Analyse des dioxines et composés de type dioxines les huiles végétales à destination animale par GC-MS/MS

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1 Date de Verson : 30// Page : 1/11 Table des matères 1 Objet et domane d applcaton Document de référence Défntons / Abrévatons Descrpton Prncpe Sécurté Récepton des échantllons Mode opératore Préparaton des solutons standards Standard nterne PDD/Fs et NO-PBs marqué au [xp302] Standard nterne MO-PBs marqué au [ST-3] Standard de recouvrement PDD/Fs et NO-PBs marqué au [xp301] Standard de recouvrement MO-PBs marqué au [ST-321] ourbe d étalonnage pour l analyse des PDD/Fs et NO-PBs [xp-300] ourbe d étalonnage pour l analyse des MO-PBs [xp-309] Préparaton des échantllons Purfcaton des échantllons Analyse par G-MS/MS Analyse de la fracton 1 (PDD/Fs et NO-PBs) Analyse de la fracton 2 (MO-PBs) alculs... 9

2 Date de Verson : 30// Page : 2/11 1 Objet et domane d applcaton e mode opératore décrt l analyse des doxnes (PDDs), furannes (PDFs) et PBs de type doxne (DL-PBs) dans les échantllons d hule végétale à destnaton. 2 Document de référence EN-16215:11 : Anmal feedng stuffs - Determnaton of doxns and doxn-lke PBs by G/HRMS and of ndcator PBs by G/HRMS Règlement (UE) n 278/ de la ommsson du 28 mars portant modfcaton du règlement (E) n 152/09 en ce qu concerne la détermnaton des teneurs en doxnes et en polychlorobphényles Règlement (UE) n 277/ de la ommsson du 28 mars modfant les annexes I et II de la drectve 02/32/E du Parlement européen et du onsel en ce qu concerne les teneurs maxmales et les seuls d nterventon relatfs aux doxnes et aux polychlorobphényles 3 Défntons / Abrévatons PDD PolyhloroDbenzoDoxnes (7 composés toxques postons 2,3,7,8) PDF PolyhloroDbenzoFurannes (10 composés) DL-PB PolyhloroBphényls de type doxne ( composés) G-MS/MS hromatographe gazeuse couplée à la spectrométre de masse en tandem IS Standard nterne : standard utlsé pour la quantfcaton des échantllons RS Standard de recouvrement : standard utlsé pour détermné le taux de réapparton du standard nterne 4 Descrpton 4.1 Prncpe Le prncpe consste en une préparaton des échantllons suvant une verson modfée de la méthode standardsée EN-16215:11, suve d une analyse par G-MS/MS. La dluton sotopque étant utlsée pour l aspect quanttatf de la méthode. 4.2 Sécurté Outre les mesures habtuelles de sécurté (tabler, gants, lunettes, ), on apportera une attenton toute partculère à la manpulaton des acdes, à l utlsaton des solvants dans une hotte chmque et aux manpulatons de standards analytques. 4.3 Récepton des échantllons Les échantllons sont réceptonnés suvant la procédure PT-08-REEPTI. Un blanc de procédure (B) et un échantllon de contrôle de la qualté ( ; hule fortfée) sont ajoutés à chaque sére.

