THÈSE présentée par :

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1 UNIVERSITÉ DE STRASBOURG ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE U1121 ET U1110 THÈSE présentée par : Roxane SAAD (ALLES) soutenue le 27 novembre 2013 pour obtenir le grade de : Docteur de l Université de Strasbourg Discipline/Spécialité : Aspects Moléculaires Et Cellulaires De La Biologie Option Biologie Cellulaire Et Virologie Développement de nouveaux nanovecteurs pour les thérapies anti-hcv/hcc THÈSE dirigée par : Pr. Joëlle Ogier Pr. Thomas F. Baumert PU-PH, Université de Strasbourg PU-PH, Université de Strasbourg RAPPORTEURS : Dr. Sylvie Bégu MCU, HDR, Université de Montpellier 1 Pr. Philippe Barthélémy PU, HDR, Université Bordeaux Segalen EXAMINATRICE : Dr Béatrice Heurtault MCU, HDR, Université de Strasbourg SUPERVISEUR : Pr Florent Meyer PU-PH, HDR, Université de Strasbourg

2 Tomberseptfois,sereleverhuit(Proverbejaponais) "2"

3 Remerciements Jetiensdansunpremiertempsàremercierlesmembresdemonjurydethèse,quime font l honneur de juger mon travail. Merci au Docteur Sylvie Bégu et au Professeur Philippe Barthélémy d avoir accepté d être mes rapporteurs. Merci également au Docteur Béatrice Heurtault,quiadéjàsuivimontravaillorsdemaprésentationdemi"parcours,etquiaacceptéà nouveaud examinerdemontravail. Pendant les trois années qu a duré mon doctorat, j ai été accueillie dans deux laboratoires.merciauprofesseurthomasbaumert,directeurdel unitéinsermumr1110de m avoiraccueilliedanssonlaboratoire,maiségalementdem avoirchoisiecommedoctorante. MerciauProfesseurJoëlleOgier,appartenantàl unitéinsermumr1121,d avoiracceptéd être ma co"directrice de thèse. Je tiens également à remercier les directeurs successifs de l unité INSERMUMR1121,leDocteurJean"ClaudeVoegel,puisleProfesseurPierreSchaaf,dem avoir donnéuneplacedansleurséquipes,ainsiqueleprofesseurflorentmeyer.mercipourtonsuivi ettonencadrementtoutaulongdecestroisans. Merci aux membres de l U1121 pour votre aide et vos discussions: merci à Christine, Damien,pourvosconseilstechniquesetvotreaide.Merciauxanciensetnouveauxdoctorantset membresdel unitéavecquij aieul occasiondediscuteravecplaisir,mêmesiletempspasséau seindecetteunitéaétérelativementcourtaufinal :Morgane,Florence,Mathilde,Christophe, Julien,Christian,Christiane,Vincent,Géraldine,Armelle,Florian,Hayriye,Philippe,Dominique, Fabienne,Bernard,Engin Merciauxmembresdel U1110,avecquij aieul occasiondepasserdavantagedetemps. Mercipourvotresoutien,votreaideàtousmoments.Mercipourlesmotsfléchésdumidi,les discussionsen309oudanslescouloirsmerciàlaetitia,alizé,isabel,marine,marina,laura, Sarah,Charlotte,Mathieu,Emilie,Lamine,Rajeev,Dan,Nauman,CatherineF.,Joachim,Mirjam, Fei,Bin,Tao, Merciàl équipetechniqueetadministrative Onneseraitriensansvotretravail efficace:mercidominique,sigis,jérémy,patricia,nicolas,richard,catherinec.,etannemerci CatherineS.,Christine,Eric,Mirjam,d avoirfaitlerelaientrelesdeuxunités,etdem avoiraidé lorsquecelaétaitnécessairemercipourvosconseilsetvotreencadrement Merciégalementà Halima,quej aicroiséuncertainnombredefois Vousvenieztravailleretjerepartais Merci pourvosdiscussions,caatoujoursétéunplaisir Merci également à l équipe d enseignement d immuno Ca a été un vrai plaisir de travailleràvoscôtésmercisylvieetfreddem avoiraccueilliemerciàmescollègues,paul, Julie,Samuel,Benjamin,Hélène,j aieuplaisiràpartagerlessallesdetpavecvous "3"

4 Merciàtousceuxquej aipuoublierdeciter,etquej aieul occasiondecroiseraucours decestroisans Merciàtousmesamisquim ontsoutenupendantcestroisannées,qu ilsaientétéprès ouloin,maistoujoursprésentspourunpetitmotd encouragement,pourmeremonterlemoral, oupourcomparernosgalèresmerciàmestémoins,célineetyara,mercimarine,merciayman etmarina,george,jess,manu,siham,etrafael,mercipournosdiscussionsaumilieudelanuit pendant ma rédaction ^^ Merci également Francis et Michel, pour cette très agréable parenthèsemusicale,quim afaitbeaucoupdebien,mêmesiellenefutqu Ephémère;") UnénormeMerciàmesparentsetmonfrère,quim ontsoutenueetencouragéetoutau longduchemin.mercipourvotreamouretvotreconfianceenmoi,etmercid avoircruenmoi Merciégalementàmesgrands"parents Cettepériodeamarquélafind unegénération,puisque trois d entre vous ont disparu en un peu plus d un an Merci à vous, Pierre, Christiane, et Thérèse,etàtoiGilbert,quinousaquittéilyalongtempsdéjà Sansvous,jeneseraipaslà Merciàtoi,Christian,également Tueslepremierquim adonnéenviedefairedelarecherche, etàm avoiraccueilliedanstonlaboratoire Lesmeilleursstagesquej aifaits Enfin, merci à toi mon amour, mon mari Tu as été là tout le long du parcours, m encourageant,mepoussant,meconsolant,t énervantàmaplacequandtumetrouvaistrop peuréactive;")jen auraispastenujusqu auboutsanstoi.tueslevraichercheurpourmoi,un modèlequej admire "4"

