LISA-TRACKER Premium Infliximab

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1 Fr. Juin 0 LISA-TRACKER Premium LTI00 6 déterminations Français DEFINITION Le coffret LISA-TRACKER Premium ( ) permet le dosage par méthode ELISA du TNFα humain, de l (anti-tnfα) ainsi que des anticorps anti-, dans le sérum. Ces tests sont quantitatifs et peuvent s effectuer de manière individuelle ou de manière simultanée grâce à un protocole de dosage uniformisé. VALEUR DIAGNOSTIQUE Les anti-tnfα sont des agents thérapeutiques largement utilisés pour traiter des patients atteints par diverses maladies inflammatoires. L est l un des anti-tnfα préconisé pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, la spondylarthrite ankylosante, etc. C est un anticorps monoclonal chimérique capable de se fixer au TNFα. Il permet ainsi de bloquer l action du TNFα responsable de l état inflammatoire. Cependant, au cours du traitement, certains patients peuvent développer des anticorps dirigés contre l. Il en résulte une diminution du taux plasmatique de l anti-tnfα ainsi qu une réapparition ou une augmentation des symptômes de la maladie. Le coffret LISA-TRACKER Premium ( ) permet le dosage de paramètres : TNFα, et anticorps anti-. Ce coffret permet aux praticiens de suivre au cours du temps l évolution du taux plasmatique de ces paramètres chez un patient. ECHANTILLONS Les dosages peuvent être effectués sur plasma ou sérum. Eviter d'utiliser des sérums lipémiques, ainsi que des prélèvements congelés et décongelés plus de fois. Le TNFα étant labile en solution, il est impératif d utiliser les échantillons immédiatement après prélèvement, ou de les congeler pour une utilisation ultérieure. Afin de limiter toutes fixations non spécifiques, il est conseillé de centrifuger et de filtrer les échantillons congelés depuis plus de 6 mois et troubles. PRINCIPE DES TESTS A) Dosage du TNFα Un anticorps monoclonal de capture anti-tnfα est adsorbé sur un support solide constitué de barrettes de 8 micropuits (microplaque). Dans un premier temps, l'échantillon dilué est distribué dans un puits de la microplaque. S'il contient du TNFα, celuici va se fixer à l anticorps de capture. Après incubation, un premier lavage permet d éliminer les éléments non-fixés. On ajoute ensuite un anticorps anti-tnfα biotinylé. Après incubation, un deuxième lavage permet d éliminer l excès d anticorps. Ensuite, la streptavidine conjuguée à la peroxydase de Raifort est ajoutée. Elle se fixe au complexe «anticorps de capture / TNFα / anticorps anti-tnfα biotinylé» précédemment formé. Après incubation, un troisième lavage permet d éliminer l'excès de conjugué. L'étape de chromogénèse est réalisée en déposant le substrat de l'enzyme : TMB (,,, tétraméthylbenzidine). Au cours de celle-ci, se développe une coloration proportionnelle à la quantité de TNFα présente dans l'échantillon. L'addition de H SO (0. M) permet de bloquer la réaction enzymatique. La lecture des densités optiques à 0 nm sur un spectrophotomètre constitue la dernière étape de réalisation du test. Une gamme étalon permet de définir la quantité de TNFα (pg/ml) présente dans l échantillon. B) Dosage de l L antigène TNFα humain est adsorbé sur un support solide constitué de barrettes de 8 micropuits (microplaque). Dans un premier temps, l'échantillon dilué est distribué dans un puits de la microplaque. S'il contient de l, celui-ci va se fixer au TNFα adsorbé. Après incubation, un premier lavage permet d éliminer les éléments non-fixés. On ajoute ensuite un anticorps anti-igg humaines biotinylé. Après incubation, un deuxième lavage permet d éliminer l excès d anticorps. Ensuite, la streptavidine conjuguée à la peroxydase de Raifort est ajoutée. Elle se fixe au complexe «TNFα / / anti-iggh biotinylé» précédemment formé. Après incubation, un troisième lavage permet d éliminer l'excès de conjugué. L'étape de chromogénèse est réalisée en déposant le substrat de l'enzyme: TMB (,,, tétraméthylbenzidine). Au cours de celle-ci, se développe une coloration proportionnelle à la quantité d présente dans l'échantillon. L'addition de H SO (0. M) permet de bloquer la réaction enzymatique. La lecture des densités optiques à 0 nm sur un spectrophotomètre constitue la dernière étape de réalisation du test. Une gamme étalon permet de définir la quantité d (µg/ml) présente dans l échantillon. Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

2 C) Dosage des anticorps anti- L est adsorbé sur un support solide constitué de barrettes de 8 micropuits (microplaque). Dans un premier temps, l'échantillon dilué est distribué dans un puits de la microplaque. S'il contient des anticorps anti-, ceux-ci vont se fixer à l adsorbé. Après incubation, un premier lavage permet d éliminer les éléments non-fixés. On ajoute ensuite de l biotinylé. Après incubation, un deuxième lavage permet d éliminer l excès d anticorps. Ensuite, la streptavidine conjuguée à la peroxydase de Raifort est ajoutée. Elle se fixe au complexe «adsorbé / anticorps anti- / biotinylé» précédemment formé. Après incubation, un troisième lavage permet d éliminer l'excès de conjugué. L'étape de chromogénèse est réalisée en déposant le substrat de l'enzyme : TMB (,,, tétraméthylbenzidine). Au cours de celle-ci, se développe une coloration proportionnelle à la quantité d anticorps anti- présente dans l'échantillon. L'addition de H SO (0. M) permet de bloquer la réaction enzymatique. La lecture des densités optiques à 0 nm sur un spectrophotomètre constitue la dernière étape de réalisation du test. Une gamme étalon permet de définir la quantité d anticorps anti- (ng/ml) présente dans l échantillon. COMPOSITION DU COFFRET Le coffret est composé de familles de réactifs : Couleur bouchons des flacons de réactifs Réactifs «dosage TNFα» Réactifs «dosage» Réactifs «dosage anticorps anti-» Rouge Bleu Jaune Réactifs «communs» Vert, Blanc, Noir ou Violet micropuits Rouge Bleu Jaune - A) Réactifs spécifiques au dosage du TNFα Flacons de «contrôle positif - TNF» (pg/ml), lyophilisés, à reconstituer à l aide du tampon de reprise. A diluer. Un seul flacon est à utiliser par série de tests. Ne pas réutiliser. Les valeurs attendues (pg/ml) sont indiquées sur le flacon. Bouchons rouges. Flacon d anticorps biotinylé. Prêt à l'emploi. Bouchon rouge. Flacon «Tampon de dilution des s - TNFα». Prêt à l'emploi. Bouchon rouge. Flacon «Tampon de reprise». Prêt à l'emploi. x 00µl x 6ml x 8ml Bouchon rouge. Note : Les titres des étalons et du contrôle positif pour le TNFα ont été standardisés par rapport à l étalon international WHO: 88/786. B) Réactifs spécifiques au dosage de l x 6ml Une microplaque de barrettes bleues amovibles, sensibilisée par du TNFα humain. barrettes Cinq flacons «-», (µg/ml). Prêts à l'emploi. Ils peuvent être utilisés plusieurs fois. La quantité d est indiquée sur le flacon. Bouchons bleus. Flacon «contrôle positif -», (µg/ml). A diluer. Il peut être utilisé plusieurs fois. x,ml x 0µl Une microplaque de barrettes rouges amovibles, sensibilisée par un anticorps monoclonal anti-tnfα. barrettes Les valeurs attendues (µg/ml) sont indiquées sur le flacon. Bouchon bleu. Flacons «- TNF» lyophilisés, (pg/ml), à reconstituer en tampon de reprise. A diluer. Un seul flacon est à utiliser par série de tests. Ne pas réutiliser. x 00µl Flacon d anticorps biotinylé. Prêt à l'emploi. Bouchon bleu. x 6ml La quantité de TNFα est indiquée sur le flacon. Bouchons rouges. Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

