Dako GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe for In Situ Hybridization pour hybridation in situ zur In situ Hybridisierung. English Code Y1443

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1 Dako GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe for In Situ Hybridization pour hybridation in situ zur In situ Hybridisierung English Code Y1443 Intended use For In Vitro Diagnostic Use. GenPoint HPV Biotinylated DNA probe is intended for use in in situ hybridization staining procedure using Dako GenPoint Detection System (code K0620) for the detection of human papillomavirus (HPV). Summary and explanation HPV has been found in epithelial cells of several different organs, including skin and genital tract. 1 HPV is found in the nucleus and can be of either episomal (free viruses) or integrated form. 2 Reagent provided GenPoint HPV Probe contains HPV genomic clones in the form of double-stranded fragments of 500 base pairs or less (biotinylated* and unlabeled), and multiple biotinylated oligonucleotides from 25 to 40 bases in length. The probe is ready-to-use and is provided in 1.0 ml of in situ hybridization solution (0.3 mol/l NaCl, 50% formamide in buffer). The probe is optimized with the GenPoint Detection System (code K0620). *U.S. Patent 4,599,303 sub-licensed from Schleicher & Schuell, Inc. Materials required, but not supplied Refer to the GenPoint detection system instructions. Specificity GenPoint HPV Biotinylated DNA probe has been found to react with HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, and 68 on formalin-fixed paraffin embedded cervical tissues and/or cells by in situ hybridization. Precautions 1. For professional users. 2. Minimize microbial contamination of reagents or increase in nonspecific staining may occur. 3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 4. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the proper procedure, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. 5. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 6. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations. 7. Safety Data Sheet available for professional users on request. Risk and Safety statements GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe: 30-60% Formamide / Hazard Symbol: Toxic R61 May cause harm to the unborn child. S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the label where possible). S53 Avoid exposure - obtain special instructions before use S60 This material and/or its container must be disposed of as hazardous waste. Restricted to professional users. Storage Store at 2 8 C. Specimen preparation Paraffin Sections GenPoint HPV Biotinylated DNA probe can be used on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. For greater adherence of tissue sections to glass slides, the use of Silanized Slides (code S3003) is recommended. The deparaffinized tissue sections require pretreatment to provide the probe access to target nucleic acid sequences. This can be achieved with an incubation of the tissue sections in 0.8% Pepsin (code S3002, dissolve packet in 250 ml 0.2N Hydrochloric acid) at 37 C for 5 10 minutes. Following digestion, sections are rinsed in several changes of deionized water, then immersed in 0.3% H 2O 2 in methanol for 20 minutes, and rinsed with several changes of deionized water. ( ) EFG_002p. 1/5

2 Cytology samples GenPoint HPV Biotinylated DNA probe can also be used on cytology samples. Slides are soaked in 50% alcohol for 30 minutes followed by post-fixation in 10% Neutral Buffer Formalin for 30 minutes. Slides are then rinsed in several changes of deionized water and incubated with Proteolytic Enzyme (code S3007) at room temperature for 3 minutes. Following digestion, sections are rinsed in several changes of deionized water, then immersed in 0.3% H 2O 2 in methanol for 5 minutes, and rinsed with several changes of deionized water. Staining procedure After sample preparation, slides are allowed to air dry briefly and a drop of the GenPoint HPV Biotinylated DNA probe is added and a coverslip is applied. The probe and the target DNA are denatured by placing the slides on a flat heating block surface at 92 C for 5 minutes. Following denaturation, the slides are transferred to a pre-warmed humid chamber for hybridization at 37 C for 16 to 