5 Table&des&matières REMERCIEMENTS) 3 TABLE)DES)MATIERES) 5 TABLE)DES)ILLUSTRATIONS) 7 ABREVIATIONS) 8 INTRODUCTION) 10 I. ARN)INTERFERENCE) Découvertedel ARNinterférence Mécanismedel ARNinterférence Potentieldel ARNinterférence QuellesdifférencesentresiRNA,shRNA?Quechoisir? LimitesetdéfidessiRNAthérapeutiques Modificationschimiques:améliorationdelastabilitéetdelacirculationdessiRNA TransportdessiRNA 28 II. VECTORISATION)DES)SIRNA) AdministrationdessiRNA Entréedesparticulesdanslescellules Quelssontlesparamètresimportantsàprendreencomptelorsduchoixduvecteur? Fonctionnalisation Différentstypesdevecteurs:avantagesetinconvénients Unvecteurdechoix:lesnanoparticulesdephosphatedecalciumenrobées 48 III. MODELES)UTILISES) Modèled infectioninvitro:virusdel hépatitec Carcinomehépatocellulaire(HCC)etautrestumeurs 66 OBJECTIFS) 71 MATERIEL)ET)METHODES) 73 I. MATÉRIEL) Polyéthylènimine(PEI) sirna Plasmides 75 "5"

6 4. Lignéescellulaires 76 II. METHODES) Préparationdesnanoparticules Caractérisationphysico"chimiquedesnanoparticules EvaluationdelacytotoxicitédesCPnp PréparationdesparticulesviralesHCVcc Expérimentationsin#vitro#«classiques» Techniquesd analyse Expérimentationin#vitroen3Detanalyse Expérimentationin#vivo 96 RESULTATS) 99 I. CARACTERISATION)DES)NANOPARTICULES)DE)PHOSPHATE)DE)CALCIUM)DE)FORMULATION) CPNP(SIRNA/PEIY) 2) ProductionetcaractérisationdesCPnp(siRNA/PEIY) Efficacitéd interférencearnin#vitro Efficacitéd interférencearnin#vivo Biodistributionin#vivo Conclusion 103 II. PREUVE)DE)CONCEPT):)EVALUATION)DE)LA)FORMULATION)CPNP(PEIPYR/SIRNA) 2,5)SUR)DES) MODELES)D HEPATITE)C) ConstructionetcaractérisationdesCPnp(PEIPyr/siRNA) Entréecellulaire,etlibérationdessiRNA ToxicitédesCPnp Inhibitiondel infectionparlehcvparlescpnp:preuvedeconcept Inhibitiondel expressionprotéiquedefacteurshôtesetdel infectionviraleassociée 116 III. PREUVE)DE)CONCEPT):)CPNP(PEIPYR/SIRNA) 2.5)ET)MODELES)TUMORAUX) CPnpetexpressiongéniquein#vitroenculturecellulairebidimensionnelle Inhibitiondelacroissancecellulaireparl interférencearn EvaluationspréliminairesdesCPnp(PEIPyr/siRNA) 2.5#in#vivo 136 CONCLUSIONS) 143 BIBLIOGRAPHIE) 147 ANNEXES) 165 ) "6"

7 Table&des&illustrations INTRODUCTION) IllustrationI"1:Modèlepossibled interférencegénétiquemédiéepardsrnachezc.#elegans...12 IllustrationI"2:VoiesdesARNinterférents...14 IllustrationI"3:siRNAetimmunité...19 IllustrationI"4:ModificationschimiquesdessiRNA...26 IllustrationII"1:Représentationdel entréedesnanoparticulesdanslescellulesnon"phagocytes...30 IllustrationII"2:Impactdelagéométriedesparticulessurleratiosurface/volume...34 IllustrationII"3:DifférentstypesdevecteursdesiRNA...39 IllustrationIII"1:Diagrammedel évolutiondel hépatitec...50 IllustrationIII"2:ReprésentationschématiquedelaparticuleduHCV...52 IllustrationIII"3:OrganisationgénétiqueetprotéinesduHCV...53 IllustrationIII"4:CycleviralduHCV...57 IllustrationIII"5:ModificationsanatomiquesetcellulairesconduisantauHCC...67 IllustrationIII"6:Productiondesphéroïdes...69 MATERIEL)ET)METHODES) IllustrationI"1:StructureduPEITyrosine(A)etduPEITyrosine"Galactose(B)...73 IllustrationI"2:StructureduPEIPyridine...73 IllustrationII"1:ReprésentationschématiquedelaproductionetenrobagedesCPnp...78 IllustrationII"2:Structureduvertd indocyanine...79 IllustrationII"3:Structuredel alizarinecomplexone...79 IllustrationII"4:Microscopieélectroniqueentransmission...83 IllustrationII"5:Microscopeconfocal...84 IllustrationII"6:Modèlesd infectionviraleetdetransfectionenpré"etenpost"infection...89 IllustrationII"7:qRT"PCR...92 IllustrationII"8:Cytométrieenflux...94 IllustrationII"1:Représentationschématiquedumodèledepré"infection IllustrationII"2:Représentationschématiquedumodèledepost"infection "7"

