leurs produits respectifs, et production d'anticorps spécinques. Mémoire présenté Département de biochimie Université Laval

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1 Philippe Garneau Étude de la régulation de l'expression des gènes cyse et cyss de Batcillus subtitis : Surproduction et puriffcation de leurs produits respectifs, et production d'anticorps spécinques. Mémoire présenté a la Faculté des études supérieures de l'université Laval pour l'obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.) Département de biochimie Faculté des sciences et de génie Université Laval O Philippe Garneau, 1999.

2 National Library 1*1 of Canada Acquisitions and Bibliographie Services Bibliothèque nationale du Canada Acquisitions et services bibliographiques 395 Wellington Street 395. rue Wellington Ottawa ON KI A ON4 OttawaON K1A ON4 Canada Canada Your Me Votre reterenœ Our fi* Notre reference The author has granted a nonexclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, han, distribute or seu copies of this thesis in microform, paper or electronic formats. The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission. L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant a la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/nlm, de reproduction sur papier ou sur format électronique. L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.

3 Résumé Les gènes cyse et cyss de Bacülus subtüis sont cotranscrits et sont régulés par un même mécanisme d'antitemiinaison de la transcription contrôlé par le niveau d'arntcvs. Les rôles divergents des produits de ces deux gènes (respectivement la sérine acétyltrarisférase (SAT) et la cystsny1-arnt synthétase (CysRS)) par rapport à la L-cystéine soulèvent la possibilité d'un second mécanisme de régulation de leur expression. En effet. la SAT contribue à former de la Gcystéine alors que la CysRS l'utilise lors d'une étape cruciale de la biosynthèse des protéines. C'exploration de l'existence d'un second mécanisme constitue l'objectif de ce projet de maîmse. Dans le cadre de ce projet. la SAT et la CysRS ont été surproduites et purifiées, pour permettre la production d'anticorps spécifiques. Ces derniers ont été obtenus. et ont permis de mesurer le niveau -intraceuulaire de la CysRS dans des échantillons de B. subtilis cultivé en rniueu minimal-glucose avec différentes sources de soufke; des variations de ces niveaux d a n t jusqu'à 3 fois ont été obsenrées selon la nature de la source de soufre. La SAT n'a pu être détectée dans ces échantillons de B. subtil&. en raison de la faible spécificité des anticorps obtenus lors de l'immunisation contre un variant synthétique de celle-ci, qui possède une queue d'histidines à son extrémité N-terminaie.

4 Tout d'abord, je tiens à remercier le Dr. Jacques Lapointe. pour sa patience lors de la correction préliminaire de ce mémoire et ses 0 encouragements durarit les longues périodes creuses qui ont parsemé ce projet de maîtrise. Je tiens également à remercier pour leurs conseils et leur opinions les membres de mon comité aviseur, les Dr. Michel Frenette. Serge Laberge et aussi M. MartLn Pelchat. qui sera lui aussi bientôt Docteur. J'aimerais remercier pour leur soutien, leurs conseils et de nombreux petits et grands senrices, les membres du laboratoire de biosynthèse des protéines que j'ai côtoyé lors de mon séjour : le Dr. Yves Gagnon, le Dr. Nathalie Champagne, Daniel Dubois, Éric Madore, Joëe Gauthier, Pierre-Marie Akochy. le Dr. Marie-Hélène Mazauric, et Louis- Patrick Gagnon. Des remerciements encore plus chaleureux pour le Dr. Lucille Lacoste et Mme Yang, également de ce laboratoire. pour leur aide essentielle à l'aboutissement de ce projet. J'aimerais aussi remercier Josée Lamoureux du laboratoire du Dr. André Darveau, ainsi que le Dr. Darveau lui-même, pour l'aide qu'ils ont apporté lors de mes Westerns. Je souhaite également remercier mes amis, Alain Labbé et Christian Blouin, qui malgré l'éloignement de leurs lieux d'études de doctorat respectif& ont su me prodiguer de nombreux conseils et encouragements. et ont su parfois comment me faire voir mes problèmes d'une perspective plus heureuse. En dernier lieu, je souhaite exprimer ma plus complète gratitude envers ma famiue, qui m'a supporté tout au long de ce projet de maîtrise.

