont sensibles ni à l effet des mutations d ADAMTS13 situées dans ces domaines de liaison ni à l effet d autoanticorps anti-adamts13 dont l épitope (les épitopes) serai(en)t situé(s) au sein de ces mêmes domaines. En 2010, toutes les méthodes de mesure de l activité d ADAMTS13 relèvent du statut d examens hyperspécialisés Tableau 1. Mesure de l activité d ADAMTS13 : substrats utilisés, méthodes de détection, kits commerciaux de recherche clinique disponibles. Substrats Méthodes de détection Kits commerciaux VWF full-length EP (fragment dégradé de 350 kda) [35] - EP (profil multimérique du VWF) [36] - VWF:CBA résiduel du VWF clivé [37-39] - VWF:RCo résiduel du VWF clivé [40, 41] - IRMA (VWF:Ag résiduel non clivé) [42] - Western blot (profil multimérique du VWF) [43] - VWF A2 Elisa (VWF-A2 marqué non clivé) [44] - Western blot (VWF-A2 clivé) [45] - VWF-86aa VWF86-ALEXA FRET substrate ACTIFLUOR ADAMTS13 activity assay VWF-78aa HRP-assay (VWF-78aa clivé) [46] - VWF-73aa SDS-PAGE (VWF-73aa clivé) [47] - Elisa (VWF-73aa non clivé marqué) [48] - [49, 50] FRET (VWF-73aa clivé) ATS-13 activity assay TECHNOZYM ADAMTS-13 Western blot (VWF-73aa clivé) [47, 51] - Elisa (VWF-73aa clivé) [52] TECHNOZYM ADAMTS-13 activity ELISA SELDI-TOF (VWF-73aa clivé) [53] - VWF full-length : facteur von Willebrand entier ; VWF-A2 : domaine A2 du VWF ; EP : électrophorèse ; VWF:CBA : capacité de liaison du VWF au collagène ; VWF:RCo : activité cofacteur de la ristocétine du VWF ; VWF:Ag : taux antigénique du VWF ; WVF-78aa : fragment peptidique du facteur von Willebrand compris entre les acides aminés L1591 et R1668 ; VWF-73aa : fragment peptidique du facteur von Willebrand compris entre les acides aminés D1596 et R Biologie médicale

5 ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand A Tableau 2. Mesure de l antigène d ADAMTS13 : méthodes, réactifs, kits commerciaux de recherche clinique disponibles. Méthodes Anticorps anti-adamts13 et standard Kits commerciaux Elisa non commercial [54] Elisa non commercial [55] Western blot [56] Elisa commercial (chromogénique) Elisa commercial (chromogénique) Elisa commercial (chromogénique) Elisa commercial (chromogénique) 3 anticorps monoclonaux Pool de plasmas normaux 2 anticorps polyclonaux ADAMTS13 recombinante 1 anticorps monoclonal Pool de plasmas normaux Anticorps non spécifiés Pool de plasmas normaux 1 anticorps monoclonal et 1 anticorps non spécifié Pool de plasmas normaux 1 anticorps monoclonal et 1 anticorps polyclonal de lapin biotinylé ADAMTS13 recombinante 2 anticorps polyclonaux 1 calibrant non spécifié TECHNOZYM ADAMTS-13 (Technoclone GmbH, Vienne, Autriche) TECHNOZYM ADAMTS-13 Antigen (Technoclone GmbH, Vienne, Autriche) IMUBIND ADAMTS13 ELISA HUMAN ADAMTS13 ELISA KIT Elisa : enzyme-linked immunosorbent assay. Tableau 3. Détection et titrage des immunoglobulines G (IgG) anti-adamts13 : méthodes, réactifs, kits commerciaux de recherche clinique disponibles. Méthodes Antigène, anticorps anti-adamts13 et standard Kits commerciaux Elisa commercial Elisa commercial ADAMTS13 recombinante IgG antihumaine couplée à la peroxydase Plasma humain avec fort titre d IgG anti-adamts13 ADAMTS13 recombinante IgG antihumaine de chèvre couplée à la peroxydase Standard non spécifié TECHNOZYM ADAMTS-13 INH IMUBIND ADAMTS13 Autoantibody ELISA Elisa : enzyme-linked immunosorbent assay. récemment transférés de la recherche et non du statut d examens spécialisés pouvant être effectués en routine. En corollaire, ces techniques, qui restent extrêmement coûteuses, sont centralisées dans des laboratoires experts (un ou deux laboratoires par pays en Europe, environ cinq laboratoires aux États- Unis) et il n existe pas encore de contrôle de qualité international ni national officiel. Quelle que soit la méthode utilisée, les normes de l activité d ADAMTS13 se situent entre 