8 ABREVIATIONS ABRÉVIATIONS apoe, apob : apolipoprotéine E ou B aunp : gold nanoparticles, nanoparticules d or bp : base pair, paires de bases BET : bromure d éthidium BLI : bioluminescence BRG : Balb/c Rag2 -/- γc -/- BSA : Bovine serum albumine, albumine sérique bovine CHS : chalcone synthase CLD : chronic liver diseases, maladies hépatiques chroniques CLDN1 : claudine-1 CMV : cytomégalovirus CNT : carbon nanotubes, nanotubes de carbone CPnp : Calcium phosphate nanoparticle, nanoparticules de phosphate de calcium CPP : cell-penetrating peptide, peptide pénétrant les cellules CSC : cellules souches cancéreuses CT : computerized tomography, tomographie computée CypA : cyclophiline A DAA : direct acting antiviral, substances antivirales directes DAPI : 4',6'-diamidino-2-phénylindole DLS : Dynamic light scattering, Granulomètre à diffusion en dynamique de la lumière DMEM : Dulbecco s Modified Eagle s Medium, milieu de Eagle modifié par Dulbecco DMSO : Diméthylsulfoxyde dsrna : double stranded RNA, ARN double brin EEA1 : early endosome antigen 1, antigène 1 des endosomes précoces EGFR : epidermal growth factor receptor, récepteur du facteur de croissance épidermique EMC : extra-cellular matrix, matrice extracellulaire EMSA : electromobility shift assay, expérience de gel retard par électromobilité EphA2 : récepteur A2 de l ephrine EPR : enhanced permeability and retention, perméabilité et rétention augmentées FCS : Fetal Calf Serum, Sérum de veau foetal GAG : glycosaminoglycanes GFP : green fluorescent protein, protéine verte fluorescente HBV : hepatitis B virus, virus de l hépatite B HCC : hepatocellular carcinoma, carcinome hépatocellulaire HCV : hepatitis C virus, virus de l hépatite C HCVcc : particules recombinantes du HCV adaptées en culture cellulaire HCVpp : pseudoparticules du HCV HDL : high density lipoproteins, lipoprotéines de haute densité HIV : human immunodeficiency virus, virus de l immunodéficience humaine HS : héparanes sulfates HSC : hematopoietic stem cells, cellules souches hématopoiétiques HTA : host targeting agents, agents ciblant l'hôte i.p. : intra-péritonéal i.v. : intraveineux ICG : indocyanine green, vert d indocyanine IFNα : interféron alpha IFNβ : interféron bêta IFNγ : interféron gamma IL-2Rγ : γ-chain of the receptor for IL-2, chaîne gamma du récepteur à l IL-2 IL6 : interleukine 6 IL12 : interleukine 12 IRES : internal ribosome entry site, site d entrée interne du ribosome IRF3, IFR5, IFR7 : IFN regulatory factor 3,5 and 7, facteurs régulateurs de l IfN 3, 5 et 7 IRM : imagerie de résonance magnétique LDL : low density lipoproteins, lipoprotéines de faible densité LDLR : low density lipoproteins receptor, récepteur des lipoprotéines de faible densité LNA : locked nucleic acid, acide nucléique verrouillé LPS : lipopolysaccharide "8"

9 ABREVIATIONS LSPR : localized surface plasmon resonance, résonance plasmonique de surface localisée MAP3K : MAPK kinase kinases MAPK : mitogen-activated protein kinase, kinase activée par les mitogènes MEM : Minimum Essential Medium, milieu minimum essentiel mirna : microrna MLV : murine leukemia virus, virus de la leucémie murine mrna : messenger RNA, ARN messager MSN : mesoporous silica nanoparticles, nanoparticules de silice mésoporeuse MTT : bromure de 3 (4,5 diméthylthiazol 2 yl) 2,5 diphényltétrazolium nab : neutralizing antibodies, anticorps neutralisants NF-κB : Nuclear factor κb, facteur nucléaire de NS : non-structural protein, protéine non-structurale NTBC : 2-(2-nitro-4-trifluoro-methylbenzoyl)-1.3-cyclohexanedione OCLN : occludine PBS : Phosphate buffered saline, tampon phosphate salin PE : phycoerythrine PEG : polyéthylène glycol PEI: poly(éthylène imine) PEIPyr : PEI-Pyridine PEIY : PEI-Tyrosine PET : positron emission tomography, tomographie à émission de positrons PFA : Paraformaldéhyde PHH : primary human hepatocytes, hépatocytes primaires humains PI4KIIIα : phosphatydilinositol 4-kinase III alpha polyhema : polyhydroxyéthylméthacrylate qrt-pcr : quantitative real time polymerase chain reaction, réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel Rag2 : recombination activating gene 2, gène d activation de la recombinaison 2 Ras : rat sarcoma RdRp : RNA dependant RNA polymerase, polymérase à ARN dépendante de l ARN RE : réticulum endoplasmique REG : reticulum endoplasmique granuleux RES : système réticulo-endothélial RFP : red fluorescent protein, protéine fluorescente rouge RISC : RNA-induced silencing complex, complexe d interférence ARN induit par l ARN RLU : Relative Luminescence unit, unité relative de luminescence RNAi : ARN interférence RPMI 1640 : Roswell Parc Memorial Institute RTK : récepteurs à tyrosine kinase s.c. : sous-cutané SCID : Severe Combined Immunodeficiency, Immunodéficience combinée sévère SDS : Sodium Dodecyl Sulfate se1/se2 : forme soluble de E1 et E2 shrna : short hairpin RNA, petit ARN en structure tige-boucle sirna : short interfering RNA, petit ARN interférant SOC : Standard of care, traitement courant SPECT : single-photon emission computerized tomography SPIO : supramagnetic iron particles, particules de fer supramagnétiques SR-BI : récepteur scavenger de classe B de type I ssrna : single stranded RNA, ARN simple brin SV40 : simian virus 40, virus simien 40 SVR : sustained virological response, réponse virologique soutenue TAF : tumor associated fibroblasts, fibroblastes associés aux tumeurs TCID50 : 50 % tissue culture infective dose, dose permettant d infecter 50 % de la culture tissulaire TEM : transmission electronic microscopy, microscopie à transmission électronique TGFβ : Transforming growth factor β, facteur de croissance transformant β TLR : Toll like receptor TNFα: tumor necrosis factor, facteur de nécrose tumoral upa : urokinase plasminogène UTR : untranslated regions, régions non traduites VEGF : vascular endothelial growth factor, facteur de croissance de l endothélium vasculaire VLDL : very low density lipoproteins, lipoprotéines de très faible densité VLP : virus-like particles "9"