5 Table des Matitres. Résumé: Avant-Propos: Remerciements Table des matières: Liste des Tableaux et Figures Abréviations utilisées: Chapitre 1 : Introduction: 1 1.1) Aminoacyl-ARNt synthétases chez les procaxyotes ) rôle et importance des aars chez les organismes vivants ) nécessité d'une régulation de l'expression des gènes codants pour des aars ) Régulation de i'expression des gènes des aars chez les procaryotes ) Régulation de l'expression des gènes procaryotes en général ) au niveau transcriptionne ) au niveau traductionnel ) dégradation des ARNm 1.2.2) Mécanismes de régulation de l'expression de certaines aars chez Escherichia coli ) Mécanismes de régulation de i'expression des aminoacyl-arnt synthétases chez B. subtüis ) Généralités ) L'antiterminaison de la transcription 1.3) Description de l'opéron gitx-cyse-cyss de BacilLus subtüis ) Position, arrangement et transcription des gènes. 11

6 1.3.2) Régulation de l'expression de cyse et cyss par l'antiterminaison de la transcription ) Particuliarités des transcrits. 1.4) Biosynthèse et utilisation de la cystéine chez les procaryotes ) Le sentier de biosynthèse de la cystéine chez E. coli ) Description de l'ensemble de la voie de biosynthèse ) La cystéine synthétase ) Le régulon cystéine ) La séruie acétyltransférase ) Biosynthèse de la cystéine chez Bacillus subtilis et les autres bactéries Gram-positives ) La cystéine comme précurseur d'autres composés. 1.5) Problématique. 1.6) Objectifs du projet. Chapitre 2 : Matériel et Méthodes. 2.1) Matériel utilisé ) Souches bactériennes et plasmides ) Enzymes, oligonucléotides et réactifs divers ) Milieux de culture utilisés. 2.2) Méthodologie ) Conditions de culture ) Préparation et traitement des extraits celiulaires ) Techniques de génétique moléculaire ) Dosages des protéines.

7 2.2.5) Techniques d'électrophorèse ) Méthodes de dosage enzymatique ) Méthode de dosage de l'activité CysRS ) Méthode de dosage de l'activité SAT ) Chromatographies ) Utiüsées lors de la purifkation de la QsRS ) Chromatographie d'échange d'anions ) Chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite ) Uülïsées lors de la purification de l'hissat ) Techniques immunologiques ) Protocole d'immunisation des lapins ) Méthode de dosage des niveaux intracellulaires des protéines par immunodétection ) Conditions de protéolyse de l'hissat. Chapitre 3 : Résultats et Discussion ) Surproduction et purification de la CysRS de B. subfilis et préparation d'anticorps contre cette enzyme ) Transfomation de la souche E. coli DH5a avec le plasmide pyg ) Surproduction de la CysRS de B. subtilis chez E, coli DH5a ) Purification de la CysRS ) Partition dans un système à 2 phases ) Chromatographie d'échange d'anions ) Chromatographie sur colo~e d'hydroxyapatite ) Electrophorèse préparative de la QsRS ) Obtention d'anticorps de lapin contre la CysRS de B. sublilis.

8 vii ) Immunisation de lapins avec la CysRS purifiée. 3.1 A.2) Tests de la spécificité et de la sensibilité des sérums anti-cysrs. 3.2) Niveaux intracellulaires de la CysRS chez B. subtiüç 1Al. 3.3) Clonage du gène cyse de B. subtüls. surproduction et puriacation de 1'HisSAT, et préparation d'anticorps ) Construction du vecteur d'expression pet16bcyse ) Surproduction et purification de I'HisSAT ) Surproduction de I'HlsSAT ) Chromatographie d'affinité ) Chromatographie d'échanges d'anions à haute vitesse ) Coupure de la queue de la polyhistidine de I'HisSAT ) Electrophorèse préparative de I'HisSAT ) Obtention d'anticorps de lapin contre I'HisSAT de B. subtizis ) Immunisation de lapins avec 1'HisSAT purifiée ) Tests de la sensibilité et de la spécificité des sérums anti-hissat. Chapitre 4 : Conclusion générale. 4.1) Survol des résultats obtenus. 4.2) Perspectives.

