Altération du fonctionnement du ribosome par les antibiotiques

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1 Cours du 26/01/10 RT : Guillon Sarah Altération du fonctionnement du ribosome par les antibiotiques I. Rappels A. Généralité sur les ribosomes B. La synthèse protéique C. Les opérons II. Les effets des antibiotiques sur la petite sous-unité A. Aminoglycosides B. Tétracyclines III. Les effets des antibiotiques sur la grande sous-unité A. Chloramphénicol B. MLS C. Acide fusidique I. Rappels A. Généralité sur les ribosomes Le ribosome est un organite présent dans le cytoplasme des bactéries (de l'ordre de 15 à / bactérie). C'est le siège de la synthèse protéique. Un ribosome a un coefficient de sédimentation 70S, il est composé de deux sous-unités 50S et 30S. La sous-unité 50S est ellemême composée de deux ARN ribosomaux 5S et 23S et de protéines alors que la sous-unité 30S est composée d'un ARN ribosomal 16S et de protéines. Les ARN ribosomaux prennent des structures primaires, secondaires et tertiaires qui permettent de différencier des sites dans le ribosome. Le site a est le site de liaison de l'arn de transfert, c'est la zone de décodage du codon. Le site p est le site de fixation de la première méthionine et le lieu de la liaison protidique. Le site e est quant à lui le site de sortie de l'arnt et de libération de l'aa. Le gène codant l'arn 16S possède des parties communes à toutes les espèces bactériennes qui correspondent aux séquences indispensables au fonctionnement du ribosome. Cette région est utilisée en PCR pour permettre de détecter la présence de petites quantités de bactérie. L'ARN 23S est organisé en 6 domaines, composées de boucles et en épingles à cheveux au centre desquelles se trouvent les protéines. Toute modification de la structure nucléotidiques de l'arn va entraîner une modification de conformation de l'arn ayant pour conséquence soit l'arrêt de la synthèse protéique soit le développement d'une résistance.

2 B. La synthèse protéique Le ribosome a un rôle fondamental dans la synthèse protéique. Elle est composée de 3 étapes : l'initiation, l'élongation et la terminaison. Le codon initiateur est toujours la formylmethionine chez les procaryotes : AUG. Il s'agit d'une méthionine dont la fonction NH2 est bloquée par un acide formique. Il y a formation d'un complexe entre une séquence située en 5' à 4 à 5 nucléotides du codon AUG, la séquence de Shine Dalgarno (5'-AGGAGG-3'), et l'extrémité 3' de l'arnr 16S de la petite sous-unité. Cette étape a lieu avec l'aide d'un facteur d'initiation IF lié au GTP. L'élongation est une étape de continuation de la synthèse protéique. Le ribosome va parcourir le brin d'arnm codon par codon (translocation) et va par l'intermédiaire d'un ARN de transfert (ARNt) ajouter un acide aminé à la protéine en cours de fabrication selon le codon lu. Une fois le codon-stop atteint (UAA, UGA, UAG), la protéine est complète: le ribosome se détache de la protéine et du brin d'arnm, et la protéine est libérée dans l'organisme. Le ribosome va se disloquer en ses deux sous-unités (50s et 30s) et pourra faire une autre synthèse sur un autre ARNm. C. Les opérons Dans le génome bactérien, se trouve des operons qui codent les ARN ribosomaux, ils sont nommés RRn. Ces gènes sont toujours organisés dans le même sens. L'enchaînement des gènes commencent par ADNr 16S RRs suivi de ADNr 23S RRl puis ADNr 16S RRf, présence de régions intergéniques entre ces gènes. Le nombre d'opérons ribosomiques est variable selon les espèces bactériennes, 7 chez E.Coli. Ils sont répartis sur l'ensemble du chromosome, en général certaines copies sont très proches de l'origine de réplication car la bactérie à besoin rapidement de faire de la synthèse protéique donc elle a besoin de ribosomes. D'autres espèces ont moins d'operons, il sera donc plus facile d'avoir l'intégralité des ribosomes mutés et par là même potentiellement création d'une résistance à des antibiotiques. Exemple de E.faecalis : on a la présence de 4 opérons proche de l'origine de réplication. Les antibiotiques ont 3 CIBLES importantes : paroi bactérienne synthèse nucléotidique synthèse protéique Ils interviennent soit au niveau de la petite sous-unité soit sur la grande sous-unité.