10 INTRODUCTION Introduction Malgré des avancées impressionnantes ces dernières années en médicine, et de nouvellesthérapiesdeplusenpluspoussées,denombreuxprogrèssontencorenécessaires.en virologie,parexemple,denombreusesinfectionsviralesrestentencoresanstraitementefficace, etlestraitementsexistantsprésententd importantseffetssecondairesetcontre"indications.de plus,ceux"cinepermettentgénéralementquedemaintenirl infectionàunniveaubasal,sans pour autant pouvoir éradiquer le virus. De même, en cancérologie, les traitements possibles, bienquetrèsefficaces,sontpeunombreux,limitésàlachimiothérapie,laradiothérapie,oula chirurgie. La majorité de ces techniques ne sont pas ciblées, et résultent en des effets secondairesimportantssurlestissussainsetl organismedespatients. En réponse à cette demande d alternatives thérapeutiques, différents systèmes d acheminementdemoléculessesontdéveloppés.unpanelcroissantdenanoparticulessonten cours d étude, produits à partir de matériaux aussi divers que les lipides, les métaux, ou les polymères, présentant tous des avantages et des inconvénients. L essor de ces vecteurs nanométriques a également redonné un second souffle à un outil thérapeutique des plus intéressants:l ARNinterférence.Eneffet,malgrédesrésultatsexpérimentauximpressionnants, l utilisation de cette technique est fortement limitée par la fragilité des molécules thérapeutiques,lessirna,etparleurfaiblerémanence.l utilisationdesnanovecteurspermet deprotégerlessirna,etdeleslibérerdefaçonprogressive,entraînantuneaugmentationdela rémanence d action de ceux"ci.la combinaison de ces deux outils laisse entrevoir de nombreusesperspectivesthérapeutiques,etlasuppressiondesécueilsayantempêchél emploi del ARNinterférencejusqu àprésent. Aucoursdesprochainespages,nousévoquerons,lesdomainesdesnanoparticulesetde l interférencearn.ceux"ciprésententdenombreusesapplicationsthérapeutiquespotentielles, illustrées dans ce travail par le développement de nanovecteurs d ARN interférents à visées antivirale(virusdel hépatitec)etanti"tumorale(carcinomehépatocellulaire).cescaspratiques serontl occasionpournousdetesterl impactdel outilthérapeutiquequenousavonschoiside développer.celui"ci,associantnanoparticulesetarninterférence,promet,commelemontrent lesrésultatsobtenus,d avoirunimpactnonnégligeabledansuncertainnombrededomaines médicaux. "10"

11 INTRODUCTION I. ARN)interférence) 1. Découverte)de)l ARN)interférence) L ARNinterférence(RNAi)aétédécouverteetdécritepourlapremièrefoisen1990,par Napoli,Lemieux,etJorgensen 1. Lors de l étude de l implication de la chalcone synthase (CHS) danslabiosynthèsedel anthocyanine(quidonnesacouleurauxpétunias),ilsontsurexprimé cetteenzymedanslesfleursgrâceàl introductiond untransgènecodantunechsexogène.le résultatsurprenantdecetteexpérience 42%despétuniasontblanchi,etlaconcentrationde CHS totale 50 fois inférieure à la concentration sauvage leur a permis d envisager que le transgènepuisseêtreunco"suppresseurdugèneendogène.lemêmephénomèneaétéobservé parromanoetmacinoen1992chezneurospora#crassa 2. En 1993, Lee et# al. progressent vers la compréhension de ce mécanisme. En effet, ils montrentquelin84,unpetitarndec.#elegans,participeaubondéveloppementdunématode ensefixantàunarnmessager(mrna)cible,cequiempêchealorssatraduction 3.Alafindes années1990,fire,melloet#al. vontpourlapremièrefoisexpliquerl atténuationdegènes,en émettantl hypothèsequelemécanismeobservén estpasbasésurunarnsimplebrin(ssrna), maissurundoublebrind ARN(dsRNA).Pourvérifiercettehypothèse,ilsontcomparél effetde ssrnaetdedsrnasurl expressiondugèneunc822chezc.#elegans 4,5.QuelesssRNAsoientsens ou antisens, leurs effets étaient entre 10 et 100 fois plus faibles que ceux du dsrna correspondant. De manière intéressante, l injection de ssrna sens, puis antisens, ou inversement, permettait de restaurer l efficacité d atténuation du gène, ce qui a permis de suggérerquelesdeuxtypesdessrnapeuvents hybriderin#vivoafindeformerledsrna.les travaux de Fire et Mello ont été récompensés en 2006 par le Prix Nobel de Physiologie et Médecine«pourleurdécouvertedel ARNinterférence gene#silencingpararndoublebrin». Au cours des deux années qui ont suivi, plusieurs équipes ont cherché et constaté la présence d intermédiaires ARN dans le mécanisme 6. En effet, des molécules de 21 à 25 nucléotides,lespetitsarninterférents("small#interfering#rna"ousirna),complémentairesdu mrna cible, ont été isolés. Il a été montré que l association mrna/sirna entraîne la dégradationdutranscritcorrespondant. En2000et2001,leséquipesdePasquinellietElbashirontmontréque,nonseulement lessirnaetmirnanesontpasuneexclusivitédec.#elegans,puisquedessirnaontégalement étéretrouvéschezleschampignons,plantes,etinsectes 7,maisquecemécanismeRNAiestaussi présent chez les vertébrés 8. Cela semblait de prime abord peu plausible, l immunité innée de ceux"ci, et notamment des mammifères, engendrant une réponse antivirale interféron "11"