18 hours. Following hybridization, coverslips are removed by immersing the slides in room temperature 1X TBST (code S3306 for 10X TBST). Slides are then bathed in a fresh TBST bath before proceeding to stringent wash. Dilute GenPoint Detection System stringent wash per K0620 instructions and perform the stringent wash step at 48 C for 30 minutes followed by rinsing the slide s in three fresh changes of 1X TBST. Detection of hybridized probe is then performed using the GenPoint Detection System (code K0620) according to the kit instructions, using a 1:100 dilution of Primary Streptavidin-HRP for 30 minutes. Staining pattern Brown DAB staining in the nuclei indicates the detection of HPV. Limitations Different fixation time and fixation reagents can impact signal intensity and also background staining. Pre-treatment for different samples should be optimized in the testing laboratories. Français Réf. Y1443 Utilisation prévue Pour utilisation diagnostique in vitro. La GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe est conçue pour être utilisée lors de procédures de coloration par hybridation in situ en utilisant le Dako GenPoint Detection System (réf. K0620) pour la détection du papillomavirus humain (HPV). Résumé et explication Le HPV a été détecté dans les cellules épithéliales de différents organes, notamment la peau et les organes génitaux. 1 Le HPV se situe dans le noyau des cellules et peut adopter une forme épisomique (virus libres) ou intégrée. 2 Réactifs fournis La GenPoint HPV Probe contient des clones génomiques du HPV sous forme de fragments à double brin contenant 500 paires de base au maximum (biotinylées* et non marquées), et d oligonucléotides biotinylés multiples de 25 à 40 bases de long. La sonde est prête à l emploi et fournie sous forme de solution d hybridation in situ de 1,0 ml (NaCI à 0,3 mol/l, formamide à 50 % dans un tampon). La sonde est optimisée pour une utilisation avec le GenPoint Detection System (réf. K0620). *Brevet américain n 4,599,303 d après une sous lice nce de Schleicher & Schuell, Inc. Matériels requis mais non fournis Se référer aux instructions du système de détection GenPoint. Spécificité On a observé que la GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe réagit aux types de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 et 68 sur des tissus et/ou cellules prélevés sur le col de l utérus, fixés au formol et inclus en paraffine par hybridation in situ. Précautions 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Réduire toute contamination microbienne des réactifs faute de quoi une augmentation non spécifique de la coloration peut se produire. 3. Comme avec tout produit d origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées. 4. En règle générale, il n est pas permis aux personnes âgées de moins de 18 ans de manipuler ce produit. Les utilisateurs doivent être informés sur les bonnes procédures, les propriétés dangereuses du produit et les instructions de sécurité nécessaires. 5. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau 6. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales. 7. La Fiche technique de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande. Déclarations de risque et sécurité GenPoint Sonde ADN biotinylée HPV : Formamide à % / Symbole de danger : Toxique R61 Risque pendant la grossesse d effets néfastes pour l enfant. S45 En cas d'accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin (si possible, lui montrer l'étiquette). S53 Éviter l exposition se procurer des instructions spéciales avant l utilisation. S60 Jeter ce produit et/ou son récipient comme des déchets dangereux. Reservé aux utilisateurs professionnels. ( ) EFG_002p. 2/5