3 C) Réactifs spécifiques au dosage des anticorps anti- Une microplaque de barrettes jaunes amovibles, sensibilisée par de l. barrettes Cinq flacons «- anti-», (ng/ml). Prêts à l'emploi. Ils peuvent être utilisés plusieurs fois. La quantité en anticorps anti- est indiquée sur le flacon. Bouchons jaunes. x,ml du sachet déshydratant et les remettre immédiatement entre + C et +8 C. Les étalons et le contrôle positif pour le dosage du TNFα doivent être utilisés de manière extemporanée. Ils doivent être utilisés dans l heure qui suit leur reconstitution en «tampon de reprise». Ils sont à usage unique et doivent donc être jetés après utilisation. PREPARATION DES REACTIFS A l exception du TDL, qui peut être préparé à l avance, les réactifs doivent être préparés de manière extemporanée. Flacon «contrôle positif anti-», (ng/ml). A diluer. Il peut être utilisé plusieurs fois. Les valeurs attendues (ng/ml) sont indiquées sur le flacon. Bouchon jaune. Flacon d anticorps biotinylé Prêt à l'emploi. Bouchon jaune. x ml x 6ml. Tampon de dilution et de lavage (TDL) - Diluer le Tampon Phosphate-Tween concentré au /0 en eau distillée. - Durée de conservation : mois entre + C et +8 C (ne plus utiliser si des signes de contaminations ou de modifications apparaissent) Remarque : en présence de cristaux dans la solution concentrée, placer le flacon min. à +7 C avant utilisation.. Préparation des échantillons et des contrôles positifs D) Réactifs communs aux trois dosages Flacon de streptavidine conjuguée à la peroxydase. Prêt à l'emploi. Bouchon vert. Flacon de Tampon Phosphate-Tween ph 7, (concentré 0x) - A reconstituer en eau distillée. Bouchon blanc. Flacon de Substrat (TMB). Prêt à l emploi. Bouchon noir. Flacon de solution d arrêt H SO (0. M). Prêt à l emploi. Bouchon violet. x ml x 00ml x ml x ml a) Echantillons - Dosage du TNFα et dosage des anticorps anti- : les diluer au / en tampon TDL (exemple : 0µl + 0µl de TDL). Agiter vigoureusement au vortex. - Dosage de l : les diluer au /0 en tampon TDL (exemple : 0µl + ml de TDL). Agiter vigoureusement au vortex. b) Contrôles positifs - Dosage du TNFα : dans un premier temps, le contrôle positif lyophilisé doit être reconstitué en ajoutant 00µl de «tampon de reprise» [BUF-A]. Attendre minutes, puis agiter vigoureusement. A nouveau, attendre minutes et agiter vigoureusement. - Dans un second temps, le contrôle positif «reconstitué» doit être dilué au / en tampon TDL (0µl + 0µl de TDL). Agiter vigoureusement au vortex. MATERIEL NECESSAIRE NON FOURNI Eau distillée Pipettes de précision Lecteur muni d'un filtre 0 nm Peigne de lavage 8 canaux. STABILITE ET CONDITIONS DE CONSERVATION Tous les réactifs et les barrettes de puits sensibilisées doivent être conservés entre + C et +8 C dans leur conditionnement d origine. Ne pas utiliser un coffret dont les dates de péremption sont dépassées. Après la première ouverture, conserver les barrettes non utilisées à l'intérieur de la pochette plastique en présence - Dosage de l : le diluer au /0 en tampon TDL (exemple : 0µl + ml de TDL). Agiter vigoureusement au vortex. - Dosage des anticorps anti- : le diluer au / en tampon TDL (exemple : 0µl + 0µl de TDL). Agiter vigoureusement au vortex.. Préparation de la gamme étalon pour le dosage du TNF. Etant donné la labilité du TNFα en phase liquide il est nécessaire de préparer la gamme étalon de manière extemporanée à partir de l étalon lyophilisé [CAL]. - Reconstituer l étalon TNFα lyophilisé, [CAL], avec 00µl de tampon de reprise [BUF-A]. Attendre minutes, puis agiter vigoureusement. A nouveau, attendre minutes et agiter vigoureusement. Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