9 Liste des Tableaux et des Figures. Titre : Fiwe 1 : Structures secondaires de la région a leader. de l'arn messager codant pour le gène thrs de Bacillus subtilis selon le niveau intraceuulaire de thréonyl-mtthr. F i ~ 2 e : Carte physique des gènes gluz, cyse. et cyss de Bucillus subtüh. Figure 3 : Mécanisme d'antiterminaison de la transcription de l'opéron gltx-cyse-cyss. Figure 4 : Alignement des séquences de type Shine-Dalgarno des gènes cyse et cyss avec la partie homologue de l'extrémité 3' de I'ARNr 16s de Bacillus subtilis. m e 5 : Chevauchement des gènes cyse et cyss de Bacillus subtüis. Figure 6 : Sentier de biosynthèse de la cystéine et mécanismes régulateurs le contrôlant. F i ~ 7 e : Représentation schématique des fonctions de la sérine acétyltransférase (SA3 et de la cystéïnyl-arnt synthétase (CysRS)dans la biosynthèse de la Gcystéine.

10 Tableau 1 : Description des souches bactériennes employées dans le cadre de ce projet de maîtrise. Tableau 2 : Séquences des oligonucléoti~esynthétisés dans le cadre de ce projet de maîtrise. Figure 8 : Surproduction de la CysRS de B. subtilis dans E. coli DH5a(pYG209) après induction de la transcription de cyss avec de I'IPTG. Figure 9 : Résultats de la chromatographie d'échange d'anions Q-Sepharose lors de la purification de la CysRS. Fimire 10 : Chromatographie de la CysRS sur colonne d'hydroxyapatite. Tableau 3 : Purification de la cystéinyl-arnt synthétase de B. subtil& surproduite à partir de 10.5 g (poids humide) de cellules de E. coli DH5a(pYG209), suite à l'induction à l'iptg 1 m. Figure 11 : Analyse par SDS-PAGE de fiactions provenant de plusieurs des étapes de purification de la QsRS. Fime 12 : Imrnunoempreinte a Western r de la CysRS de Baciüus subtilis 1Al obtenue de cultures en &eux minimaux Mg-glucose en présence ou non de divers acides minés.

11 Figure 13 : Quantification des niveaux intracellulaires de CysRS chez BacüZus subtilis cultivé en milieu minimal Mg + glucose 1%. Figure 14 : Courbes de croissance de B. subtitis 1A1 en milieu minimal M9+ glucose 1% supplémenté de certains acides aminés. F i ~ 15 e : Représentation schématique de la mutagenèse par PCR et du sous-clonage du gène cyse dans le vecteur de surexpression pet16b. Figure 16 : Surproduction de i'hissat dans E. coli BL2 1 (DE3)pLysS/pETlGb cyse. Fime 17 : Chromatographie d'affinité de I'HisSAT sur une colonne de résine HisBind (NoMgen). Firnire 18 : Résultats de la chromatographie haute vitesse de lwssat sur un échangeur d'anions de type POROS. Fime 19 : Essais de cïivage de la queue d'histidines de I'HisSAT par le facteur Xa. Fime 20 : Tests de I'immunodétection de la SAT de B. subtil& par des sérums anti-hissat.

12 Liste des Abréviations OC : aars : ADN : ARN : ARNm : A m : Asn : Asp : BSA : Cys : CysRS : d m : m: DTNB : DTT : EDTA : Fmt : Gh : Glu : HEPES : His : HisSAT : degré Celsius aminoacyl-arnt synthétase acide désoxyribonucléique acide ribonucléique ARN messager ARN de transfert asparagine acide aspartique albumine sérique bovine cystéine cystéinyl-arnt synthétase didésoxyribonucléotides mélange équimolaire de quatre désoqribonucléotides : ATP, CTP, 'ITP et GTP. 5.5'-dithionitro (acide benzoïque) dithiothréitol éthylènediamine tétraacétate N-formyl-méthionine met) glutamine acide glutamique N-12-hvdroxvethvl~i~erazine-N'l2-ethaneslhoc acidl histidine Sérine acétyltransférase avec 10 histidines et un site de reconnaissance du facteur X à à l'extrémité N-terminale. Immunoglobuline isoleucine isopropyl-p-d-thiogalactopyranoside Luria-Bertani