3 Date de Verson : 30// Page : 3/ Mode opératore Préparaton des solutons standards Standard nterne PDD/Fs et NO-PBs marqué au [xp302] La soluton s utlse sans dluton. 1. Agter une ampoule scellée d EDF-4144 (ambrdge Isotope Laboratores) à l ade d un vortex pendant au mons 1 mnute 2. Ouvrr l ampoule 3. Transférer la totalté du contenu de l ampoule dans une ampoule ERTAN de 1.5mL à l ade d une serngue Hamlton 4. Annoter l ampoule avec le numéro xp302, la date de préparaton et les ntales du préparateur Standard nterne MO-PBs marqué au [ST-3] On utlse une soluton dluée à 0 pg/µl, préparée à partr d une soluton à 5 ng/µl (MBP-MKX de chez Wellngton ; xp3) 1. Introdure 1000 µl de n-nonane (pureté > 99.8% ; xp060) dans une ampoule ERTAN de 1.5 ml à l ade d une serngue Hamlton 2. Retrer 40 µl de n-nonane (xp060) de l ampoule pour obtenr un volume de 960 µl 3. Introdure 40 µl de soluton xp3 dans l ampoule 4. Agter au mons une mnute à l ade d un vortex 5. Annoter l ampoule avec le numéro ST3, la date de préparaton et les ntales du préparateur Standard de recouvrement PDD/Fs et NO-PBs marqué au [xp301] La soluton s utlse sans dluton. 1. Agter une ampoule scellée d EDF-4145 (ambrdge Isotope Laboratores) à l ade d un vortex pendant au mons 1 mnute 2. Ouvrr l ampoule 3. Transférer la totalté du contenu de l ampoule dans une ampoule ERTAN de 1.5mL à l ade d une serngue Hamlton 4. Annoter l ampoule avec le numéro xp301, la date de préparaton et les ntales du préparateur Standard de recouvrement MO-PBs marqué au [ST-321] On utlse une soluton dluée à 0 pg/µl, préparée à partr d une soluton à 40 ng/µl (MBP-80 de chez Wellngton ; xp321) 1. Introdure 1000 µl de n-nonane (xp060) dans une ampoule ERTAN de 1.5 ml à l ade d une serngue Hamlton 2. Retrer 5 µl de n-nonane (xp060) de l ampoule pour obtenr un volume de 995 µl 3. Introdure 5 µl de soluton xp321 dans l ampoule 4. Agter au mons une mnute à l ade d un vortex 5. Annoter l ampoule avec le numéro ST321, la date de préparaton et les ntales du préparateur

4 Date de Verson : 30// Page : 4/ ourbe d étalonnage pour l analyse des PDD/Fs et NO-PBs [xp- 300] ette courbe est dsponble commercalement et se déclne en 9 ponts (cdc-01 à 09). Elle est utlsée tel quel : EDF-4143 de chez ambrdge Isotope Laboratores. Pour chaque soluton : 1. Agter l ampoule scellée à l ade d un vortex pendant au mons 1 mnute 2. Ouvrr l ampoule 3. Transférer la totalté du contenu de l ampoule dans une ampoule ERTAN de 1.5mL à l ade d une serngue Hamlton 4. Annoter l ampoule avec le numéro xp300-y (ou y est l ndce de concentraton), la date de préparaton et les ntales du préparateur ourbe d étalonnage pour l analyse des MO-PBs [xp-309] ette courbe est consttuée de 6 ponts et est préparée au mons une fos par an Soluton 1 Soluton de MO-PBs à 0 pg/µl. 1. Dans un certan de 1.5 ml, ntrodure 1 ml de nonane (xp060) à l ade d une serngue dédcacée 2. Retrer µl de nonane pour obtenr un volume de 980 µl 3. Ajouter µl de la soluton E-4987 (xp837 ; Wellngton) contenant les MO-PBs natfs à 10 µg/ml (PBs 105, 114, 118, 3, 156, 157, 167, 189) 4. Homogénéser au vortex Soluton 2 Soluton de MO-PBs et NDL-PBs à pg/µl. 1. Dans un certan de 1.5 ml, ntrodure 1 ml de nonane (xp060) à l ade d une serngue dédcacée 2. Retrer 10 µl de nonane pour obtenr un volume de 990 µl 3. Ajouter 10 µl de soluton 1 4. Homogénéser au vortex Préparaton de la courbe 1. Prendre 6 ampoules certan et les annoter xp309-1 à 6, date de préparaton et ntales du préparateur 2. Réalser les mélanges décrs dans le tableau suvant à l ade de serngues dédcacées. Nveau n-nonane S1 S2 ST3 ST321 oncentraton oncentraton (µl) (µl) (µl) (µl) (µl) (pg/µl) (pg/µl) Préparaton des échantllons 1. Homogénéser l échantllon en l agtant vgoureusement 2. Prélever 4 g d hule dans un val en verre de 60 ml, les peser précsément à l ade d une balance analytque et reporter la pesée sur la fche de suv de l échantllon