4 - Diluer l étalon initial reconstitué de ¼ en ¼ (en cascade) en tampon de dilution de l étalon TNFα,, afin d obtenir les étalons de la gamme. Le tampon de dilution de l étalon TNFα,, est utilisé comme «6». Le schéma de dilution est présenté dans le tableau ci-dessous : «reconstitué» 000 pg/ml 000 pg/ml 6 0 pg/ml 6, pg/ml,6 pg/ml 0 pg/ml = = = = = = lyophilisé [TNF-CAL] 00µl «reconstitué» 00µl 00µl 00µl µl de Tampon de reprise [BUF-A] 00µl de 00µl de [DIL- CAL] 00µl de [DIL- CAL] 00µl de [DIL- CAL] [DIL- CAL] - Les étalons à 6 doivent être déposés dans la microplaque. L étalon «reconstitué» ne doit pas être déposé sur la microplaque.. Utilisation des anticorps biotinylés - prêts à l'emploi - Estimer le volume nécessaire à la manipulation et les transférer dans un tube à partir duquel se fera le dépôt.. Utilisation du conjugué (streptavidine-hrp) - prêt à l'emploi - Estimer le volume nécessaire à la manipulation et le transférer dans un tube à partir duquel se fera le dépôt. 6. Utilisation du substrat - prêt à l'emploi - Estimer le volume nécessaire à la manipulation et le transférer dans un tube opaque à partir duquel se fera le dépôt. PRECAUTIONS D'EMPLOI - Retirer tous les réactifs hors de leur logement de conditionnement et les ramener impérativement à température ambiante (+8 C / + C) au minimum une demi-heure avant de commencer le dosage. - La température des réactifs peut influencer le résultat final. - S'assurer que les plaques soient bien égouttées après chaque lavage. - Ne pas utiliser les réactifs si des signes de contaminations ou de modifications apparaissent. Les étalons, les contrôles et le tampon de dilution des s-tnf, sont d'origine humaine. Pour chacun, les recherches d'anticorps anti-hiv et, anti-hcv et d'antigènes de l'hépatite B se sont révélées négatives. S'agissant de produits potentiellement infectieux, il est toutefois nécessaire de les manipuler avec les précautions d'usage. - Les étalons et le contrôle positif pour le dosage du TNFα doivent être utilisés de manière extemporanée. Ils doivent être utilisés dans l heure qui suit leur reconstitution en «tampon de reprise». Ils sont à usage unique et doivent donc être jetés après utilisation. - Les réactifs en solution (excepté la solution d arrêt) contiennent comme agent de conservation, de l azide de sodium à une concentration <0.% (w/v) ou du ProClin 00 à 0.0% (w/v). Ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L azide de sodium peut former des mélanges explosifs lors de son élimination dans les canalisations de cuivre ou de plomb. Rincer abondamment lors de telles éliminations. - Le coffret LISA-TRACKER Premium ( ) a été élaboré dans le respect des directives européennes 67/8/CEE et 999//CE en ce qui concerne la classification, l emballage et l étiquetage des préparations dangereuses. - LISA-TRACKER Premium ( ) a été optimisé pour les conditions opératoires précisées dans cette notice. Le non-respect des dilutions, de la préparation des réactifs, du protocole ou la substitution d un réactif par un autre produit peuvent affecter les performances finales du test. MODE OPERATOIRE. Préparation du test Utiliser la feuille de travail contenue dans le coffret pour noter la localisation des échantillons. Pour chaque essai, et pour chaque spécificité de dosage, prévoir : - puits «étalon» (gamme de calibration) - puits «contrôle positif» - puits par échantillon Dans le cas d un dosage «simultané» placer les barrettes correspondantes à chaque spécificité sur un support de plaque. Remarque : Dans le cadre de l utilisation d un automate de dilution/répartition, placer les barrettes dans l ordre suivant : dosage de l, dosage des anti- puis dosage du TNFα.. Incubation des étalons, des contrôles positifs et des échantillons Déposer 00µl par puits pour chaque étalon. Déposer 00µl par puits de chaque contrôle dilué. Déposer 00µl d échantillons dilués dans les puits correspondant aux spécificités recherchées. Laisser incuber 60 minutes à température ambiante. Vider les puits par retournement de la plaque. Procéder à une série de lavages en tampon de dilution et de lavage (TDL) (00µl/puits). Eliminer le liquide résiduel en tamponnant la plaque sur un papier absorbant.. Incubation de l anticorps biotinylé Déposer 00µl d anticorps biotinylé spécifique, prêt à l emploi, dans tous les puits respectifs. Incuber 60 minutes à température ambiante. Vider les puits par retournement de la plaque. Procéder à une série de lavages en tampon de dilution et de lavage (TDL) (00µl/puits). Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