13 xii Leu : Lys : PCR : PMSF : SAT : SDS : SDS-PAGE : Ser : Stp : Thr: Tm : leucine lysine polymerase cimût reaction phénylméthyisulphonylfiuorure sérine acétyltransférase sodium dodécyl sulphate sodium dodecyl sulphate polyacry lamide gel electrophoresis serine arrêt de la traduction. thréonine température de fusion (pour un ADN bicaténaire. c'est la température à laquelle il y a bris de 50% des ponts hydrogènes). tryptophane

14 Chapitre 1 Introduction 1.1 Les aminoac~l-arnt smthétases chez les ~rocaryotes. 1,Ll Rôle et importance des amhoacyl-arnt svnthétases. Les arninoacyl-arnt synthétases (aars) sont des enzymes ubiquitaires essentielles au fonctionnement de la biosynthèse des protéines. Elles catalysent la réaction d'activation d'un acide aminé spécifique, ainsi que celle de l'estérification par cet acide aminé activé du ribose de I'extrémité 3' d'arns de transfert spécifiques à chacune de ces enzymes. La spécificité de ces réactions contribue a la capacité des ribosomes de respecter fidèlement le message génétique lors de la synthèse des protéines. Comme les aars régissent la première étape de la biosynthèse des protéines. leur activité fait l'objet d'un contrôle dépendant de la demande cellulaire des produits de leurs réactions. Ce contrôle peut être effectué à deux niveaux, soit celui de leur activité enzymatique, ou bien celui de la quantité de ces enzymes dans l'organisme. Tout d'abord, comme pour la plupart des enzymes. l'activité enzymatique des aars est fonction de l'équilibre entre les concentrations de leurs substrats et celles de leurs produits. Dans des conditions de croissance exponentielle, de l'ordre de 80 à 85% des ARNt sont aminoacylés, et ce pourcentage ne semble pas varier considérablement. Également. le fait que les activités des différentes aars correspondent aux niveaux d'incorporation de leus acides aminés propres dans les protéines en formation semble indiquer que ces enzymes ne jouent pas un rôle limitant pour la synthèse protéique (Gnuiberg-Manago, 1996). Cependant, un

15 équilibre entre le niveau intracellulaire des aminoacyl-arnt synthétases et les concentrations d'arnt est très important pour contrôler la fidélité du mécanisme de biosynthèse. En effet. il a été démontré qu'une surexpression de la glutaminyl-arnt synthétase de Escherichia coü in vivo produisait un niveau élevé d'aminoacylation de l'arnt supresseur ambre avec de la glutamirie. Cet effet est annulé lorsque l'arntc"'' est également surproduit (Swanson et d 1988). Cette constance dans la quantité de leurs produits, du rapport enzyme/arnt ainsi que leur rôle important dans le métabolisme cellulaire semblent exclure que les aminoacyl-arnt synthétases soient contrôlées finement au niveau de leur activité. Malgré cela. les aars de classe Ic requièrent la présence de leur ARNt pour se iier à leur acides aminés respectifs (Moras, l992). Aucun autre cas connu de contrôle allostérique de cette classe d'enzymes n'a été rapporté a ce jour. Ainsi, il semblerait que ce soit davantage au niveau de I'expression des gènes des aars que serait situé la régulation du niveau d'efficacité de ces enzymes : Nécessité d'une régulation cellulaire contrôlaat l'emression des gènes codant Dour les aminoacvl-arnt synthétases. Il a été observé chez la bactérie E. coli que la concentration en aars pouvait varier selon certaines conditions physiologiques. Dans cette bactérie, il a été montré pour 10 aars qu'une moyenne de 500 molécules était retrouvée par génome en milieu minimal avec une seule source de carbone, alors que la moyenne observée était supérieure à 800 en conditions de culture riches (Bremer et Dennis, 1987; Neidhardt et d 1977). De plus. la plupart des aars montrent une variation de l'ordre de deux fois de leurs niveaux de synthèse en réponse à une variation de la température de la culture de 28 à 42 C (Lemaux et d1978). il faut ajouter que le taux d'aminoacylation des ARNt joue un rôle très important au niveau même du