50 % et 150 % (exprimées par rapport à un mélange de plasmas normaux). Les sensibilité, spécificité, linéarité et précision de ces différentes méthodes ont été comparées dans différentes études multicentriques [50, 54-57]. De manière synthétique, il apparaît que toutes les méthodes de mesure de l activité d ADAMTS13 ont un seuil de détection situé entre 5%et 10%, et que leur sensibilité et leur spécificité sont excellentes dans la zone de pertinence clinique pour le diagnostic positif de purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) (cf. infra). Dans la zone des déficits partiels en ADAMTS13 (entre 15 % et 50 %) dont la pertinence clinique n est pas établie, il existe une assez grande variabilité interméthodes, alors que, pour des valeurs normales supérieures à 50 %, les méthodes sont assez bien corrélées. Plus précisément, les méthodes utilisant du VWF full-length comme substrat sont le plus souvent très bien corrélées à celles utilisant des peptides synthétiques [50, 58]. Cependant, dans une étude réalisée sur 188 échantillons comparant une méthode utilisant l hydrolyse de VWF full-length révélée par un test de liaison au collagène à une méthode utilisant le peptide synthétique FRETS-VWF73, une discordance mettant en défaut la sensibilité du FRETS-VWF73 a été observée chez 10 % des patients [57]. En 2010, la méthode FRETS-VWF73 reste celle le plus facilement utilisable et la plus rapide (résultats disponibles en une journée). Cependant, en cas de discordance avec la présentation clinique, la confrontation systématique à une méthode de Biologie médicale référence utilisant du VWF full-length s impose afin de s affranchir d un éventuel défaut de sensibilité du FRETS-VWF73 lié à certaines mutations ou à certains autoanticorps. Antigène d ADAMTS13 Plusieurs tests (enzyme-linked immunosorbent assay [Elisa] avec détection chromogénique ou western blot) dédiés à la mesure de l antigène d ADAMTS13 sont disponibles et ont été adaptés en kits commerciaux de recherche clinique [58-60] (Tableau 2). Ils utilisent des anticorps (Ac) anti-adamts13 polyclononaux ou monoclonaux. Les normes de l antigène d ADAMTS13 plasmatique sont comprises entre 700 et 1400 ng/ml. À ce jour, la capacité de ces tests à quantifier les différentes isoformes plasmatiques d ADAMTS13 n est pas établie. En outre, on ne sait pas non plus si la présence d auto-ac anti- ADAMTS13 libres ou au sein de complexes immuns interfère dans la mesure de l antigène d ADAMTS13. Autoanticorps anti-adamts13 Chez les patients atteints de PTT, la réponse auto-immune dirigée contre ADAMTS13 est polyclonale. Deux types d auto-ac anti-adamts13 ont été décrits [61-63] : des Ac «neutralisants» (ou inhibiteurs) qui agissent par inhibition directe du site catalytique d ADAMTS13, et des Ac «non neutralisants» qui agissent en se complexant à ADAMTS13 et accélèrent ainsi sa clairance. Ces deux mécanismes coexistent très souvent chez les patients atteints de PTT. Les auto-ac anti-adamts13 peuvent donc être mesurés soit par des méthodes immunologiques soit par des tests fonctionnels. Détection et titrage des IgG anti-adamts13 Plusieurs méthodes (western blot ou Elisa) dédiées à la détection et/ou au titrage des auto-ac anti-adamts13 (IgG, IgM et IgA) ont été développées [62-64]. Seules les méthodes permettant de titrer les IgG anti-adamts13 ont été adaptées en kits commerciaux de recherche clinique (Tableau 3). Ces méthodes Elisa mettent en jeu de l ADAMTS13 recombinante de type 5