12 INTRODUCTION importante lors de l introduction d ARN dans les cellules. L ARNi est donc un système très ancien,dontlamiseenplaceremonteàunepériodedel évolutionprécédantlaséparationdes animaux des végétaux. Les travaux de Elbashir ont également montré qu il était possible d utiliser des sirna synthétisés chimiquement et imitant les sirna natifs pour inhiber la traductiondemrnaciblesdanslescellulestransfectées.apartirdecepoint,l interférencearn estdevenueunetechniquedechoix,notammentpourlesétudesdegénomiquefonctionnelle. Genetics: Montgomery et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) )Illustration)IY1):)Modèle)possible)d interférence)génétique)médiée)par)dsrna)chez)c.#elegans.) complex with a (hypothetical) protein or ribonucleoprotein (Source):)Montgomery)et#al.,) complex )) modification (e.g., by adenosine deaminase), or the recruitment or L interférence ARN a notamment été longuement étudiée chez la drosophile. Cela a removal of specific RNA-binding proteins. Whatever the mechanism of this initial interaction, our data suggest a rapid subsequent degra- permisladécouverted unensembleprotéiquecomplexeentrantenjeulorsdeladivisiondu dation of the entire targeted transcript. The secondary degradation 7, doublebrindel ARNinterférant.Cecomplexeaéténommé"RNA8Induced#Silencing#Complex",ou RISC 9.L'endoribonucléaseDicer,quantàelle,aétédécriteparl équipedebernsteinen2001 thought to be responsible for many transient cosuppression 10. FIG. 4. PossiblemodelfordsRNA-mediatedgeneticinterference in C. elegans. Uponintroductionintothecell,dsRNAisproposedto that allows unwinding of an arbitrary segment of the duplex. The complex would then search by homology for corresponding segments of cellular RNA. Recognition of cellular RNAs would be followed by aprocessmarkingthetargetrnafordegradation.possible marking mechanisms include direct cleavage of the target RNA, covalent machinery could involve a combination of components specific to RNA interference and or more general catabolic mechanisms. corresponding cellular gene (34). The first mechanism is effects, whereas the RNA-dependent methylation has been proposed to play a role in producing slower (but potentially more stable) changes in gene expression. For all of the genes we tested in C. elegans, RNAi effects were not heritable; nonetheless, Mello and colleagues (35) have observed a multigenerational effect for a small number of genes. It will be interesting to determine whether dsrna-triggered RNA decay plays a role in these processes, and if so how the interference state might become heritable for a subset of genes. We thank G. Seydoux, S. Dymecki, S. Strome, T. Blumenthal, B. Meyer, C. Mello, B. Kelly, S. Kostas, K. Liu, L. Timmons, J. Hsieh, B. Harfe, M. Hsu, J. Fleenor, and S. Parrish for helpful discussions. We also thank M. Wallenfang, G. Seydoux, and J. Priess for providing some of the clones used in this study. This research was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences ( R01-GM37706 to A.F. and GM17164 to M.K.M.). 1. Proud, C. (1995) Trends Biochem. Sci. 20, Jacobs, B. L. & Langland, J. O. (1996) Virology 219, Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Drive Mello, C. C. (1998) Nature (London) 391, Montgomery, M. K. & Fire, A. (1998) Trends Genet. 14, Matzke, M. A. & Matzke A. J. (1998) Cell Mol. Life S Nellen, W. & Lichtenstein, C. (1993) Trends Biochem Brenner, S. (1974) Genetics 77, Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D. & Ambros, V. EMBO J. 10, Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. & Pras (1994) Science 263, Draper, B. W., Mello, C. C., Bowerman, B., Hardin, J. & J. R. (1996) Cell 87, Jantsch-Plunger, V. (1993) Ph.D. thesis (Univ. of Vien enna, Austria). 12. Benian, G., Kiff, J., Neckelmann, N., Moerman, D. & Wat R. (1989) Nature (London) 342, Benian, G., L Hernault, S. & Morris, M. (1993) Geneti Wagner, R. W. & Sun, L. (1998) Nature (London) 391, Seydoux, G. & Fire, A. (1994) Development (Cambridge 120, Seydoux, G. & Fire, A. (1995) in Caenorhabditis elegans: M Biological Analysis of an Organism, Methods in Cell Biolo Epstein, H. F. & Shakes, D. C. (Academic, San Diego), V pp Harfe, B. & Fire, A. (1998) Development (Cambridge, U.K Patel, N. H. & Goodman, C. S. (1992) in Nonradioactive L and Detection of Biomolecules, ed.kessler,c.(springer,b pp Selker, E. U. (1997) Trends Genet. 13, Bass, B. L., Nishikura, K., Keller, W., Seeburg, P. H., E R. B., O Connell, M. A., Samuel, C. E. & Herbert, A. (199 3, Fire, A., Albertson, D., Harrison, S. W. & Moerman, D. G. Development (Cambridge, U.K.) 113, Gaudet J., VanderElst, I. & Spence, A. M. (1996) Mol. Bi 23. Doniach, T. & Hodgkin, J. A. 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13 INTRODUCTION 2. Mécanisme)de)l ARN)interférence) Lemécanismed interférencearnestdéclenchélorsqu undsrnaexogèneestintroduit dans le cytoplasme de la cellule. Suite à cela, une endonucléase de la famille des RNaseIII, appelée Dicer, identifie le dsrna et le clive en fragments doubles brins de 21 à 23 paires de bases,avecungroupemonophosphateen5 etundinucléotidesortanten3 8.CeduplexeRNA estappelésirna. Dicer contient généralement un domaine hélicase/atpase, un domaine PAZ (Piwi Argonaute Zwille), deux domaines de type RNaseIII, et un domaine de liaison au dsrna 10. L extrémité sortante en 3 est caractéristique de l activité RNaseIII. La distance entre les domainespazetrnaseiiidéterminelatailledessirnaproduits.dicerlivreensuitelesirnaà RISC. La longueur du duplex sirna, ainsi que les extrémités distinctives sont des caractéristiquesnécessairespourlareconnaissanceefficaceetl intégrationdansrisc 9.Lecœur derisc,ainsiqueleprincipalexécuteurdel inhibitiond expressiongéniquemédiéeparrnai est la protéine Argonaute. Il existe quatre protéines Argonaute chez l Homme (AGO1"4), et l inhibitiond expressiongéniqueparlessirnaesteffectuéviaago2. PourengendreruneinterférencemédiéeparsiRNA,AGO2doitéjecterlebrinpassager, puis entreprendre différents cycles de reconnaissance, de clivage, et de libération du mrna cible,tandisquelebringuiderestelié,servantdeco"facteur.laséparationdesdeuxbrinsd ARN se fait grâce à une étape ATP"dépendante. Des études structurales ont révélé certains mécanismesnécessairesàl activitédeago2.ago2possèdetroisdomainesfonctionnels,paz, MID,etPIWI,cedernier,adoptantuneconformationdetypeRNaseH,fournitl énergieàrisc pour son activité de «débitage» 11. Lors du chargement de RISC, des évidences structurales suggèrent que les extrémités caractéristiques des sirna ont des fonctions d ancrage: le dinucléotideen3 estspécifiquementreconnuparledomainepazd Argonaute.Cetteextrémité sortanteplongeprofondémentdanslapochehydrophobiquedudomaine,danslaquellelabase du nucléotide terminal s associe à un cycle aromatique de l un des nombreux résidus aromatiquesquibordentlapoche.pendantcetemps,legroupephosphateen5 s insèreentre lesdomainesmidetpiwi,seliantàunionmagnésium,lui"mêmecoordonnéeàl extrémitéc" terminaledelaprotéine.concernantlasélectiondubringuide,lesdonnéesthermodynamiques suggèrent qu Argonaute sélectionne le brin possédant l extrémité 5 la moins stable thermodynamiquement,tandisquelebrinpassagerestclivépourentraînersonéjection. Une fois le brin guide complexé à RISC, celui"ci identifie les mrna qui lui sont complémentairesdanslecytoplasme.lasous"unitéderisc,argonaute,possédantuneactivité endonucléase, va se charger de réaliser un clivage du mrna cible en un site unique. Les "13"