5 Date de Verson : 30// Page : 5/11 3. Ajouter 10 µl d xp302 et 10 µl de ST3 à l échantllon à l ade de serngues dédcacées (ne pas oubler de rncer les serngues avant et après usage à l ade de dchlorométhane de pureté mnmum 99.5% ; xp053) 4. Ajouter 21 ml de n-hexane (pureté mnmum 95% ; xp052) 5. Homogénéser à l ade d un vortex La préparaton de l échantllon de contrôle de la qualté est dentque. La préparaton du blanc de procédure est analogue, sauf qu l est composé unquement de ml d hexane (xp052) Purfcaton des échantllons 1. Purfer les échantllons suvant le protocole standardsé EN-16215:11 2. oncentrer sous flux d azote la fracton contenant les PDD/Fs et NO-PBs (fracton 1) jusque 4 µl de n-nonane dans un val conque de 1.5 ml ; ajouter 5 µl de xp301 et sceller à l ade d un caps mun d un septum 3. oncentrer sous flux d azote la fracton contenant les MO-PBs (fracton 2) jusque 90 µl de n-nonane dans un val conque de 1.5 ml ; ajouter 10 µl de ST321 et sceller à l ade d un caps mun d un septum 4. onserver à - jusque njecton Attenton, lors des évaporatons, ne jamas évaporer à sec Analyse par G-MS/MS Les analyses sont réalsées sur un TS-uantum Ultra de chez Thermo-Fnngan. Avant toute sére d njecton, vérfer que les paramètres de l nstrument ont été optmsés va le système de tune automatque. L ordre d njecton est toujours : - ourbe d étalonnage - B - - Sére d échantllons réels Analyse de la fracton 1 (PDD/Fs et NO-PBs) hromatographe gazeuse Injecton : Volume : 5 µl d échantllon olonne : Type : Restek Rtx-5 (60m x 0. mm x 0. µm) Flux : 1.2 ml/mn Injecteur PTV : Four :

6 Date de Verson : 30// Page : 6/11 Rampe ( /mn) Température ( ) Mantenu (mn) Intal Etape Etape Etape Etape Etape Spectrométre de masse en tandem Source : Mode : EI+ Température : 0 Energe d onsaton : 70 ev Gaz de collson : Ar Presson du gaz de collson : 1.5 mtorr Ions : ongénère Transtons ollson (V) Rapport d ons Temps de rétenton (mn) (*) PB > ** > PB > ** > PB > ** > PB > ** > PB > ** > ,3,7,8-TDF > 1.90 ** > ,3,7,8-TDF > ** > (*) 1,2,3,4-TDD > ** > ,3,7,8-TDD > ** > ,3,8,7-TDD > 6.90 ** > PB > ** > PB > 3.91 ** 3.88 > ,2,3,7,8-PeDF > ** > ,2,3,7,8-PeDF > ** >

7 Date de Verson : 30// Page : 7/11 2,3,4,7,8-PeDF > ** > ,3,4,7,8-PeDF > ** > PB > > ** [1.-] 31.8 PB > > ** [1.-] ,2,3,7,8-PeDD > ** > ,2,3,7,8-PeDD > ** > ,2,3,4,7,8-HxDF > > ** ,2,3,4,7,8-HxDF > > ** ,2,3,6,7,8-HxDF > > ** ,2,3,6,7,8-HxDF > > ** ,3,4,6,7,8-HxDF > > ** ,3,4,6,7,8-HxDF > > ** ,2,3,4,7,8-HxDD > > ** ,2,3,4,7,8-HxDD > > ** ,2,3,6,7,8-HxDD > > ** ,2,3,6,7,8-HxDD > > ** ,2,3,7,8,9-HxDD > > ** ,2,3,7,8,9-HxDD > > ** ,2,3,7,8,9-HxDF > > ** ,2,3,7,8,9-HxDF > > ** ,2,3,4,6,7,8-HpDF > ** > ,2,3,4,6,7,8-HpDF > ** > ,2,3,4,6,7,8-HpDD > ** > ,2,3,4,6,7,8-HpDD > ** 4.80 >

8 Date de Verson : 30// Page : 8/11 (*) 1,2,3,4,7,8,9-HpDF > ** > ,2,3,4,7,8,9-HpDF > ** > ODD > ** > [ ] 44.8 ODD > ** > [ ] 44.8 ODF > ** > [ ] 44.9 ODF > ** > [ ] 44.9 (*): congénère utlsé en tant que RS (**) : transton dont la trace chromatographque est utlsée pour la quantfcaton, l autre est utlsée pour confrmer l dentfcaton Analyse de la fracton 2 (MO-PBs) hromatographe gazeuse Injecton : Volume : 2 µl d échantllon olonne : Type : SGE HT-8 (m x 0. mm x 0. µm) Flux : 0.8 ml/mn Injecteur Spltless : Température : 0 Flux de splt : 100 ml/mn Temps de splt : 1 mn Four : Rampe ( /mn) Température ( ) Mantenu (mn) Intal Etape Etape Etape Etape Spectrométre de masse en tandem Source : Mode : EI+ Température : 0 Energe d onsaton : 70 ev Gaz de collson : Ar Presson du gaz de collson : 1.5 mtorr Ions :