5 Eliminer le liquide résiduel en tamponnant la plaque sur un papier absorbant.. Incubation du Conjugué Déposer 00µl de conjugué prêt à l emploi dans tous les puits. Incuber 0 minutes à température ambiante. Vider les puits par retournement de la plaque. Procéder à une série de lavages en tampon de dilution et de lavage (TDL) (00µl/puits). Eliminer le liquide résiduel en tamponnant la plaque sur un papier absorbant.. Incubation du Substrat Déposer 00µl de substrat dans tous les puits. Incuber minutes à température ambiante et à l abri de la lumière. 6. Arrêt de la réaction Ajouter 00µl de H SO (0. M) dans tous les puits. 7. Lecture Lire la densité optique de chaque puits avec un lecteur de microplaques muni d'un filtre 0nm au cours des 0 minutes suivant l arrêt de la réaction. RESULTATS ET INTERPRETATION C) Dosage des anticorps anti- - La densité optique (DO) de l étalon doit être au moins égale à La valeur (ng/ml) du contrôle positif doit être comprise dans la fourchette d acceptation inscrite sur le flacon. - Tracer la courbe d étalonnage (polynomiale) en portant en abscisse (axe des X) la quantité d anticorps anti- (ng/ml) de chaque étalon et, en ordonnée (axe des Y), la DO correspondante. - La quantité d anticorps anti- de l échantillon dosée peut être lue directement sur la courbe. - Tout échantillon possédant une DO supérieure à celle de l étalon est considéré «hors-gamme». Il peut être redilué afin d estimer précisément la quantité d anticorps anti-. Dans ce cas, il faut tenir compte du facteur de dilution. CARACTERISTIQUES ET PERFORMANCES DES DOSAGES Limite de détection Estimé à partir des 6 échantillons issus d une population «individus sains». Limite de détection TNFα Limite de détection Limite de détection Anti- 0 pg/ml 0, µg/ml 0 ng/ml Au 99 ème percentile Au 9 ème percentile Au 9 ème percentile A) Dosage du TNFα - La densité optique (DO) de l étalon doit être au moins égale à La valeur (pg/ml) du contrôle positif doit être comprise dans la fourchette d acceptation inscrite sur le flacon. - Tracer la courbe d étalonnage (polynomiale) en portant en abscisse (axe des X) la quantité de TNFα (pg/ml) de chaque étalon et, en ordonnée (axe des Y), la DO correspondante. - La quantité de TNFα de l échantillon dosée peut être lue directement sur la courbe. - Tout échantillon possédant une DO supérieure à celle de l étalon est considéré «hors-gamme». Il peut être redilué afin d estimer précisément la quantité de TNFα. Dans ce cas, il faut tenir compte du facteur de dilution. B) Dosage de l - La densité optique (DO) de l étalon doit être au moins égale à La valeur (µg/ml) du contrôle positif doit être comprise dans la fourchette d acceptation inscrite sur le flacon. - Tracer la courbe d étalonnage (polynomiale) en portant en abscisse (axe des X) la quantité d (µg/ml) de chaque étalon et, en ordonnée (axe des Y), la DO correspondante. - La quantité d de l échantillon dosée peut être lue directement sur la courbe. - Tout échantillon possédant une DO supérieure à celle de l étalon est considéré «hors-gamme». Il peut être redilué afin d estimer précisément la quantité d. Dans ce cas, il faut tenir compte du facteur de dilution. Plage de mesure TNFα Anti- 0 pg/ml pg/ml 0, µg/ml - µg/ml 0 ng/ml - 00 ng/ml Etude des substances interférentes LISA-TRACKER Premium ( ) a été évalué sur une population de sérums contenant des substances potentiellement interférentes (cryoglobulines, facteurs rhumatoïdes, anticorps hétérophiles, taux élevés de triglycérides, de bilirubine, d IgG et/ou d IgM, de protéine Cq) et sur une population de sérums de patients présentant des maladies autoimmunes. Aucune interférence n a été détectée. Précision Paramètres TNFα (pg/ml) (µg/ml) Anti- (ng/ml) Intra-essai ( tests dans le même essai) Valeur moyenne CV (%) Inter-essais ( tests dans essais différents) Valeur moyenne CV (%) Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

6 Justesse Le standard international WHO 88/786 pour le TNFα a été dilué à 000pg/ml et testé en parallèle des essais de précision. TNFα (pg/ml) International WHO 88/786 dilué à 000pg/ml LIMITES Intra-essai ( tests dans le même essai) Valeur moyenne CV (%) Inter-essais ( tests dans essais différents) Valeur moyenne CV (%) Le dosage de l montre une réaction croisée vis-àvis des sérums de patients traités par de l Adalimumab et de l Etanercept, qui sont autres anti-tnfα couramment utilisés. BIBLIOGRAPHIE Ainsworth MA et al. Tumor necrosis factor-alpha binding capacity and anti-infliximab antibodies measured by fluidphase radioimmunoassays as predictors of clinical efficacy of infliximab in Crohn's disease. Am J Gastroenterol. 008 Apr;0():9-8. Afif W et al.clinical Utility of Measuring and Human Anti- Chimeric Antibody Concentrations in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Am J Gastroenterol 00; 0: 9. Arends S et al. The formation of autoantibodies and antibodies to TNF-α blocking agents in relation to clinical response in patients with ankylosing spondylitis. Clin Exp Rheumatol. 00 Sep-Oct;8():66-8. Baert F et al. Influence of Immunogenicity on the Long-Term Efficacy of in Crohn s Disease. N Engl J Med 00;8:60-8. Bartelds GM et al. Development of antidrug antibodies against adalimumab and association with disease activity and treatment failure during long-term follow-up. JAMA. 0 Apr ;0():60-8. Bendtzen K. Is There a Need for Immunopharmacologic Guidance of Anti Tumor Necrosis Factor Therapies. ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 6, No., April 0, pp Candon S et al. Clinical and biological consequences of immunization to infliximab in pediatric Crohn's disease. Clin Immunol. 006 Jan;8():-9. Choy et al. Efficacy of a novel PEGylated humanized anti-tnf (CDP870) in patients with rheumatoid arthritis : a phase II doubleblinded, randomized, dose escalating trial. Rheumatology 00;:-7. Jaminitski et al. The presence or absence of antibodies to infliximab or adalimumab determines the outcome of switching to etanercept. Rheum Dis. 0 Feb;70():8-8. Koren et al. Recommendation on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products. Journal of Immunological Methods, (008) -9. Korswagen LA et al. Venous and Arterial Thromboembolic Events in Adalimumab-Treated Patients With Anti-adalimumab Antibodies. ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 6, No., April 0, pp Krzysiek R et al. Circulating Concentration of and Response to Treatment in Ankylosing Spondylitis: Results From a Randomized Control Study. Arthritis & Rheumatism (Arthritis Care & Research) Vol. 6, No., May, 009, pp Marotte et al. Circulating tumour necrosis factor-alpha bioactivity in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab: link to clinical response. Arthritis Res Ther. 00;7():R9-. Mire-Sluis et al. 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7 SCHEMA RECAPITULATIF DU MODE OPERATOIRE A) Dilution des échantillons : Dosage du TNFα Dosage de l Dosage des anticorps anti- au / au /0 au / B) Dilution des contrôles positifs : Dosage du TNFα Dosage de l Dosage des anticorps anti- au / * au /0 au / * le contrôle positif lyophilisé est à reconstituer avec 00µl de «tampon de reprise», puis à diluer au ½ en TDL. C) Préparation de la gamme étalon TNFα : Remarque : la gamme étalon TNFα doit être fabriquée à partir de l étalon TNFα et utilisée dans l heure. «reconstitué» pg/ml 000 pg/ml 0 pg/ml 6, pg/ml,6 pg/ml 0 pg/ml = = = = = = lyophilisé [TNF-CAL] 00µl «reconstitué» 00µl 00µl 00µl µl de Tampon de reprise [BUF-A] 00µl de 00µl de 00µl de 00µl de D) Mode opératoire : Réactifs s* Contrôles positifs dilués Echantillons dilués Incubation Lavage** Anticorps secondaires biotinylés Incubation Lavage** Streptavidine-HRP Incubation Lavage** Substrat (TMB) Incubation Solution «stop» Mode opératoire 00µl / puits h à température ambiante Laver fois en tampon de dilution/lavage (TDL) : x 00µl / puits 00µl / puits (réactifs spécifiques) h à température ambiante Laver fois en tampon de dilution/lavage (TDL) : x 00µl / puits 00µl / puits 0 minutes à température ambiante Laver fois en tampon de dilution/lavage (TDL) : x 00µl / puits 00µl / puits minutes à température ambiante et à l abri de la lumière 00µl / puits * Les étalons pour le dosage du TNFα doivent être fabriqués de manière extemporannée. En revanche, les étalons pour le dosage de l et des anticorps anti- sont prêts à l emploi. ** Eliminer le liquide résiduel en tamponnant la plaque sur un papier absorbant. Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page 7/8