6 A ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand sauvage et une révélation par des Ac anti-igg humaine. Ces méthodes détectent les IgG anti-adamts13 plasmatiques indépendamment de leur caractère fonctionnel : ainsi, les IgG neutralisantes (inhibant l activité catalytique d ADAMTS13) et les IgG non neutralisantes (complexant ADAMTS13 et accélérant sa clairance) sont toutes deux mesurées par ces tests Elisa. Cependant, la capacité de ces kits à détecter une éventuelle fraction d IgG anti-adamts13 complexée à ADAMTS13 au sein de complexes immuns reste inconnue. Selon les kits, la limite de positivité du titre d IgG anti-adamts13 définie par le fabricant est comprise entre 10 U/ml et 15 U/ml. Ce seuil est probablement sous-estimé et il est recommandé que chaque laboratoire redéfinisse son propre seuil à l aide d une population conséquente de volontaires sains. Recherche d une activité inhibitrice circulante anti-adamts13 Les Ac anti-adamts13 neutralisants (ou inhibiteurs) sont recherchés par des tests fonctionnels mesurant l activité résiduelle d ADAMTS13 d un mélange de plasma témoin et de plasma testé préchauffé à 56 C afin de dissocier d éventuels complexes immuns [61, 62, 65, 66]. Cette recherche d AIC anti- ADAMTS13 a donc les mêmes limites que celles inhérentes aux différentes méthodes de mesure de l activité d ADAMTS13. En outre, ces méthodes sont semi-quantitatives et peu sensibles, et il n existe pas de consensus quant à l expression des résultats. Séquençage du gène d ADAMTS13 L étude génétique d ADAMTS13 repose sur un séquençage exhaustif des 29 exons et des jonctions exon-intron du gène d ADAMTS13 puisqu il n existe pas de sites préférentiels de mutations dans le PTT héréditaire (syndrome d Upshaw- Schulman), seule pathologie liée à un défaut génétique d ADAMTS13 (cf. infra). Variations physiologiques et déficits partiels en ADAMTS13 Ce paragraphe ne concerne que les variations physiologiques et les déficits partiels de l activité d ADAMTS13. Les autres paramètres biologiques (antigène, autoanticorps) n ont pas été suffisamment étudiés dans la littérature pour faire ici l objet d une synthèse. Variations physiologiques Les conditions physiologiques qui semblent influencer ADAMTS13 sont les âges extrêmes de la vie, l ethnie et la grossesse [1, 67]. Ces conditions ont en commun une augmentation physiologique des taux de VWF et il apparaît donc que l activité circulante d ADAMTS13 varie en sens inverse du taux de VWF plasmatique. Un argument qui vient appuyer cette observation est que l administration de desmopressine (un analogue de la vasopressine ayant pour propriété de stimuler la sécrétion plasmatique de VWF par les cellules endothéliales) entraîne une diminution significative de l activité plasmatique d ADAMTS13 [68, 69]. Chez les nouveau-nés et les sujets âgés, l activité d ADAMTS13 apparaît discrètement diminuée [67, 70, 71] d environ 10 %à20%parrapport à la population générale. De même, les sujets noirs ont également des taux d ADAMTS13 plus bas [1]. Au cours de la grossesse, l activité d ADAMTS13 diminue progressivement à partir de la 12 e semaine d aménorrhée pour atteindre à terme des taux 15 % à 20 % inférieurs au taux de base [72]. Déficits partiels en ADAMTS13 Les déficits fonctionnels partiels en ADAMTS13 sont définis par des activités comprises entre 20 % et 50 %. Contrairement au déficit sévère qui est pathognomonique du PTT (cf. infra), ils ne sont pas spécifiques puisque retrouvés dans de nombreuses pathologies : pathologies cardiovasculaires (infarctus du myocarde [73, 74], hypertension artérielle maligne [75] ), sepsis sévère et choc septique [32, 76], accès palustre [77], hépatopathies [67-78], syndrome des antiphospholipides [79], certaines microangiopathies thrombotiques (MAT) comme le hemolysis elevated liver enzymes low platelet count (HELLP) syndrome [80, 81] ou le syndrome hémolytique et urémique [36, 65]. Dans environ 10 % des cas, des tableaux cliniques de PTT peuvent également s accompagner d une activité d ADAMTS13 subnormale ; le plus souvent, ces PTT surviennent dans un contexte de cancer, de pathologie liée au virus de l immunodéficience humaine ou de greffe [82]. Quelle