14 INTRODUCTION fragments résultants, déstabilisés, sont alors totalement dégradés par les mécanismes endogènesnaturels.uncomplexeriscactivéestcapablededégraderdesmilliersdemolécules cibles. LamachinerieRNAipeutégalementêtremiseenmarchepardescourtsARNendogènes, appelésmicrorna(mirna) 12. Après une étape, réalisée dans le noyau, destinée à générer les pre"mirna à partir de leurs précurseurs pri"mirna, grâce à une enzyme de type RNase III, Drosha,ceux"cisontexportésdanslecytoplasme,etclivésparDicerafind obtenirlesmirna possédantlesmêmesstructuresterminalesquelessirna.silesmirnapeuventparfoisréguler leursciblesdelamêmemanièrequelessirna,leurmoded actionprincipaldiffère.eneffet,ces molécules ne sont que partiellement complémentaires à leurs cibles mrna, et vont principalementengendreruneinterférencegéniqueenopérantunerépressiontraductionnelle enaval,ainsiqueladégradationdesmrnapardéadénylation. Mechanism of RNAi (part 3) mirna Pol II/III Drosha Pol II/III shrna pri-mirna pre-mirna Exportin 5 shrna nucleus cytoplasm NPC Dicer sirna RISC 3 UTR Ribosome mrna RISC 3 UTR mrna A leading strand passenger strand RISC RISC mrna B Illustration)IY2):)Voies)des)ARN)interférents) (Source):)Jürgen)Wittmann,)Center)University)of)ErlangenYNürnberg)) Enfin,untroisièmetypedemoléculespeutactiverlamachinerieRNAi:lesshorthairpin RNA(shRNA).Ceux"cipeuventêtresynthétisésdanslacellulegrâceàuneproductionmédiée par un plasmide ADN, qui peut lui"même être empaqueté dans un vecteur rétroviral ou lentiviral.ilsconsistentendeuxséquencesarncomplémentairesde19à22bpreliéesparune courte boucle de 4 à 11 nucléotides, formant une structure en épingle à cheveux similaire à cellesdesmirna.leursynthèseàpartirduplasmideadnestdépendantedupromoteurchoisi, etpeutégalementêtreinductible,afindesélectionnerletypedecellulesexprimantleshrnain# vivo par exemple. Une fois transcrits, les séquences shrna sont exportées du noyau vers le cytosol,oùellessontreconnuespardicer,quivacliverlesshrnaenduplexessirna.lasuitedu mécanismeestidentiqueàceluidessirna.commetouteséquenceplasmidique,lesshrnasont capablesdes intégreràl ADNdelacellulehôte,etpermettentainsid obtenirdeslignéesstables présentantuneinterférencearncontinuesurungèneparticulier. "14"

15 INTRODUCTION 3. Potentiel)de)l ARN)interférence) LapuissancedelaRNAitientaufaitquelamachinerieendogèned interférencegénique peutêtredétournée afinderégulerartificiellementn importequelgèned intérêt.eneffet,en théorie, des sirna peuvent être générés pour tout gène à partir de son seul ARNm. Ce fort potentielafaitdelatechniquedernaiunedesstratégiesfavoritespoursupprimeruneactivité génique dans les cellules de mammifères. De plus, cette technique peut potentiellement être utilisée pour développer des thérapies pour un vaste éventail de maladies humaines, qu elles soientcauséesparunouquelquesgènes,commelesmaladiesgénétiques.l ARNinterférence pourraitégalementveniràboutd infectionsvirales,depathologiesautoimmunes,ouencorede cancers 13. Dansdenombreuxcas,notammentpourlescancers,etgrâceauxavancéesdansle domaine du séquençage, il serait possible d associer ce formidable outil à des cibles très précises, permettant ainsi de mettre en place une thérapie personnalisée et ciblée, et donc d augmenterd autantleschancesdesuccèsdutraitement. Lors de la conception d un traitement, la puissance d action de celui"ci est très importante. C est pourquoi l ARN interférence surpasse largement les autres technologies baséessurlesacidesnucléiquesantisens.eneffet,étantdonnéqu unbringuidepeutêtreutilisé pourcliverungrandnombred ARNm,aveclebondéclencheur,l ARNiprésenteuneefficacité surprenante. L efficacité de cette méthode peut cependant varier de manière importante, un grand nombre de facteurs étant impliqué. Si tous les paramètres ne sont pas encore bien délimités à l heure actuelle, il est clair que le design des sirna (notamment leur stabilité structurale), l accessibilité de la cible, ou encore d autres caractéristiques structurales, mais égalementladuréedevieetle«turn"over»delaprotéinecibléesontàprendreencompte. "15"