8 E) Exemples de configuration de dosage : a) 6 sérums à doser en, anti- et TNFα A B C D E F C+ 8 6 C+ 8 6 C+ 8 6 G H Dosage Dosage anti- Dosage TNFα b) patients à doser en, anti- et TNFα A 6 B C D E F C+ C+ C+ G H Dosage Dosage anti- Dosage TNFα Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page 8/8

9 c) 6 sérums à doser en anti A 9 B 0 C D 6 E 7 F C+ 8 6 G 9 7 H Dosage anti- INDEX DES SYMBOLES Déclaration de conformité CE Test ELISA Référence produit Numéro de Lot Date d expiration Dispositif de Diagnostic In Vitro Nombre de tests Consulter les instructions d utilisation Limites de température Risque biologique Contient de l azide de sodium A reconstituer Siège social -6 bld de Beaubourg, Actipôle Bat, Croissy Beaubourg 77 Marne la Vallée Cx France Tél : Fax : Internet : Notice technique, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page 9/8

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11 Ag. June 0 LISA-TRACKER Premium LTI00 6 determinations English DEFINITION LISA-TRACKER Premium ( ) is an enzyme linked immunoassay (ELISA) for the quantitative determination of human TNFα, (anti-tnfα) and anti- antibodies in human serum samples. These tests can be separatly or simultaneously done by following the standardized assay protocole. DIAGNOSTIC VALUE Anti-TNFα are therapeutic agents widely used to treat patients with various inflammatory diseases. is one of the anti-tnfα recommended for the treatment of the rheumatoid arthritis, Crohn s disease, ankylosing spondylitis, etc. This chimeric monoclonal antibody is able to bind TNFα. It blocks the action of TNFα responsible for the inflammatory state. However, during the treatment, some patients can develop antibodies against. Consequently, the plasmatic level of anti-tnfα decreases and simultaneous the disease symptoms reappear or increase. LISA-TRACKER Premium ( ) allows the detection of parameters: TNFα, and anti- antibodies. This kit allows the physician to monitor the level of these parameters in patient sera. SAMPLES COLLECTION AND HANDLING The test should be performed on serum or on plasma. Lipemic sera should be avoided, as well as samples which have been frozen and defrosted more than once. The TNFα being unstable in solution, it is imperative to use samples immediately after blood taking. If determination is not performed immediately, samples should be frozen. To avoid any non-specific binding, samples which have been frozen for more than 6 months or which are cloudy, should be centrifuged and filtered. ASSAY PRINCIPLE A. Dosage of TNFα A monoclonal anti-tnfα antibody is coated onto a polystyrene microtiter plate ( strips of 8 wells). First, the diluted sample is added to the antibody coated well, which allows to bind. After incubation, unbound proteins are removed by washing. Anti-TNFα biotinylated antibodies is added. After incubation, unbound antibodies are removed by washing. Then horseradish peroxydase labelled streptavidin is added. The streptavidin binds to the complex formed with biotinylated anti-tnfα antibodies. After incubation, the wells are washed again to eliminate any excess of conjugate. The bound enzyme is revealed by addition of substrate TMB (,,, tetramethylbenzidin). The colour intensity is proportional to the amount of TNFα. Adding H SO (0.M) allows to stop the enzymatic reaction. After stopping the reaction by H SO (0.M), the optical density is read by a spectrophotometer at 0nm. A range of calibration allows to define the quantity of TNFα of each patient samples expressed in pg/ml. B. Dosage of The TNFα is coated onto a polystyrene microtiter plate ( strips of 8 wells). First, the diluted sample is added to the antibody coated well, which allows to bind. After incubation, unbound proteins are removed by washing. Anti-human IgG biotinylated antibodies is added. After incubation, unbound antibodies are removed by washing Then horseradish peroxydase labelled streptavidin is added. The streptavidin binds to the complex formed with biotinylated anti-igg antibodies. After incubation, the wells are washed again to eliminate any excess of conjugate. The bound enzyme is revealed by addition of substrate TMB (,,, tetramethylbenzidin). The colour intensity is proportional to the amount of. Adding H SO (0.M) allows to stop the enzymatic reaction. After stopping the reaction by H SO (0.M), the optical density is read by a spectrophotometer at 0nm. A range of calibration allows to define the quantity of of each patient samples expressed in µg/ml. C. Dosage of anti- The is coated onto a polystyrene microtiter plate ( strips of 8 wells). First, the diluted sample is added to the antibody coated well, which allows to bind. After incubation, unbound proteins are removed by washing. Biotinylated infliximab is added. After incubation, unbound antibodies are removed by washing Then horseradish peroxydase labelled streptavidin is added. The streptavidin binds to the complex formed with biotinylated. After incubation, the wells are washed again to eliminate any excess of conjugate. The bound enzyme is revealed by addition of substrate TMB (,,, tetramethylbenzidin). The colour intensity is proportional to the amount of anti- antibodies. Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page 0/8