3 Conservation Conserver entre 2 et 8 C. Préparation des échantillons Coupes en paraffine La GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe peut être utilisée sur des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Pour une meilleure adhérence des coupes de tissus sur les lames de verre, il est recommandé d utiliser des Silanized Slides (réf. S3003). Les coupes de tissus déparaffinées nécessitent un traitement préalable pour permettre à la sonde d accéder aux séquences cibles d acide nucléique. Pour ce faire, incuber les coupes de tissus dans du Pepsin à 0,8 % (réf. S3002, dissoudre le paquet dans 250 ml d acide chlorhydrique à 0,2 N) à 37 C pendant 5 à 10 minut es. Après digestion, rincer les coupes dans plusieurs bains d eau déionisée renouvelée, puis les immerger dans du peroxyde d hydrogène (H 2O 2) à 0,3 % et dans du méthanol pendant 20 minutes ; enfin, rincer dans plusieurs bains d eau déionisée renouvelée. Échantillons cytologiques La GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe peut aussi être utilisée sur des échantillons cytologiques. Les lames sont trempées dans de l alcool à 50 % pendant 30 minutes, avant post-fixation dans un tampon neutre de formol à 10 % pendant 30 minutes. Les lames sont ensuite rincées dans plusieurs bains d eau déionisée renouvelée et incubées avec du Proteolytic Enzyme (réf. S3007) à température ambiante pendant 3 minutes. Après digestion, rincer les coupes dans plusieurs bains d eau déionisée renouvelée, puis les immerger dans du peroxyde d hydrogène (H 2O 2) à 0,3 % et dans du méthanol pendant 5 minutes ; enfin, rincer dans plusieurs bains d eau déionisée renouvelée. Procédure de coloration Après la préparation des échantillons, laisser sécher brièvement les lames à l'air libre et ajouter une goutte de GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe ; appliquer une lamelle de protection. La sonde et l'adn cible sont dénaturés en plaçant les lames à plat sur un bloc de chauffage à 92 C pendant 5 minutes. Après dénatura tion, transférer les lames dans une chambre humide préchauffée pour hybridation à 37 C pendant 16 à 18 heures. Après hybridation, e nlever les lamelles de protection par immersion des lames dans du 1x TBST (réf. S3306 pour le 10x TBST) à température ambiante. Immerger ensuite les lames dans un nouveau bain de TBST avant de procéder à un lavage stringent. Diluer le lavage stringent du GenPoint Detection System conformément aux instructions K0620 et réaliser le lavage stringent à 48 C pendant 30 minutes, puis rincer les lames dan s trois bains différents de 1x TBST. La détection de la sonde hybridée est ensuite effectuée avec le GenPoint Detection System (réf. K0620), conformément aux instructions du kit, en utilisant une dilution à 1:100 de streptavidine-peroxydase de raifort primaire pendant 30 minutes. Schéma de coloration Une coloration nucléaire marron du DAB indique la détection du HPV. Limites Une durée et des réactifs de fixation différents peuvent influer sur l intensité du signal ainsi que sur la coloration de fond. Le prétraitement des différents échantillons doit être optimisé dans chaque laboratoire. Deutsch Code Y1443 Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. Die GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe wird bei In-situ-Hybridisierungs-Färbeverfahren mit dem Dako GenPoint Detection System (Code K0620) zum Nachweis das humanen Papillomavirus (HPV) verwendet. Zusammenfassung und Erklärung HPV ist in den Epithelzellen verschiedener Organe nachgewiesen worden, darunter in der Haut und im Genitaltrakt. 1 HPV liegt im Zellkern entweder in episomaler (freie Viren) oder integrierter Form vor. 2 Mitgelieferte Reagenzien GenPoint HPV Probe enthält genomische HPV-Klone in Form doppelsträngiger Fragmente von höchstens 500 Basenpaaren (biotinyliert* und unmarkiert) sowie multiple biotinylierte Oligonukleotide in einer Länge von 25 bis 40 Basen. Die Sonde wird gebrauchsfertig in 1,0 ml In-situ-Hybridisierungslösung geliefert (0,3 mol/l NaCl, 50 % Formamid in Puffer). Die Sonde ist zur Verwendung mit dem GenPoint Detection System (Code K0620) optimiert. *US-Patentnr. 4,599,303 mit Unterlizenz von Schleicher & Schuell, Inc. Erforderliches, aber nicht mitgeliefertes Material Anweisungen des GenPoint Detektionssystems beachten. Spezifität Die GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe reagiert nachweislich mit den HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 auf formalinfixierten, paraffineingebetteten zervikalen Geweben und/oder Zellen durch In-situ-Hybridisierung. Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur für Fachpersonal bestimmt. 2. Jegliche mikrobielle Verunreinigung der Reagenzien vermeiden, da diese zu unspezifischen Färbungen führen. ( ) EFG_002p. 3/5