16 INTRODUCTION 4. Quelles)différences)entre)siRNA,)shRNA)?)Que)choisir)?) sirna 14 # LessiRNAsynthétiséschimiquementsontlaformelaplussimpledeRNAi.Cesontdes réactifs directement utilisables, qui ne nécessitent pas de manipulation particulière avant emploi. C est la méthode la plus rapide pour inhiber une expression génique spécifique. La synthèsedessirnapeutassezaisémentêtreréaliséeengrandesquantités.deplus,lessirna peuventêtremarquésparunfluorochrome,ouencoremodifiéschimiquement,afind améliorer leur stabilité. Enfin, il est plus facile de contrôler la quantité de sirna utilisé qu avec une approche vectorielle. Ce contrôle théorique de la quantité permet de minimiser les effets off" target et les effets non spécifiques. Un autre avantage de cette technique est qu il n est pas nécessairequelessirnasoientcaptésparlenoyaupourfaireeffet,contrairementauxshrna. Deplus,plusieurssiRNApeuventêtreutilisésenmêmetemps,afind augmenterleurpotentialité d action,maisilestindispensabledetesterchaquesirnaindividuellementetleursinteractions lorsd essaiscliniquesavantdepouvoirlesutiliserdemanièreconjointe. Comme nous le verrons plus loin, l un des plus importants obstacles à l obtention de RNAiefficaceaveclessiRNAestladifficultédetransfectiondenombreuxtypescellulaires,ainsi queladuréelimitéeettransitoiredeseffetsdessirnaaprèsleurtransfection.danslecasd une utilisationthérapeutiqueàlongterme,ilseranécessairededoserrégulièrementlessirnapour s assurerdumaintiendel efficacitédutraitement.deplus,cesmoléculessontcoûteusesetdonc peuutiliséesin#vivo,cesexpériencesnécessitantdegrandesquantitésdesirna.ellesnesont pas d une grande stabilité, et les possibilités de modifications chimiques pouvant augmenter leurstabilitépeuvententraînerunepertedefonction.ilfautdonctrouverlejusteéquilibredans les modifications entre la stabilité et l efficacité. Ce sujet sera discuté ultérieurement. Enfin, contrairementauxshrnaplasmidiques,leurexpressionn estpasinductible. shrna# LesshRNAnécessitentunemanipulationbeaucoupplusimportanteetlongueenamont de l expérience à proprement parler. En effet, comme toute construction plasmidique, il est nécessairederéaliser de nombreusesétapesdeclonagedes shrnadansleplasmide, puis de vérificationdeséquence.cetravailpeutdevenirtrèsfastidieuxsidifférentsgènesdoiventêtre inhibés.cependant,unefoisquelesconstructionssontréalisées,ellespeuventêtrereproduites facilement et sont très peu couteuses. Il est également possible d utiliser un unique vecteur d expression pour encoder de multiples shrna, augmentant le potentiel thérapeutique du produit.deplus,l expérimentateurn estpasdirectementencontactavecl ARN,maistravaille "16"

17 INTRODUCTION uniquement avec l ADN, qui est plus stable, et dont les manipulations et méthodes d acheminement vers les cellules sont bien connues. L utilisation d un vecteur lentiviral ou rétroviral pour infecter les cellules permet également de surmonter la difficulté de la transfectiondescellules,etd exprimerdegrandesquantitésdeshrnasurdelonguespériodes. En fonction du vecteur choisi, l expression peut être transitoire ou stable, et des systèmes d inductiondel expressionexistent. Cette méthode n est toutefois pas utilisable pour réaliser un «screen» de shrna. En effet, chaque construction est bien trop laborieuse pour que cela ait un intérêt. Il n est pas possibledemarquerdirectementlesshrnaexprimés.enfin,commetouteconstructionadn,ily adespossibilitésd intégrationsdanslegénomedelacellule,aveclesrisquesquecelacomporte: coupured ungène,décalageducadredelectured uneséquence,modificationd unpromoteur... Que#choisir#?# Demanièregénérale,sicertainsavantagesdelatechniqueshRNApeuventsemblerplus attrayantsqueceuxdessirna,ilfauttoutefoisprendreencompted autresparamètres.eneffet, malgrélespointspositifsdestabilitéetd expressioninductibleetàlong"termedesshrna,le risqued intégrationdanslegénomeestunproblèmenonnégligeable:d unpointdevueéthique, il serait difficile de justifier la transformation d un être humain en organisme génétiquement modifié,mêmesilapremièreintentionestlouable.ilexistedeplusunrisquequel intégration génomique se fasse au niveau des gamètes, entraînant non seulement la transformation génétiquedupatient,maiségalementpotentiellementcelledesadescendance. Pour l instant les données concernant l intégration de plasmides dans le génome sont trop limitées pour pouvoir assurer une insertion dans une zone précise, et il est quasiment impossibledecertifierquecetteinsertion,mêmesilazoneysemblepropice,nesoitpassans effetsdélétèresultérieurementàd autresniveauxmétaboliquesouphysiologiques.deplus,si cette éventualité pourrait être envisagée dans le cadre d un traitement de maladie génétique incurable, comment la justifier dans le cadre d une infection ou d un cancer, aussi virulents soient"ils,siletraitementpeutengendrerdavantagedecomplicationsparlasuite? Danslecadredemathèse,leproblèmeseposedifféremment,maisn invalidecependant pas cette réflexion. En effet, le but de mon travail n est pas de traiter de façon parfaite une pathologie,maisbiendemettreenavantuneméthodedevectorisationdessirna,etderéaliser lapreuvedeconceptdesonefficacité.danscecadre,lebutestdetravailleraveclesmolécules desirnadirectement,afind améliorerl efficacitédutraitement les utilisant, en «sublimant» leurs capacités par un apport extérieur capable de favoriser leur stabilité, et leur libération à longterme. "17"