que soit la pathologie concernée, la pertinence clinique de ces déficits partiels en ADAMTS13 n est pas clarifiée. Si leur implication directe dans la physiopathologie de ces différentes maladies est peu probable, il est plus vraisemblable qu ils ne soient en réalité qu une conséquence de la pathologie associée ou sous-jacente. Les mécanismes de ces déficits fonctionnels partiels en ADAMTS13 sont multiples : consommation de l enzyme par un excès de substrat, diminution de la synthèse et/ou de la sécrétion d ADAMTS13 liée à une dysfonction de l endothélium, inhibition d ADAMTS13 par certaines cytokines pro-inflammatoires comme l IL6, dégradation d ADAMTS13 par des enzymes protéolytiques (thrombine, élastases leucocytaires) [82]. Par ailleurs, un polymorphisme d ADAMTS13 (P475S) fréquent dans la population japonaise mais non retrouvé chez les Caucasiens est associé, à l état hétérozygote, à une diminution partielle de l activité d ADAMTS13 [83]. Déficits sévères en ADAMTS13 Le déficit fonctionnel sévère en ADAMTS13 est pathognomonique d une forme particulière de MAT appelée PTT [1, 82, 84, 85]. Définition, épidémiologie, clinique et traitement du purpura thrombotique thrombocytopénique Le PTT est défini par la formation spontanée dans la microcirculation sanguine de thrombi plaquettaires responsables d une anémie hémolytique mécanique, d une thrombopénie de consommation, et de signes d ischémie multiviscérale touchant principalement le cerveau et le rein. Il s agit d une maladie rare dont l incidence est estimée à 4 cas pour un million d habitants et par an. À l exception des rarissimes formes à révélation pédiatrique, le PTT touche principalement l adulte jeune de 30 à 40 ans avec une prédominance féminine (deux femmes pour un homme). Le PTT évolue classiquement par poussées entrecoupées de périodes de rémission clinique. Dans plus de 50 % des cas, le PTT est idiopathique ; dans les autres cas, il survient avec un contexte clinique associé (maladie auto-immune, infection, grossesse, médicaments, cancer, greffe d organe, etc.). Les facteurs déclenchants des poussées sont multiples (infection, grossesse, certains médicaments comme les thiénopyridines) mais restent souvent non identifiés. Le diagnostic du PTT est parfois difficile à établir en raison de l absence de spécificité de ses signes clinicobiologiques et ses diagnostics différentiels sont donc nombreux. En l absence de traitement urgent et adapté dont le prérequis est bien entendu un diagnostic précis, les poussées de PTT ont un pronostic très sévère conduisant au décès dans 90 % des cas. Depuis 1990, l utilisation empirique de la plasmathérapie (idéalement échanges plasmatiques) a révolutionné le pronostic des poussées de PTT en permettant un taux de survie de 90 % [85]. Physiopathologie du purpura thrombotique thrombocytopénique De sa première description clinique en 1926 [86], la physiopathologie du PTT est restée totalement obscure jusqu en 1982, date à laquelle il a été rapporté que les thrombi plaquettaires présents de manière diffuse dans les microvaisseaux des patients atteints de PTT avaient la particularité d être très riches en multimères de très haut poids moléculaire du VWF [87]. Ce n est que 15 ans plus tard en 1997, lorsqu ADAMTS13, la métalloprotéase responsable de la régulation de la taille des multimères du 6 Biologie médicale