16 métabolisme cellulaire. Il pourrait. en influençant le niveau intracellulaire de ppûpp, semir de signal à la régulation stringente. du moins chez la bactérie E. coli (Grunberg-Manago. 1996). Les aminoacyl-arnt synthétases s'avèrent donc d'une telle importance, pour l'ensemble des processus cellulaires bactériens qu'il est nécessaire d'en savoir plus sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent leur expression. procamotes. 1.2 : Régulation de l'ex~ression des gènes des aars chez les générai : Rédation de l'ex~ression des gènes nrocarvotes en Les gènes procaryotes peuvent être contrôlés à diverses étapes de leur expression. soit lors de la transcription de leur séquence d'adn en ARN messager. et également lors de la traduction du message génétique sur cet ARNm en un polypeptide. Ce polypeptide peut être ensuite modifié de différentes façons avant de former une protéine capable de jouer le rôle qui lui est alloué dans la machinerie ceiiulaire. Ces modifications sont parfois l'objet d'un contrôle. Également, la durée de vie de I'ARN messager vient jouer un grand rôle dans le niveau d'expression d'un gène donné. et peut aussi êixe la cible d'un mécanisme de régulation : au niveau transcriptionne1 La transcription d'un gène en un ARN messager est souvent l'objet d'un ou de plusieurs modes de régulation. En effet, un gène peut faire partie d'un opéron, et voir ainsi son expression liée a plusieurs autres gênes ayant des fonctions complémentaires. L'expression d'un tel opéron peut être alors contrôlée de façon à ce qu'elle soit déclenchée uniquement lorsque le besoin s'en fait sentir, comme c'est le cas de i'opéron lac de E. coli ou des

17 opérons de biosynthèse des acides aminés, comme i'opéron trp. Ce contrôle peut s'esectuer lors de l'initiation de la transcription, comme dans le cas de l'opéron lac, ou lorsque celle-ci est amorcée. et que i'arn polymérase rencontre des obstacles qui viennent ralentir ou arrêter son activité. comme c'est le cas pour l'opéron trp. Dans ces deux cas, ces modulations de I'activité de I'ARN polymérase sont causées par des conditions intracellulaires précises, soit l'absence de P-galactoside intracellulaire dans le cas de l'opéron lac et une haute concentration en tryptophane dans le cas de I'opéron trp (Singer et Berg. 1992). Il sera question plus loiri (à la section 1.2.3) de mécanismes similaires affectant l'expression de certaines aminoacyl-arnt synthétases d'e. colï : au niveau traductionne1 Plusieurs parallèles ont été remarqués entre les processus de la transcription et de la traduction. En effet. ces deux processus requièrent l'assemblage séquentiel d'un complexe enzymatique à un endroit précis d'une matrice d'acides nucléiques. Ainsi, un peu de la même façon. la traduction d'un gène peut être contrôlée à son initiation seion la nature et la disponibilité du site de fixation du ribosome, mais aussi lors du processus lui-même. par I'interférence de la structure secondaire de I'ARN messager ou d'autres protéines qui s'y lient également. De plus, la fin de la traduction d'une séquence codante peut permettre dans certains cas d'initier celle d'un gène adjacent, où l'absence d'un site de fixation fort pour les ribosomes diminue fortement l'expression. En effet, un modèle, présenté par Adhin et van Duin (1990). stipule que la sous-unité 30s du ribosome a la particularité de se déplacer sur une assez courte distance le long d'un ARNm jusqu'à ce qu'elle trouve un site favorable à l'initiation de la traduction. La sous-unité 30s peut se déplacer autant vers l'extrémité 3' que l'extrémité 5' de I'ARNm. Toutefois, le modèle de Adhin et van Duin ne démontre qu'une telle recherche d'un site d'initiation de la traduction ou nscanningr que dans