3 II.Les effets des antibiotiques sur la petite sous-unité A. Aminoglycosides Le noyau est commun à plusieurs familles d'aminosides. C'est un des plus vieux antibiotique utilisé pour lutter contre la tuberculose (encore utilisé pour les souches multi-résistantes). Il est bactério-statique et interagit avec un ou plusieurs sites ribosomaux surtout avec les protéines S3,4,5,12. Son action est dû à l'interaction avec les protéines qui entraîne une modification de la conformation. L'ARNm est alors lu avec des erreurs et donne lieu à la synthèse de protéines anormales ayant pour conséquence la mort de la bactérie. Le principal mécanisme de résistance des bactéries est donné par les enzymes. Elles inactivent les aminoglycosides en ajoutant des groupements phosphoryl (phosphotransférases APH), adényl (nucléotidyl transférases ANT) ou acétyl (acétyltransférases AAC). Elles modifient la conformation des aminoglycosides et empêchent leur fixation au niveau de l'acide nucléique. La résistance par modification de la cible est phénomène rare mais fréquent pour la streptomycine. Elle consiste en la mutation chromosomique des protéines ribosomales. Les gènes codant pour les protéines ribosomales sont nommés LPS, S12 est la plus souvent impliqué dans les phénomènes de résistance. Le gène codant l'arn S16 peut être lui aussi muté, c'est plus facile chez certaines bactéries car elles possèdent moins de copie de l'opéron. B. Tétracyclines Quelques exemples de tétracyclines sont la tétracycline, la doxycycline et une nouvelle molécule la tigécycline. Cette dernière est commercialisé sous le nom de tigacil, la présence d'une chaîne latérale permet de limiter les phénomènes de résistance. Les tétracyclines agissent au niveau de la phase d'élongation et se fixent sur l'arn 16S et sur la protéine S7. Cela entraine l'inhibition de la fixation de l'arnt au niveau du site a et donc l'arrêt de la synthèse protéique. Le mécanisme de résistance le plus fréquent est le mécanisme d'efflux qui consiste à l'élimination de l'antibiotique à l'extérieur de la bactérie grâce à des protéines de membrane. Il existe un autre mécanisme qui consiste en la protection du ribosome. Il y a une activation d'une série de gènes codant pour des protéines protectrices du ribosomes les TETm qui empechent la fixation des tétracyclines. Par exemple TETo est un analogue du facteur d'élongation qui se fixe sur la sous-unité 30S, il joue le même rôle (sans doute issu d'un ancêtre commun) et empêche la fixation des tétracyclines.

4 III. Les effets des antibiotiques sur la grande sous-unités A. Chloramphénicol Le chloramphénicol est une molécule bactério-statique. Elle inhibe la synthèse protéique en prévenant l attachement de l extrémité de l aminoacyl ARNt à son site de liaison. Le chloramphénicol acétyl-transférase (CAT) est une enzyme codée par un plasmide inactivant le chloramphénicol. Les dérivés acétoxy du chloramphénicol ne peuvent alors plus se lier aux ribosomes. B. MLS Famille des MLS : macrolides, lincosamides, streptogramines et les kétolides Les streptogramines sont d'origines naturelles ou hémisynthétiques par exemple la piostasine est d'origine naturelle. La piostasine est active sur les gram positif jamais sur les gram négatif, elle tient son nom de son action anti-pus, elle est très active sur le staphilocoque. Elle est composée d'un facteur a qui se fixe au niveau de la paroi du tunnel de sortie du polypeptide et modifie structure du ribosome, et d'un facteur b qui se fixe toujours très proche du site de fixation des macrolides. L'érythromycine est un macrocycle lactonique à 14 chaînons sur lequel se fixe deux sucres; c'est une molécule naturelle. C'est une molécule bactério-statique. Elle se fixe sur le domaine V de la grande sous-unité (ARN 23S) à proximité du site qui contient le centre peptidyl transférase. Elle bloque l'étape d'élongation par encombrement stérique et prévient la translocation du ribosome. Les lincosamides ont un mécanisme similaire à l'érythromycine. Une molécule de macrolide se fixe sur un ribosome. Il faut donc une quantité importante d'antibiotique pour inhiber tous les ribosomes. Les macrolides interagissent principalement avec les protéines L4 et L22. Les macrolides en général se positionnent au niveau des adénines 2058,2059 et 2062, elles agissent en empêchant l'élongation de la chaîne polypeptidique. Les kétolides: La molécule commercialisée est le Ketek. Les kétolides tiennent leur nom de leur structure chimique : présence d'une fonction cétone en position 3 (par rapport à la structure de l'érythromycine). Ils ont un double site de fixation à l'arnr 23S : un site de fixation sur le domaine II et un sur le domaine V. Ils ont donc l'avantage par rapport à l'érythromycine de toujours fonctionner même si un mécanisme de résistance du domaine V se met en place. Le Ketek est utilisé sur la souche E.pneumonia du fait de ces CMI basses (concentration minimale inhibitrice). Mécanisme de résistance acquise : Il existe comme mécanisme de modification de la cible : l'efflux actif et des enzymes surtout pour les streptogramines. Cependant un mécanime très original n'existe que pour cette famille ; c'est une modification enzymatique de la cible et non pas de l'antibiotique comme traditionnellement. Elle consiste en la méthylation de la cible. La base méthylée au niveau de l'arnr, l'adénine 2058, est cruciale pour l'action des macrolides. Ce mécanisme de résistance le plus répandu est celui qui confère le plus de résistance chez les souches cliniques. NB : on utilise la numérotation d'e.coli quand on travaille sur le ribosome. On se base sur la séquence de l'arnr de E. Coli pour que les bases importances portent toujours le même numéro mais l'adénine 2058 ne correspond pas exactement dans toutes les bactéries.