7 ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand A Figure 3. Séquence physiopathologique du purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT). Dans 90 % des cas de PTT, un déficit fonctionnel sévère en ADAMTS13 (activité plasmatique inférieure à 5 %) qu il soit acquis par le biais d autoanticorps anti-adamts13 ou héréditaire par le biais de mutations bialléliques du gène d ADAMTS13, provoque un défaut de clivage des plus grands multimères de facteur von Willebrand (VWF). L accumulation dans la plasma de ces grands multimères hyperadhésifs de VWF conduit à la formation spontanée de thrombi plaquettaires dans la microcirculation sanguine (région de l arbre vasculaire où les taux de cisaillement élevés du flux sanguin confèrent au VWF une conformation spatiale dépliée particulièrement affine pour les plaquettes). Ces thrombi plaquettaires sont responsables de l anémie hémolytique mécanique, de la thrombopénie de consommation et des signes d ischémie viscérale qui caractérisent le PTT. VWF, a été découverte, que la physiopathologie du PTT a pu être élucidée [36, 61] : en effet, chez les patients atteints de PTT, il existe dans 90 % des cas un déficit fonctionnel sévère (activité inférieure à 10 %) d ADAMTS13 qui entraîne l accumulation anormale dans le plasma de multimères de très haut poids moléculaire du VWF. Ce VWF hyperadhésif est responsable de la formation spontanée de thrombi plaquettaires qui vont obstruer la microcirculation sanguine et provoquer la poussée de PTT (Fig. 3). Le déficit sévère en ADAMTS13 est le plus souvent acquis par le biais d auto-ac anti-adamts13 (PTT acquis auto-immun représentant neuf cas de PTT déficitaires en ADAMTS13 sur dix), mais il peut être aussi héréditaire de transmission autosomique récessive (un cas de PTT déficitaire en ADAMTS13 sur dix) par le biais de mutations bialléliques du gène d ADAMTS13 (maladie orpheline appelée syndrome d Upshaw-Schulman) (Fig. 4) [1, 8, 66, 82, 84]. Dans 10 % des PTT, ADAMTS13 n est pas déficitaire et la maladie relève alors d une autre physiopathologie [82, 84]. Indications et interprétation de l exploration biologique d ADAMTS13 dans le PTT Devant une poussée de MAT, les indications et l interprétation de l exploration biologique d ADAMTS13 sont identiques chez l adulte et chez l enfant (le PTT de l adulte est un PTT acquis auto-immun dans plus de 90 % des cas, la forme héréditaire de révélation tardive étant très rare ; le PTT de l enfant et de l adolescent peut être soit une forme héréditaire soit une forme acquise avec une fréquence moyenne équivalente mais néanmoins extrêmement variable en fonction de la tranche d âge). Ces indications sont les suivantes. Au diagnostic, devant toute MAT en poussée Une hiérarchie dans l ordre des tests ADAMTS13 à réaliser devant une suspicion clinique de MAT au diagnostic doit être impérativement respectée (Fig. 5) [82, 84, 88] : en première intention, mesure de l activité d ADAMTS13 ; en seconde intention, et uniquement si l activité d ADAMTS13 est inférieure à 10 %, recherche d autoanticorps anti-adamts13 par titrage Biologie médicale des IgG et recherche d AIC. En cas de positivité des IgG et/ou de l AIC, l hypothèse d un PTT acquis auto-immun est hautement probable. En cas de négativité des IgG et de l AIC, l hypothèse d un PTT acquis auto-immun ne peut être totalement écartée (autoanticorps de nature non IgG, inhibiteur de nature non Ig, opsonisation de tous les autoanticorps sur ADAMTS13 et clairance des complexes immuns formés, etc.) mais l hypothèse d un PTT héréditaire par mutations du gène d ADAMTS13 (syndrome d Upshaw-Schulman) doit être envisagée. En raison de la complexité du séquençage du gène d ADAMTS13 (absence de hotspot de mutations [Fig. 4] imposant un séquençage systématique de la totalité des 29 exons du gène et de toutes les jonctions exons-introns), l exploration génétique d ADAMTS13 n est réalisée que si l activité d ADAMTS13 (en l absence d autoanticorps détectable) persiste inférieure à 10 % en rémission clinique en l absence d autoanticorps détectable (cf. infra). Après obtention de la rémission clinique et hématologique L ascension de l activité d ADAMTS13 à un taux supérieur à 10 % témoigne d un déficit acquis et la normalisation du taux (valeur supérieure à 50 %) serait un facteur de bon pronostic