18 un cas particulier, celui d'une rémtiation traductionnelle, soit après que le ribosome ait terminé la traduction d'une séquence codante. Lorsqu'une seconde séquence codante dotée d'un codon d'initiation est présente près (e40 nucléotides. en amont ou en aval) du codon stop du premier gène. la sous-unité 30s va initier la traduction de ce second gène, sans qu'une séquence Shine-Daigarno soit nécessaire à sa fixation : dégradation des ARNm Le modèle de dégradation couramment accepté, qui date de moins de 10 ans. provient presque exclusivement de l'étude de E. coli (Hue et al 1995). Chez cette bactérie. les ARNm sont dégradés par un groupe de cinq ribonucléases, dont trois sont des endonucléases. la RNAse III, la RNAse E et la RNAse K. Les den autres enzymes sont des exonucléases, la polynucléotide phosphorylase (PNPase) et la RNAçe II qui dégradent 1'ARNm de l'extrémité 3' vers 5'. Tout d'abord, 1'ARNm est parcouni à partir de l'extrémité 5' vers i'aval par les endonucléases qui recherchent leur site de coupure. et qui clivent le brin après l'avoir trouvé. Les nombreux fkagments résultants sont alors dégradés par les exonucléases. Ce procédé laisse aux ARNm des demi-vies allant de 0.5 à 20 minutes chez les procaxyotes (Pedersen. et ai. 1978, Nilsson et al 1984). Iî semble dors évident que la dégradation des ARNm est un facteur déterminant du niveau d'expression génétique. La régulation de la demi-vie du message génétique codant pour les protéines pourrait être une façon pour l'organisme de contrôler le taux cellulaire de synthèse de ces demiêres. Ainsi, une telie variation (40 fois) daiis les demi-vies de différents ARNm pourrait être expliquée par l'existence de modes de protection contre la dégradation (Hajnsdorf et cd, 1994). Seulement quelques modes de protection de ItAFtNm contre la prédation par les ribonucléases ont été élucidés. L'un de ceux qui semblent être les plus répandus est la présence d'une structure secondaire en tige et

19 boucle à l'extrémité 3' de I'ARNm, laissée par l'arrêt de la transcription à la suite d'un temateu pindépendant. Certaines études ont établi que l'effiacité de cette protection est plus importante in vwo qu'in vitro. Cela laisse supposer que des facteurs protéiques pourraient être impliqués dans le blocage des nucléases au niveau de cette structure en 3' de I'ARNm (McLaren et al 1991). Une autre méthode de stabilisation semble être la coupure de l'arnm dans des régions importantes de la structure secondaire de ce dernier; par exemple 1'ARNm de thrs de Bacülus subtüis est clivé entre la boîte T et le terminateur, ce qui laisserait 1'ARNm avec une structure en tige et boucle en 5' (Condon et al 1996). Il a été montré qu'une telle structure protège l'arnm contre I'attaque des ribonuclêases (Belasco et al 1986) : Mécanismes de réguïatian de l'expression de certaines aars chez Escherichia coli. De façon générale, l'expression des gènes des aars est soumise à la régulation métabolique, c'est à dire qu'elle est samulée par une augmentation du taux de croissance cellulaire. L'augmentation de l'expression des aars est de 2 à 3 fois pour chaque augmentation de 5 fois de ce taux. Par contre, les gènes des aars ne semblent pas particulièrement sensibles à la régulation astringente)). et ce malgré le fait que la production des ARN stables (ARNr et Mt) est stoppée en réponse à celle-ci. Toutefois, chez E. colt 10 gènes d'aars voient la répression de leur expression levée par une carence en leurs acides aminés correspondants, mais pas par une carence globale de plusieurs acides aminés (Grunberg-Manago. 1996). Ce type de régulation permettrait au micro-organisme d'utiliser plus efficacement des concentrations faibles de l'acide aminé en question. Comme cela a été mentionné plus haut (section 1.1.2), environ la moitié des aafs voient leur expression réprimée de l'ordre de deux fois lors d'un changement de température soudain, ce qui est également obsenré dans les cas des facteurs d'élongations EF-G et EF-T mais pas dans celui du facteur