5 En règle générale, la CMI des macrolides est très basse de l'ordre de 0,06 g/l. La méthylation entraîne un changement de conformation du ribosome qui diminue l'affinité du macrolide pour le ribosome. La CMI augmente de façon à n'être plus compatible avec l'aspect clinique. Ce mécanisme entraîne un phénotype MLS B ou de résistance croisée à tous les macrolides, au facteur b des streptogramines et aux lincosamides. C'est logique puisqu'ils ont tous les trois les mêmes cibles de fixation. Ceux sont des enzymes des méthylases qui amènent le groupement. Elles sont codées par les gènes erm (erythromycine ribosome méthylase). Elles catalysent soit une monométhylation soit une diméthylation. Les macrolides sont d'origines naturelles, on a donc retrouvé donc des gènes erm chez des bactéries qui se protégent ainsi des antibiotiques qu'elles produisent. 0 Les gènes erm sont organisés en classe 41 gènes en 33 classes (une nouvelle classe si moins de 80% d'affinité). Le support génétique est soit présent sur des transposons qui peuvent être conjugatif, sur des plasmides (sauf pour les pneumocoques) ou au niveau chromosomique. Les gènes erm sont présents presque dans tous les génomes bactériens. L'expression de la résistance MLSB est inductible ou constitutive suivant le mode de synthèse de la méthylase. Pour les staphylocoques, le mécanisme de régulation est inductible ou constitutif. Il a lieu grâce à une régulation post-transcriptionnelle qui permet une atténuation de la traduction. Pour les streptocoques, le mécanisme de régulation est complexe. Tous les macrolides peuvent être inducteurs à des degrés différents. Le mécanisme de régulation se base sur l'utilisation d'une partie en amont du gène erm qui se nomme ermcl (zone de régulation). En abscence de macrolide, cette zone permet la formation d'une épingle à cheveux qui vient bloquer le site d'attachement au niveau de l'arn. Il n'y a alors pas possibilité de traduction de erm. Donc il y a une absence de mécanisme de résistance. En présence de macrolide, le changement de conformation du ribosome libère la traduction et induit donc la résistance. Toutes les molécules sont inductibles de leur propre résistance. Les autres mécanismes sont à part la méthylation la mutation de RRl le plus souvent au niveau de l'adénine en position 2058 possible surtout valable pour les bactéries ayant un faible nombre de copie de l'operon ribosomique par exemple les mycobactéries. Il existe aussi des mutations pour des protéines ribosomales protéine L4 et L22 de la grande sous-unité. C. Oxazolidinone Zyvoxid est une nouvelle famille commercialisée en 2002 en France. C'est un agent de synthèse qui agit sur les gram positif, pneumonies nosocomiales ou communautaires ou des infections compliquées de la peau et des tissus mous. Cet antibiotique a comme grand avantage une très bonne pharmacocinétique en IV et en per os. Cette famille intervient en amont des autres familles vues précédement. En effet elle inhibe la formation du complexe d'initiation. De plus les oxazolidinones se fixent à une position différente certes encore proche du centre peptidyl transférase mais peu de phénomènes de résistance sont observés. Les mécanismes de résistance sont des mutations en position Cette mutation n'entraîne pas de résistance croisée et n'est pas fréquente. La CMI augmente en fonction aux nombres de copie d'operon muté. Récemment il y a eu apparition d'un nouveau mécanisme de résistance codé par le gène CFR. Le mécanisme est semblable à celui observé sur les macrolides, une méthyltransférase entraine la fixation d'un groupement méthyl sur l'adénine C'est une résistance croisée avec les lincosamides et les streptogramina entre autre.

6 D. Acide fusidique L'acide fusidique agit sur le facteur d'élongation G et permet d'inhiber la phase d'élongation. Il agit en majorité pour les infections à gram positif. Le facteur G pour fonctionner doit normalement se complexer avec du GDP après hydrolyse de GTP. Ce facteur est essentiel pour la translocation du site a vers le site b de l'arnt. L'acide fusidique stabilise le facteur G au niveau du ribosome et empêche son recyclage bloquant ainsi la phase d'élongation. A forte concentration l'acide fusidique agit en inhibant la liaison de l'acide aminé-arnt au site P.