9 Date de Verson : 30// Page : 9/11 ongénère Transtons ollson (V) Rapport d ons Temps de rétenton (mn) (*) PB > ** > PB > ** > PB > 3.91 ** 3.88 > PB > ** > PB > 3.91 ** 3.88 > PB > ** > PB > 3.91 ** 3.88 > PB > ** > PB > 3.91 ** 3.88 > PB > > ** [1.-] PB > > ** [1.-] PB > > ** [1.-] PB > > ** [1.-] PB > > ** [1.-] PB > > ** [1.-] PB > > ** [-1.76] PB > > ** [-1.76] (*): congénère utlsé en tant que RS (**) : transton dont la trace chromatographque est utlsée pour la quantfcaton, l autre est utlsée pour confrmer l dentfcaton alculs Le calcul de la concentraton dans l échantllon est réalsé va la technque de la dluton sotopque où chaque congénère natf est assocé à son sotopomère marqué au Facteur de réponse Pour chaque congénère natf, calculer le facteur de réponse relatf moyen (RRF m ) en utlsant les équatons suvantes : 27.55

10 Date de Verson : 30// Page : 10/11 RRF RRF m y n1. A. A y RRF Où : quantté du congénère présent dans le pont de courbe d étalonnage : quantté du congénère marqué au présent dans le pont de courbe d étalonnage A : are du pc de chromatographe de l on le plus abondant du congénère A : are du pc de chromatographe de l on le plus abondant du congénère marqué au RRF : facteur de réponse relatf du congénère natf y : nombre de pont de courbe RRF m : facteur de réponse relatf moyen du congénère natf n Pour chaque RRF m, aucun RRF y ne peut avor un écart au-delà de 30% de la moyenne Taux de réapparton Le taux de réapparton des standards nternes ou % recovery est calculé de la manère suvante pour le congénère présent dans le standard nterne : 100. ASI. yrs % re cov ery A.. RRF yrs Où A SI : are du pc de chromatographe de l on le plus abondant du congénère marqué au et présent dans le standard nterne (IS) A y RS : are du pc de chromatographe de l on le plus abondant du congénère y marqué au et présent dans le standard de recouvrement (RS) SI : quantté du congénère, marqué au provenant de l IS yrs : quantté du congénère y, marqué au provenant du RS RRF m : facteur de réponse relatf moyen du congénère marqué au (IS) relatf au congénère y marqué au (RS) oncentraton dans l échantllon La quantté d un congénère dans l échantllon est calculée de la manère suvante : 1 RRF SI. A 1 Où : quantté du congénère présent dans l échantllon analysé : quantté du congénère marqué au (IS) A : are du pc de chromatographe de l on le plus abondant du congénère A : are du pc de chromatographe de l on le plus abondant du congénère marqué au (IS) RRF m : facteur de réponse relatf moyen du congénère natf relatf au congénère marqué au (IS) obtenu lors de l étalonnage m. A m

11 Date de Verson : 30// Page : 11/11 Lorsque le congénère marqué au ne provent pas de l IS, mas du RS, ce congénère ne peut être utlsé à des fns de quantfcaton. Dans ce cas, un autre congénère du même degré de chloraton et présent dans l IS dot être utlsé en leu et place de l sotopomère. La concentraton d un congénère dans l échantllon ( ) est calculée de la manère suvante : échantllo n Bcorrespondant Masseéchantllon La concentraton totale ( T ) exprmée en WHO-TE est calculée en addtonnant les concentratons des 17 PDD/Fs et des DL-PBs, chacune multplées par son facteur d équvalence toxque (WHO-TEF). T. WHO TEF Où T : concentraton en PDD/Fs et DL-PBs exprmée en équvalent toxque de l OMS. : concentraton du congénère dans l échantllon. WHO-TEF : facteur d équvalence toxcologque de l OMS du congénère.