12 Adding H SO (0.M) allows to stop the enzymatic reaction. After stopping the reaction by H SO (0.M), the optical density is read by a spectrophotometer at 0nm. A range of calibration allows to define the quantity of anti- antibodies of each patient samples expressed in ng/ml. REAGENTS reagent families : Color TNFα reagents reagents anti- antibodies reagents cap of vials Red Blue Yellow Common reagents Green, White, Black or Purple microwells Red Blue Yellow - A) Specific reagents for the TNFα determination strips of individual breakaway red wells coated with a monoclonal anti-tnfα antibodies. «- TNFα» lyophilized vial (pg/ml), To reconstitute with Buffer A. To dilute. A single vial is to be used for each serie of tests. Do not reuse. The quantity of TNF α is indicated on the vial label. Red cap «Positive control - TNFα» (pg/ml), lyophilized vial. To reconstitute with Buffer A. To dilute. A single vial is to be used for each serie of tests. Do not reuse. The quantity of TNF α is indicated on the vial label. Red cap Biotinylated antibody vial. Red cap «dilution buffer - TNFα» vial. Red cap Buffer A vial. strips x 00µL x 00µL x 6mL x 8mL x 6mL Red cap Note : s and positive control for TNFα titer are standardized against the WHO reference: 88/786. B) Specific reagents for the determination strips of individual breakaway blue wells coated with human TNFα. strips vials of s, (µg/ml). The vials can be reused several times. The quantity of is indicated on the vial label. Blue cap «Positive control -», (µg/ml). To dilute. The vials can be reused several times. The quantity of is indicated on the vial label. Blue cap Biotinylated antibody vial. Blue cap C) Specific reagents for the anti- antibodies determination x,ml x 0µL x 6mL strips of individual breakaway yellow wells coated with. strips vials of «anti-» s, (ng/ml). The vials can be reused several times. The quantity of anti- is indicated on the vial label. Yellow cap «Positive control anti-infliximab», (ng/ml). To dilute. The vial can be reused several times. The quantity of anti- is indicated on the vial label. Yellow cap Biotinylated antibody vial. Yellow cap x,ml x ml x 6mL Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

13 D) Common reagents HRP labelled Streptavidin. Green cap Phosphate-Tween Buffer ph 7, (0x) To reconstitute with distilled water. White cap Substrate (TMB). Black cap Stop solution - H SO (0. M). Purple cap MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED x ml x 00mL x ml x ml b. Positive controls - TNFα determination - The lyophilized control should be reconstituted with 00µL of buffer A, [BUF-A]. Wait minutes, then mix vigorously. Repeat this agitation step. - Then, dilute the reconstituted positive control to ½ in TDL. Ex : 0µL positive control + 0µL TDL Vortex vigorously. - determination - Dilute to /0 in TDL Ex : 0µL positive control + ml TDL - Vortex vigorously. - anti- determination - Dilute to / in TDL Ex : 0µL positive control + 0µL TDL - Vortex vigorously. distilled water precision pipettes microplate spectrophotometer with 0 nm filter 8 channel pipettes STABILITY AND STORAGE Store reagents and micro-wells at + C/+8 C in their own package. Do not use kits beyond the expiration date. Store unused strips into their plastic bag with the desiccant. Store all components immediately after use again at + C/+8 C. The standard and the positive control for the dosage of the TNFα must be used in an extemporaneous way. They must be used within the hour after their reconstitution in buffer A. They are single-used and must be discarded after use. SETUP Except the TDL, which can be prepare in advance, all reagents must be prepared extemporaneously.. Dilution and Wash buffer (TDL) - Dilute concentrated Phosphate-Tween Buffer /0 in distilled water. - Shelf life : month at + C/+8 C (avoid to use if signs of contamination or other visible changes occur). NB. If there are crystals in the concentrated solution, warm the bottle up to +7 C for minutes before use.. Preparation of samples and positive controls a. Samples - TNFα and anti- determination - Dilute to / in TDL Ex : 0µL sample + 0µL TDL - Vortex vigorously. - determination - Dilute to /0 in TDL Ex : 0µL sample + ml TDL - Vortex vigorously.. Preparation of the calibration range for the TNF Considering the TNFα lability in solution, the calibration range should be prepared just before performed the test. - The lyophilized TNFα standard, [TNF-CAL], must be reconstituted with 00µL of buffer A, [BUF-A]. Wait minutes, then mix vigorously. Repeat this agitation step. - Then proceed to the serial dilution to ¼ of the standard into the standard buffer,. The standard buffer, [DIL- CAL], will be use as standard 6. The dilution protocole is presented in the table below. «reconstituted» 000 pg/ml 000 pg/ml 0 pg/ml 6, pg/ml,6 pg/ml 6 0 pg/ml = = = = = = lyophilized [TNF-CAL] 00µL «reconsti tuted» 00µL 00µL 00µL µL Buffer A [BUF-A] 00µL 00µL 00µL 00µL Note : only standards to 6 should be used for the calibration curves.. Use of ready-to-use biotinylated antibody. - Estimate the amount required for handling and transfer to a tube.. Use of ready-to-use HRP Streptavidin conjugate. - Estimate the amount required for handling and transfer to a tube. 6. Use of ready-to-use substrate. - Estimate the amount required for handling and transfer to a dark tube. Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