puisqu elle est associée à un risque de rechute inférieur à 5% la première année [64, 82, 85]. Au contraire, la persistance d une activité d ADAMTS13 inférieure à 10 % en rémission clinique et hématologique : si elle est associée à des autoanticorps anti-adamts13 détectables, signe un PTT acquis et constituerait un facteur prédictif de rechute [64] ; si elle n est pas associée à des autoanticorps anti-adamts13 détectables, doit faire évoquer un PTT héréditaire et motiver une étude génétique d ADAMTS13. Dans ce dernier cas, le diagnostic de PTT acquis (sans autoanticorps détectable) est également possible. Cas particuliers En cas de déficit acquis persistant en rémission, les patients peuvent recevoir des perfusions prophylactiques d immuno- 7

8 A ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand Figure 4. Mutations du gène d ADAMTS13 dans le syndrome d Upshaw-Schulman (forme héréditaire du purpura thrombotique thrombocytopénique). Une centaine de mutations du gène d ADAMTS13 ont été décrites dans le syndrome d Upshaw-Schulman. Ces mutations sont localisées sur toute la longueur du gène (absence de hotspot) et conduisent principalement à des substitutions d acides aminés ou à des codons stop (indiqués sur la partie supérieure de la figure). Elles consistent plus rarement en des délétions, insertions ou des mutations de sites d épissage (indiquées sur la partie inférieure de la figure). En bleu, mutations de novo. * mutations exprimées dans des recombinants. TSP : thrombospondine. Points essentiels ADAMTS13 est la métalloprotéase spécifique de clivage du VWF. Elle a été purifiée à partir du plasma humain en 1996 et son gène a été cloné en L exploration biologique d ADAMTS13 comprend : la mesure de son activité et de son taux antigénique, la recherche d autoanticorps anti-adamts13 (titrage d IgG anti-adamts13 et recherche d AIC) dans le plasma et le séquençage de son gène. Ces tests relèvent d une biologie hyperspécialisée réservée à des laboratoires experts. Le déficit fonctionnel sévère (activité plasmatique inférieure à 10 %) en ADAMTS13 est responsable d une forme particulière de MAT appelée PTT. Le PTT est défini par une anémie hémolytique mécanique et une thrombopénie de consommation parfois associées à des signes d ischémie multiviscérale. Le PTT est une maladie rare due dans plus de 90 % des cas à des autoanticorps anti-adamts13 (PTT acquis auto-immun) et dans moins de 10 % des cas à des mutations bialléliques du gène d ADAMTS13 (maladie orpheline appelée syndrome d Upshaw- Schulman). Il existe en France un Centre national de référence des MAT de l adulte et de l enfant (CNR-MAT) (année de labellisation 2006 du Plan national maladies rares). suppresseurs. Dans ce cas, la surveillance de l activité d ADAMTS13 et du titre des IgG anti-adamts13 peut être réalisée tous les 3 mois pendant une durée indéterminée. Chez tout patient ayant un antécédent de PTT, une étude supplémentaire d ADAMTS13 est prescrite dans les cas suivants : suspicion clinicobiologique de rechute, projet de grossesse ou découverte d une grossesse en cours, chirurgie. Conclusion et perspectives Depuis les années 2000, le développement des méthodes de mesure de l activité d ADAMTS13 a permis de comprendre la physiopathologie du PTT, de saisir pourquoi la plasmathérapie est efficace dans le traitement des poussées de PTT (les concentrés plasmatiques contiennent de l ADAMTS13 active), et 8 Biologie médicale