4 3. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs muss auch dieses entsprechend gehandhabt werden. 4. Personen unter 18 Jahren dürfen mit diesem Produkt grundsätzlich nicht arbeiten. Alle Anwender müssen sorgfältig in das richtige Arbeitsverfahren, die gefährlichen Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen eingewiesen werden. 5. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 6. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen. 7. Auf Anfrage ist für Fachpersonal ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich. Risiko- und Sicherheitsangaben GenPoint HPV-Biotinylated DNA Probe: % Formamid / Gefahrensymbol: Giftig R61 Kann zu Schäden beim ungeborenen Kind führen. S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). S53 Exposition vermeiden vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. S60 Dieser Stoff und/oder sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. Nur für Fachpersonal bestimmt. Aufbewahrung Bei 2 8 C aufbewahren. Vorbereitung der Probe Paraffinschnitte Die GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe kann auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten verwendet werden. Zur besseren Haftung der Gewebeschnitte an den Glasobjektträger wird die Verwendung von Silanized Slides (Code S3003) empfohlen. Entparaffinierte Gewebeschnitte müssen vorbehandelt werden, damit die Sonde zu den Ziel-Nukleinsäuresequenzen gelangen kann. Diese Vorbehandlung kann in einer fünf- bis zehnminütigen Inkubation der Gewebeschnitte bei 37 C in 0,8 %ig em Pepsin (Code S3002, Packung in 250 ml 0,2 N Salzsäure auflösen) bestehen. Im Anschluss an die Andauung die Schnitte mehrmals mit frischem entionisiertem Wasser spülen, dann 20 Minuten in 0,3 %iges H 2O 2 in Methanol einlegen und anschließend wieder mehrmals mit frischem entionisiertem Wasser spülen. Zytologieproben Die GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe kann auch auf Zytologieproben verwendet werden. Hierzu werden die Objektträger 30 Minuten in 50 %igen Alkohol eingeweicht und anschließend 30 Minuten in 10 %igem neutralem gepufferten Formalin fixiert. Die Objektträger anschließend mehrmals mit frischem entionisiertem Wasser spülen und 3 Minuten bei Raumtemperatur mit Proteolytic Enzyme (Code S3007) inkubieren. Im Anschluss an die Andauung die Schnitte mehrmals mit frischem entionisiertem Wasser spülen, dann 5 Minuten in 0,3 %iges H 2O 2 in Methanol einlegen und anschließend wieder mehrmals mit frischem entionisiertem Wasser spülen. Färbeverfahren Nach der Vorbereitung der Probe die Objektträger kurz an der Luft trocknen lassen, einen Tropfen der GenPoint HPV Biotinylated DNA Probe zusetzen und mit einem Deckglas abdecken. Zur Denaturierung der Sonde und der Ziel-DNA die Objektträger für fünf Minuten auf die Oberfläche eines flachen, 92 C warmen Heizblocks s tellen. Die Objektträger nach der Denaturierung in eine vorgewärmte Feuchtigkeitskammer für die Hybridisierung stellen und darin 16 bis 18 Stunden bei 37 C belassen. Na ch der Hybridisierung die Deckgläser durch Eintauchen der Objektträger in zimmerwarmes 1x TBST (Code-Nr. S3306 für 10x TBST) entfernen. Vor dem Stringenz- Waschschritt die Objektträger dann in ein frisches TBST-Bad legen. GenPoint Detection System Stringenz-Waschlösung gemäß K0620- Anweisungen verdünnen und Stringenz-Waschschritt bei 48 C für die Dauer von 30 Minuten durchführen un d dann die Objektträger dreimal in frischem 1x TBST spülen. Der Nachweis der hybridisierten Sonde erfolgt dann gemäß den Anweisungen des Kits mit dem GenPoint Detection System (Code-Nr. K0620) unter Verwendung einer 1:100-Verdünnung von Primary Streptavidin-HRP für die Dauer von 30 Minuten. Färbungsmuster Eine braune DAB-Färbung in den Zellkernen zeigt den Nachweis von HPV an. Beschränkungen Unterschiede in der Fixierdauer und abweichende Fixierreagenzien können sich auf die Intensität des Signals und die Hintergrundfärbung auswirken. Die Vorbehandlung für unterschiedliche Proben sollte in den jeweiligen Testlabors optimiert werden. References Bibliographie Literaturangaben 1. Viral Carcinogenesis. Mendelsohn J (eds.). The Molecular Basis of Cancer. W.B. Saunders Company. 2001:Chapter 5 2. Evans MF, et al. Biotinyl-tyramide-based in situ hybridization signal patterns distinguish human papilloma virus type and grade of cervical intraepithelial neoplasia. Mod Pathol 2002; 15(12):1339 ( ) EFG_002p. 4/5

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