20 EF-Tu. Dans Ia plupart des cas. on ignore les mécanismes exacts par lesquels ces régulations sont exercées. Toujours chez E. colt l'expression des gènes des aars est contrôlée de multiples façons. Par exemple. le site d'initiation de la traduction du gène thrs est précédé d'une séquence %leader. qui peut prendre les formes de deux structures secondaires remarquablement similaires à celle du bras de l'anticodon de deux A R N isoaccepteurs ~ ~ (Romby et cd 1996; Moine et d 1990). La thréonyl-arnt synthétase reconnaît ces deux structures secondaires de l'arn messager et peut ainsi réprimer sa propre biosynthèse lorsqu'elle n'est pas associée à ~'ARN~~ (Springer, et al 1985). L'autorégulation traductionnelle est loin d'être le seul type de contrôle de l'expression des gènes des aars chez E. colt et SchirnrneI D'autres mécanismes (Ekztney 1981: Fayat et al 1983). tels que la répression transcriptionrielle dans le cas du gène alas ainsi que l'atténuation transcriptiomeile pour les gènes phest ont également été proposés, quoique dans le premier cas, il n'aitjamais été démontré in vivo (Putzer. 1997) : Mécanismes de régulation de I'emnssion des aminoacvl- ARNt synthétases chez B. subtilis : Généralités Chez B. subtüis, une bactérie Gram-positive, l'expression de cette classe d'enzymes est soumise à plusieurs facteurs différents de ceux découverts chez E. coli En premier lieu, contrairement à la situation chez E. coli, la grande majorité des gènes des aars sont transcrits dans le même sens que l'onde de réplication du chromosome de cette bactérie. 11 est à noter que cette disposition des gènes est partagée avec plus de 80% des transcrits de B.

21 subtiiis. incluant tous les gènes fortement exprimés étudiés jusqu'à maintenant. Il est possible que cet arrangement soit favorable au bon fonctiomement conjugué de la répiication et de la transcription (French, 1992). De plus. les gènes des aars sont principalement regroupés en trois sections sur le chromosome de B. subtüis, ce qui est également différent du cas de E. coli, où ils sont plutôt dispersés. Toutefois, on ignore à ce jour les raisons de tels regroupements. Notons également l'absence de glutaminyl- ARNt synthétase (GLnRS), remplacée par l'action conjugée de la glutaniyi- ARNt synthétase et d'une glutamy1-~~~t~~ amidotransférase. Cette amidotransférase a été retrouvée chez la majorité des organismes procaryotes (Gram-positifs, cyanobactéries) et les archaebactéries mais pas chez les bactéries pourpres (à l'exception de Rhizobium melitoti (Gagnon et al 1996)). ni les organismes eucaryotes, à l'exception de leurs organelles (pour une revue, voir Freist et al. 1998). Une autre différence entre les gènes des aminoacyï-arnt synthétases d'e. coli par rapport à celles de B. subtilis se retrouve au niveau du contrôle de leur expression. En effet, chez cette demière bactérie ainsi que chez plusieurs autres organismes Gram-positifs. plusieurs gènes, dont plus de la moitié des gènes d'aars et certains opérons de biosynthèse d'acides aminés sont conk6lés par un seul type de mécanisme, l'antitemiiriaison transcrip tiomeue. Le mécanisme d'antiterniiriaison de la transcription par intéraction d'un ARNt avec l'arnm en construction est particulièrement bien connu pour le gène th6 de B. subtüb. codant pour la thréonyl-arnt synthétase (ThrRS) (voir figure 1). Tout d'abord, la structure de la région du.leader. comporte un terminateur p-indépendant, qui &te la transcription de 1'ARNm de thrs en conditions où le niveau intracellulaire de thréonyi-arn~' est sufasant