18 INTRODUCTION 5. Limites)et)défi)des)siRNA)thérapeutiques) Grâceàleurefficacitéetspécificitéd interférencegénique,lepotentielthérapeutiquedes sirnaestcolossal,commecelaaétédémontrédansuncertainnombred étudesin#vitroetin# vivo.ilrestecependantungrandnombred obstaclesàfranchirafindepouvoirexploitertoutela puissancedecettetechnologie 13. Stabilité#et#ciblage#des#siRNA# Dans le sérum, comme dans les tissus, les sirna sont très sensibles à la dégradation enzymatique.eneffet,lademi"viedesirnanusdanslesérumsesitueentrequelquesminutes et une heure 15. De plus, du fait de leur faible masse moléculaire, les sirna sont rapidement excrétés par les reins. De ce fait, la détermination d une dose adéquate pour le traitement au niveaudelazoneciblée,etd autantplusauniveaudescellulescibles,estunréeldéfi 16. Unefoisarrivésauniveaudescellulescibles,lessiRNAdoiventencorearriveràpasserla membrane cellulaire. Cependant, la taille, ainsi que la charge négative des sirna nus en empêcheladiffusion.encasd entréedessirnaparlesvoiesd endocytose,illeurfautencore pouvoiraccéderaucytoplasme,oùilsrisquentd êtredégradésparlesrnasescytosoliques.une foistouscesobstaclespassés,lessirnan onttoujourspasétéreconnusetincorporéàrisc Interférence#offYtarget# Outre les difficultés d acheminement, des effets off8target ont été constatés lors d analyses microarray, c est"à"dire l interférence de gènes autres que ceux dont l inhibition d expression est souhaitée 17. Ces effets off8target sont évidemment indésirables, puisqu ils peuvent entrainer des modifications de l expression génique, ainsi que des modification cellulairesimprévues. Enaccordavecnosconnaissancesdel interférencedesmirna,lesrésultatsobtenuslors d étudesrécentessemblentlogiques 18,19.Eneffet,cesétudesontmontréqueleseffetsoff8target sont liés à des homologies de séquences de six ou sept nucléotides, ce qui s apparente à la complémentarité partielle obtenue entre le mrna et le mirna. De plus, les sirna peuvent égalementêtrecomplémentairesauxmirnaendogènes,quiontpourrôlederégulercertaines famillesdegènes 20.Pourtoutescesraisons,ilestindispensabled apporteruneattentiontoute particulière au choix du brin guide, afin de limiter autant que possible ces effets off8target.# Cependant,l avancéedenosconnaissancesconcernantlesmécanismesd interférencearn,les prédictions bioinformatiques utilisables pour la création des sirna se font de plus en plus précises,etpourrontprobablementàl avenirréduire,voiresupprimertotalementl interférence off8target. "18"

19 INTRODUCTION Activation#de#la#réponse#immunitaire# L activation de l immunité innée par les sirna fait potentiellement partie des effets indésirables de ceux"ci in# vivo. En effet, la libération excessive de cytokines, ainsi que les syndromes inflammatoires qui y sont associés peuvent engendrer une réaction toxique, en particulierchezl Homme.Bienquel idéed exploitercetteréponseimmunitairedanslecadrede thérapiesanti"cancéreusesouanti"infectieusessoitséduisante,sondéveloppementrequièreune précautioninfinie,dufaitdelasensibilitéhumaineàlatoxicitémédiéeparlescytokines. L administrationsystémiquedesirnapeutengendreruneréponseimmunitaireinnée, induisant la production de cytokines pro"inflammatoires telles que le tumor necrosis factor alpha (TNFα), l interleukin"6 (IL"6), et des interférons (IFN), en particulier de l IFN"alpha (IFNα). En effet, lorsque les sirna sont acheminés vers des cellules immunitaires, ceux"ci engendrent la production d IFNα dans les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pdc), et de cytokinesinflammatoiresdanslescellulesdentritiquesmyéloïdes(mdc) 21,22. Illustration)IY3):)siRNA)et)immunité) (Modifiée)à)partir)de)Olejniczak)et#al.,) )) "19"

20 INTRODUCTION Cette activation de l immunité innée permet à l hôte de se protéger d agents potentiellementinfectieuxoudecorpsétrangers.plusieursvoiespeuventêtreactivéesparles sirna, étant soit médiée par les récepteurs Toll"like (TLR; mise en jeu des TLR3, 7 et 8, sensiblesàl ARN),soitnon"TLR"médiée(pardesprotéinesintracellulairestellesquelegène1 inductibleparl aciderétinoïque,rig1).lestroistypesdetlrsontprincipalementsituésdans la cellule, et captent des acides nucléiques de pathogènes lorsqu ils sont dégradés par les endolysosomes.tlr3sesitueégalementensurfacedecertainstypescellulaires,etrig1,quant àlui,vasefixerauxsirnadanslecytoplasme.enfonctiondeleurmodedetransportetdeleur présentation, les sirna peuvent potentiellement activer à la fois les réponses immunitaires dépendantesetindépendantesdestlr.deplus,laprésencedesirnaimmunostimulantspeut également initier une réponse immune adaptative en potentialisant la production d anticorps dirigés contre les composants du vecteur. Ceux"ci peuvent alors augmenter la clairance des vecteursdessirna,etainsidiminuerl efficacitédestraitementsultérieurs. TLR7etTLR8 TouslesTLRneréagissentpasauxmêmesstimuli.Eneffet,lesTLR7et8reconnaissent plusparticulièrementcertainesséquencesdessrna(poly"uridine(poly"u),ourégionsrichesen guanosine(g)etenu 24.IlamêmeétésuggéréplusrécemmentquelesligandsdeTLR7soient uniquement définis par la présence d une chaîne de riboses et de groupes de plusieurs U relativementrapprochés 25.LanatureexactedesmotifsreconnusparlesTLR7/8n estpasclaire pour l instant. Il semble cependant que le motif 5 "UGU"3 soit particulièrement immunostimulant,alorsquelasuppressiondesudanscemotif,ainsiqu enévitantlaprésence deséquencesrichesenguréduitlepotentielimmunostimulantduduplex 22.Cesmotifsnesont cependantpaslesseulsreconnusparlestlr7/8.eneffet,unegrandemajoritédesséquences sirnaprésententuneactivitéimmunostimulantedeplusoumoinsforteintensité. LefaitquelaréponseimmunitairemédiéeparlesTLRsoitdépendantedesséquencesde sirna présente des conséquences importantes pour le développement des technologies employant les sirna, soulignant la nécessité de sélectionner les contrôles expérimentaux adéquats.eneffet,ilestindispensabledepouvoirdifférencierleseffetsnonspécifiquesinduits pardesséquencesciblesoucontrôlesimmunostimulatrices,notammentin#vivo 26. LessignauxTLR7et8sontvéhiculésexclusivementparlaprotéineadaptatriceMyD88 (IllustrationI"3) 27,28.L associationdestlretdemyd88vaentraînerlaformationd uncomplexe de signalisation qui aboutira à la translocation de NF"κB, et à l activation de facteurs de transcriptions tels que IRF5 et IRF7, qui vont provoquer la surexpression de l IFNα et des cytokinespro"inflammatoires 27. "20"