14 PRECAUTIONS Unpack all reagents in order to let them warm at room temperature (+8 C/+ C) at least half an hour before starting the test. The temperature of the reagents can impact the final result. Check that all plates are well drained after each wash. Avoid to use reagents if signs of contamination or other visible changes occur. Human sources for the preparation of standards, controls and the standard dilution buffer-tnf, have been tested and found negative for antibody to HIV and, antibody to hepatitis C virus and hepatitis B virus antigen. Nevertheless, no test can offer complete assurance that HIV, hepatitis B virus or other infectious agents are absent. Therefore, the reagents should be handled as potentially infective materials. The standard and the positive control for the dosage of the TNFα must be used extemporaneously. They must be used within the hour after their reconstitution in buffer A. They are single-use and must be discarded after use. Reagents in solution (except for substrate buffer and stop solution) contain less of 0.% (w/v) sodium azide and 0.0% (w/v) of Proclin 00. Do not eat and avoid contact with skin and eyes. Azide can form explosive mixtures in copper or lead piping. Rinse thoroughly after flushing. LISA-TRACKER Premium ( ) has been developed according CE directives 67/8/EEC and 999//EC relating to the classification, packaging and labeling of dangerous preparations. LISA-TRACKER Premium ( ) has been optimized for the use as describe in this procedure. Do not substitute other manufacter s reagents. Dilution or adulteration of these reagents may also affect the performance of the test. Close adherence to the test procedure will assure optimal performance. METHOD. Preparing the test Use the work sheet to note the sample locations. Set out: - standard wells - well for positive control - well for each sample For a simultaneous testing of the parameters, detach the exact number of wells needed. Return unused wells to plastic pouch provided in the kit, with the desiccant bag. Remark : If a dispensing/diluting device is used, place the specific wells in the following order : dosage of, dosage of anti- then dosage of TNFα.. Samples, positive controls and standards incubation Add 00 µl of standards, diluted controls or samples. Incubate for 60 minutes at room temperature (+8 C/+ C). Wash step: Remove the content of the wells by rapid inversion. Wash times with 00µL of TDL buffer. Dry the microplate by tapping it gently on an absorbent paper to eliminate the excess of liquid.. Incubation of biotinylated antibodies Add 00µL of specific biotinylated antibodies in identified wells. Incubate for 60 minutes at room temperature (+8 C/+ C). Wash step: Remove the content of the wells by rapid inversion. Wash times with 00µL of dilution and washing buffer. Dry the microplate by tapping it gently on an absorbent paper to eliminate the excess of liquid.. Incubation of Conjugate Add 00µL of conjugate. Incubate for 0 minutes at room temperature (+8 C/+ C). Wash step: Remove the content of the wells by rapid inversion. Wash times with 00µL of dilution and washing buffer. Dry the microplate by tapping it gently on an absorbent paper to eliminate the excess of liquid.. Incubation of Substrate Add 00µL substrate into each well. Incubate for minutes at room temperature (+8 C/+ C), in the dark. 6. Stop of the reaction Add 00µL of H SO (0,M) to each well. 7. Reading Read the optical density of each well at 0nm within 0 minutes after stopping reaction. RESULTS AND INTERPRETATION A. Dosage of TNFα - The OD of the standard should be at least The positive control value should be comprised into the range indicated on the vial label. - Trace the standard curve (polynomial curve), plotting the units of the standard points (pg/ml) along the abscissa (X axis) and the corresponding OD values along the ordinate (Y axis). - The TNFα value can be directly read on the curve. - Samples with values greater than that of standard may be diluted to obtain a more precise result. The number of units should be multiplied by the selected dilution. B. Dosage of - The OD of the standard should be at least The positive control value should be comprised into the range indicated on the vial label. - Trace the standard curve (polynomial curve), plotting the units of the standard points (µg/ml) along the abscissa (X axis) and the corresponding OD values along the ordinate (Y axis). - The value can be directly read on the curve. - Samples with values greater than that of standard may be diluted to obtain a more precise result. The number of units should be multiplied by the selected dilution. Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

15 C. Dosage of anti- - The OD of the standard should be at least The positive control value should be comprised into the range indicated on the vial label. - Trace the standard curve (polynomial curve), plotting the units of the standard points (ng/ml) along the abscissa (X axis) and the corresponding OD values along the ordinate (Y axis). - The anti- value can be directly read on the curve. - Samples with values greater than that of standard may be diluted to obtain a more precise result. The number of units should be multiplied by the selected dilution. CHARACTERISTICS AND PERFORMANCE OF THE TEST Limits of detection / threshold values Estimated on 6 healthy patient samples. Reference material precision The WHO 88/786 International standard for TNFα was diluted at 000pg/mL and tested during the precision tests. Intra-run ( tests in a same assay) Inter-runs ( tests different assays) TNFα (pg/ml) Mean CV (%) Mean CV (%) International WHO 88/786 at 000pg/mL LIMITS Sera of patient treated with Adalimumab or Etanercept, others anti-tnfα, may cross-reacted with test. Limit of detection TNFα Limit of detection Limit of detection Anti- 0 pg/ml 0. µg/ml 0 ng/ml 99 th percentile 9 th percentile 9 th percentile Assay range TNFα Anti- 0 pg/ml pg/ml 0, µg/ml - µg/ml 0 ng/ml - 00 ng/ml Interfering Substances Study LISA-TRACKER Premium ( ) was evaluated to assess potential cross reactivity to other antibodies and interference from serum components (cryoglobulins, rheumatoid factors, heterophilic antibodies, high levels of triglycerides, bilirubin, IgG and/or IgM, and Cq proteins, autoantibodies). No interference was detected. Precision Intra-run ( tests in a same assay) Inter-runs ( tests different assays) Parameters Mean CV (%) Mean CV (%) TNFα (pg/ml) (µg/ml) Anti- (ng/ml) Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