22 pour la cellule, donc de façon générale beaucoup plus important que le niveau libre. Lorsque le niveau d'mtthr libre vient à augmenter. ce qui veut dire soit qu'il y ait diminution du niveau de thréonyl-arnt synthétase. soit qu'a y ait diminution de.la concentration intracellulaire en thréontne. la ceiiule a un besoin accru de cet enzyme. I'ARN~- L'anticodon GGU de vient alors se lier à un codon spécificateur ACC à l'aval de la boîte T d'un ARNm codant pour thrs en voie de synthèse. Son extrémité 3' acceptrice. CCA, va alors se lier à une courte séquence complémentaire GGU. située dans la boite T, ce qui déstabilise la structure du terminateur et forme une autre structure, i'antitemiinateur. Celui-ci permet la suite de la transcription de I'ARNm. et ainsi l'expression de thrs en 'ïhrrs. ce qui va faire diminuer le niveau ~ ' A Rlibre N ~ ~ dans la cellule, donc qui va rétablir par a feedback * la structure du temxinateur. Cela arrête alors l'expression de thrs (Putzer et al Grundy et Henkin, 1993). A cette action de I'ARNt non chargé sur la structure secondaire du leader de l'arnm codant pour l'aars correspondant s'ajoute possibiement celle de l'arnt chargé. avec lequel il serait en compétition pour les sites de fixation sur la séquence leader (Grundy et al Garrity et Zahler, 1994). Ce type de régulation par compétition permet sans doute un contrôle très fin de l'initiation de la traduction des gènes dotés de boîtes T sur la séquence leader de leur ARNm.

23 . FIQUIC 1 : Structures secondaires de la région a leader de I'ARN messager codant pour le gène thrs de B. subtüis selon le niveau intracdulaire de thréonyl-arn~~: La figure du haut (A) représente la forme de I'ARNm en présence d'un niveau élevé de thréonyl-arn~~. alors que la figure du bas (B) représente le cas ofi le niveau d'mtrir non-chargé est élevé (Condon et d 1996).

24 1.3 : Description de l'opéron algk-cusbcuss de Bacillus subtitis : Position et arrangement et transcription des gènes. L'opéron gwc-cyse-cyss est situé à environ 9 O ( pb) de l'origine de réplication du génome de B. subtüis. L'opéron contient trois gènes codant respectivement pour la glutamyl-arnt synthétase (GluRS). la sérine acétyitransférase (SA-. et la cystéinyl-arnt synthétase (CysRS) (figure 2). La séquence de cet opéron a été déterminée par l'équipe du Dr. Lapointe (Breton et al. 1990; Gagnon et d 1994.). qui a démontré que les gènes gwz. cyse et cyss sont CO-transcrits dans cet ordre a partir d'un promoteur situé à 40 pb en amont du codon d'initiation de gwl Il s'agit du premier cas connu où les gènes de deux aars sont CO-transcrits. soit gltx et cyss. Également. comme la sérine acétyltransférase est la première eilzyme de la voie de biosynthèse de la cystéine. l'opéron gwz-cyse-cyss est le premier cas rapporté de CO-transcription d'un gène d'aars avec celui d'une enzyme de la voie de biosynthèse de l'acide aminé correspondant. 0.5 Kb FfPurc 2: Carte physique des gènes gw cyse, et cyss de B. subtizis (Gagnon et al. 1994). Un promoteur est situé en amont du gène glk II initie Ia transcription des gènes de gauche à droite de la figure. Une structure de terminaison de la transcription p- indépendante (représentée par une structure en tige et boucle est située entre les gènes gltx et cyse, immédiatement en aval de la boîte T. Eue arrête la transcription après gltx en présence d'une forte concenhation de cystéinyl-arn~~. La boîte T induirait l'antiterminaison de la transcription a ce terrninateur à basse concentration de cystéinyl- A R N et ~ ~ ainsi la synthèse d 'un long transcrit Un site de coupure de ce Iong transcrit serait situé immédiatement en aval de la structure d 'antiterminaison. donnant un ARNm codant pour güx et un ARNm codant pour cyse et cyss qui conserverait la structure du terminateur pindépendant (Pelchat et Lapointe, 1999).

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