9 ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand A Figure 5. Arbre décisionnel. Exploration biologique d ADAMTS13 devant une suspicion de purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT). Devant une suspicion clinique de PTT en poussée, la mesure de l activité d ADAMTS13 est réalisée en première intention. En seconde intention, et uniquement si l activité d ADAMTS13 est inférieure à 10 %, une recherche d autoanticorps (auto-ac) anti-adamts13 est justifiée : titrage des immunoglobulines G (IgG) anti-adamts13 et recherche d une activité inhibitrice circulante (AIC). En cas de positivité des IgG et/ou de l AIC, le diagnostic de PTT acquis est retenu. En cas de négativité des IgG et de l AIC, l activité d ADAMTS13 doit être mesurée en rémission. En rémission, si l activité d ADAMTS13 est devenue détectable, le diagnostic de PTT acquis est retenu. Si, au contraire, elle est toujours effondrée, une recherche d auto-ac anti-adamts13 doit être à nouveau réalisée avant de prescrire une étude génétique d ADAMTS13 : en effet, dans certains cas, les auto-ac anti-adamts13 deviennent détectables (alors qu ils ne l étaient pas lors de la poussée initiale) et le diagnostic de PTT acquis est alors hautement probable ; dans le cas contraire, le séquençage du gène d ADAMTS13 est alors justifié. Si des mutations bialléliques sont retrouvées, le diagnostic de PTT héréditaire (syndrome d Upshaw-Schulman) est retenu. Dans l hypothèse où aucune mutation du gène d ADAMTS13 ne serait retrouvée, il est très difficile de faire le diagnostic différentiel entre un PTT acquis relevant d un mécanisme autre qu un auto-ac non IgG/non neutralisant et un PTT héréditaire lié par exemple à des mutations du promoteur du gène d ADAMTS13, ou encore à des mutations d un gène modulateur de l activité d ADAMTS13 non identifié à ce jour. d apporter le premier test biologique sensible et spécifique permettant de confirmer le diagnostic de poussée de PTT, diagnostic jusqu à présent porté uniquement sur des arguments clinicobiologiques non spécifiques. En 2010, l exploration biologique d ADAMTS13 relève du domaine de la biologie hyperspécialisée et elle permet une confirmation rétrospective du diagnostic de PTT : en effet, aucune méthode n est à ce jour adaptée à l urgence et cette exploration reste réservée à des équipes de biologie expertes compte tenu, d une part de sa spécificité technique et, d autre part, d une fréquente complexité d interprétation des résultats. En France, le Plan national maladies rares a permis de labelliser Biologie médicale en 2006 Centre national de référence des microangiopathies thrombotiques de l adulte et de l enfant (CNR-MAT) un réseau de cliniciens et de biologistes qui s intéressent aux MAT depuis 1998 (coordonnateurs Pr Coppo, Pr Veyradier). Une des missions du CNR-MAT est d optimiser la prestation nationale centralisée d exploration biologique d ADAMTS13 développée depuis 1999 en encadrant d autres laboratoires qui seraient reconnus experts à une échelle régionale au sein des centres de compétences du CNR-MAT. Parallèlement, des partenariats solides avec la recherche fondamentale et l industrie devraient permettre de développer une technologie dédiée à une mesure de l activité d ADAMTS13 mieux adaptée à l urgence. 9

10 A ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur von Willebrand Cet article a fait l objet d une prépublication en ligne : l année du copyright peut donc être antérieure à celle de la mise à jour à laquelle il est intégré. Références [1] Sadler JE. Von Willebrand factor, ADAMTS13 and thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood 2008;112:11-8. [2] Furlan M, Robles R, Lämmle B. Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood 1996;87: [3] Tsaï HM. Physiologic cleavage of von Willebrand factor by a plasma protease is dependent on its conformation and requires calcium ion. Blood 1996;87: [4] Furlan M, Robles R, Morselli B, Sandoz P, Lämmle B. Recovery and half-life of von Willebrand factor-cleaving protease after plasma therapy in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Haemost 1999;81:8-13. [5] Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. 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