16 REFERENCES Ainsworth MA et al. Tumor necrosis factor-alpha binding capacity and anti-infliximab antibodies measured by fluidphase radioimmunoassays as predictors of clinical efficacy of infliximab in Crohn's disease. Am J Gastroenterol. 008 Apr;0():9-8. Afif W et al.clinical Utility of Measuring and Human Anti- Chimeric Antibody Concentrations in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Am J Gastroenterol 00; 0: 9. Arends S et al. The formation of autoantibodies and antibodies to TNF-α blocking agents in relation to clinical response in patients with ankylosing spondylitis. Clin Exp Rheumatol. 00 Sep- Oct;8():66-8. Baert F et al. Influence of Immunogenicity on the Long-Term Efficacy of in Crohn s Disease. N Engl J Med 00;8:60-8. Bartelds GM et al. Development of antidrug antibodies against adalimumab and association with disease activity and treatment failure during long-term follow-up. JAMA. 0 Apr ;0():60-8. Bendtzen K. Is There a Need for Immunopharmacologic Guidance of Anti Tumor Necrosis Factor Therapies. ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 6, No., April 0, pp Candon S et al. Clinical and biological consequences of immunization to infliximab in pediatric Crohn's disease. Clin Immunol. 006 Jan;8():-9. Choy et al. Efficacy of a novel PEGylated humanized anti-tnf (CDP870) in patients with rheumatoid arthritis : a phase II doubleblinded, randomized, dose escalating trial. Rheumatology 00;:-7. Desroches M et al. Treatment failure with antagonists of TNF-α: mechanisms and implications for the care of patients. Eur. Cytokine Netw., Vol. n, December 00, 6-. Radstake TRDJ et al. Formation of antibodies against infliximab and adalimumab strongly correlates with functional drug levels and clinical responses in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 009;68:79 7. Ram Raj Singh, et al. TNFα blockade in human diseases : mechanisms and future. Clin.Immunol., 008 February ; 6():- 6. Seow CH et al. Trough serum infliximab: a predictive factor of clinical outcome for infliximab treatment in acute ulcerative colitis. Gut. 00 Jan;9():9-. Sparado A et al. Switching from infliximab or etanercept to adalimumab in resistant or intolerant patients with spondyloarthritis: a -year study. Rheumatology (Oxford). 00 Jun;9(6):07-. Steenholdt C, et al. Cut-off levels and diagnostic accuracy of infliximab trough levels and anti-infliximab antibodies in Crohn's disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology, March 0, Vol. 6, N, Pages 0-8. Takeuchi et al. Baseline tumour necrosis factor alpha levels predict the necessity for dose escalation of infliximab therapy in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 0 Jul;70(7):08-. Ternant D et al. An enzyme-linked immunosorbent assay for therapeutic drug monitoring of. Ther Drug Monit., 006 April ; 8():69-7. Van den Bemt BJF et al. Anti-infliximab antibodies are already detectable in most patients with rheumatoid arthritis halfway through an infusion cycle: an open-label pharmacokinetic cohort study. BMC Musculoskeletal Disorders 0. Vetterlein et al. No antibodies to PEG detected in patients treated with certolizumab pegol. Ann Rheum Dis 008;67(Suppl II):6. Wolbink GJ et al. Development of Anti-infliximab Antibodies and Relationship to Clinical Response in Patients With Rheumatoid Arthritis. ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol., No., March 006, pp7 7. DeVries et al. Inefficacy of infliximab in ankylosing spondylitis is correlated with antibody formation. Ann Rheum Dis. 007 Jan;66():-. Edrees et al. Anti-tumor necrosis factor (TNF) therapy in rheumatoid arthritis: correlation of TNF-alpha serumlevel with clinical response and benefit from changing dose or frequency of infliximab infusions. Clin Exp Rheumatol. 00 Jul-Aug;():69-7. Jaminitski et al. The presence or absence of antibodies to infliximab or adalimumab determines the outcome of switching to etanercept. Rheum Dis. 0 Feb;70():8-8. Koren et al. Recommendation on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products. Journal of Immunological Methods, (008) -9. Korswagen LA et al. Venous and Arterial Thromboembolic Events in Adalimumab-Treated Patients With Anti-adalimumab Antibodies. ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 6, No., April 0, pp Krzysiek R et al. Circulating Concentration of and Response to Treatment in Ankylosing Spondylitis: Results From a Randomized Control Study. Arthritis & Rheumatism (Arthritis Care & Research) Vol. 6, No., May, 009, pp Marotte et al. Circulating tumour necrosis factor-alpha bioactivity in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab: link to clinical response. Arthritis Res Ther. 00;7():R9-. Mire-Sluis et al. Recommandation for the design and optimization of immunoassays used in the dectection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Immunological Methods, 89 (00) -6. Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page /8

17 SUMMARY OF METHOD A. Sample Dilution TNFα Anti- / /0 / B. Positive Control Dilution TNFα Anti- / * /0 / The lyophilized positive control should be reconstituted with 00µL of Buffer A then the solution should be diluted with TDL (/). C. TNFα calibration range Rk : the TNFα calibration range should be elaborate with the standard and must be used within the hour after reconstitution. «reconstituted» pg/ml 000 pg/ml 0 pg/ml 6, pg/ml,6 pg/ml 0 pg/ml = = = = = = lyophilized [TNF-CAL] 00µL «reconsti tuted» 00µL 00µL 00µL µL Buffer A [BUF-A] 00µL 00µL 00µL 00µL D. Procedure Reagents Procedure s* Diluted positive controls 00µL / wells Diluted samples Incubation h at room temperature Washing** Wash times with TDL buffer : x 00µL / wells Biotinylated antibodies 00µL / wells (specific reagents) Incubation h at room temperature Washing** Wash times with TDL buffer : x 00µL / wells HRP-Streptavidin 00µL / wells Incubation 0 minutes at room temperature Washing** Wash times with TDL buffer : x 00µL / wells Substrate (TMB) 00µL / wells Incubation minutes at room temperature. Protect from light. Stop solution 00µL / wells * s for the TNFα determination should be prepared extemporaneously. s for and anti- determination are ready to use. ** Dry the microplate by tapping it gently on a towel to eliminate the excess of liquid. Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page 6/8

18 E. Configuration of the assays a. 6 sera for, anti- and TNF assay A Sera Sera Sera 9 Sera Sera Sera 9 6 Sera Sera Sera 9 B Sera Sera Sera 0 Sera Sera Sera 0 Sera Sera Sera 0 C Sera Sera Sera Sera Sera Sera Sera Sera Sera D Sera 6 Sera Sera Sera 6 Sera Sera Sera 6 Sera Sera E Sera 7 Sera Sera Sera 7 Sera Sera Sera 7 Sera Sera F C+ Sera 8 Sera 6 Sera C+ Sera 8 Sera 6 Sera C+ Sera 8 Sera 6 Sera G Sera Sera 9 Sera 7 Sera Sera Sera 9 Sera 7 Sera Sera Sera 9 Sera 7 Sera H Sera Sera 0 Sera 8 Sera 6 Sera Sera 0 Sera 8 Sera 6 Sera Sera 0 Sera 8 Sera 6 assay anti- assay TNFα assay b. sera for, anti- and TNF assay A 6 B C D E F C+ C+ C+ G Sera Sera Sera H Sera Sera Sera assay anti- assay TNFα assay Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page 7/8

19 c. 6 sera for anti- determination A Sera Sera Sera 9 B Sera Sera Sera 0 C Sera Sera Sera D Sera 6 Sera Sera E Sera 7 Sera Sera F C+ Sera 8 Sera 6 Sera G Sera Sera 9 Sera 7 Sera H Sera Sera 0 Sera 8 Sera 6 anti- assay SYMBOLS USED EC Declaration of conformity ELISA Test Number of test Consult Instructions Catalogue number Lot Number Expiry Date In Vitro Diagnostic Device Temperature limitation Biological hazard Contains sodium azide Reconsitute with Office -6 bld de Beaubourg, Actipôle Bat, Croissy Beaubourg 77 Marne la Vallée Cx France Tél : Fax : Internet : Product Insert, LISA-TRACKER Premium, LTI00, Page 8/8

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