05_I7_B_Pro_03.doc I7- Immunologie Fiche sujet - élève RECHERCHE D ANTICORPS ANTI-BSA (ALBUMINE DE SERUM DE BŒUF) PAR L'UTILISATION DU TEST ELISA

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1 Fiche sujet - élève L organisme réagit à l introduction d un élément étranger par la production d anticorps. On cherche à déterminer si un lapin a été contaminé par un élément étranger. On utilise pour cela un test ELISA. Matériel - une barrette de 3 puits au fond desquels sont fixés des antigènes BSA (albumine de sérum de bœuf) ; - sérum d un lapin contaminé par la BSA ; - eau distillée ; - sérum du lapin à tester ; - solution d anticorps conjugués Ac2 = complexe entre anticorps et enzyme ; - solution de lavage ; - solution de substrat de l enzyme peroxydase = H 2 O 2 (l action de l enzyme sur ce substrat se traduit par une coloration) ; - micropipettes (ou équivalent), gants, un feutre effaçable, un chronomètre. Activités et déroulement des activités Capacités et principaux critères d évaluation Barème 1. Mettre en œuvre le protocole fourni en suivant les indications de la fiche technique. Répondre à la question 2 et préparer la 3 pendant les temps d attente. 2. Préciser l intérêt du test avec l eau distillée et avec le sérum d un lapin contaminé. Justifier les temps d incubation des étapes 2 et 6 du protocole. Réaliser une manipulation d après un protocole respect des étapes du protocole utilisation maîtrisée du matériel organisation et rangement de la paillasse Adopter une démarche explicative 9 3 Appeler l examinateur pour vérifier les résultats et obtenir éventuellement un document de secours 3. Construire un tableau comprenant les résultats de la manipulation et les schémas des molécules présentes dans les puits en fin de test. Ces schémas respecteront les modèles de la fiche document et montreront les associations moléculaires. 4. Déduire des résultats obtenus (ou indiqués sur le document de secours) si le lapin à tester a été contaminé. Présenter des données dans un tableau Traduire des informations par un schéma Adopter une démarche explicative 6 2

2 Fiche document - élève Principe du test de détection d anticorps Un sérum de lapin contaminé contient des anticorps Ac1 spécifiques de l antigène. Si ces anticorps sont effectivement présents dans le sérum, ils reconnaissent l antigène fixé au fond du puits. Les anticorps Ac2 sont spécifiques des anticorps Ac1 ; dans le protocole du test ELISA, ils sont fixés à une enzyme : la peroxydase. Cette enzyme catalyse une réaction colorée en présence d un substrat incolore. Planche de schémas permettant la réalisation du schéma explicatif à l'échelle moléculaire :

3 Fiche technique - élève PROTOCOLE 1- Repérer les puits et déposer dans chacun d eux, 2 gouttes des produits suivants : sérum d un lapin contaminé par la BSA, eau distillée, sérum du lapin à tester. 2- Laisser incuber 15 min à température ambiante. 3- Vider la barrette en la renversant d un geste rapide au-dessus de l évier de manière à éviter le mélange des produits. Tamponner ensuite les puits sur du papier filtre pour éliminer l excès de produits et éviter la contamination. 4- Laver les puits : remplir tous les puits avec la solution de lavage et vider immédiatement comme précédemment. Répéter 2 fois ce lavage. 5- Mettre dans les puits 2 gouttes de la solution de conjugué Ac2 sur lequel est fixée l enzyme peroxydase. 6- Laisser incuber quelques minutes. 7- Vider les puits et les laver 2 fois comme à l étape Mettre dans les puits 2 gouttes de substrat de l enzyme peroxydase. Attendre quelques minutes qu une coloration éventuelle se développe.

4 Fiche réponse élève ISA ETABLISSEMENT : Classe : Nom - Prénom : A rendre à l issue de l épreuve

5 Fiche laboratoire 1/2 I / Matériel : - kit test ELISA SORDALAB (matériel pour 20 manipulations) ou kit JEULIN, référence (36 manipulations). Ou bien : - des puits de plaque ELISA ; barrettes de 8 puits SORDALAB - une plaque ( 12 barrettes ), référence PLAQ1, ou 5 plaques, référence PLAQ5 ; - sérum de lapin anti-bsa (albumine de sérum de bœuf) et sérum de lapin non immun ; SIGMA (L Isle d Abeau Chesnes BP St Quentin Fallavier ) - référence B ml ; - conjugué = anticorps anti-anticorps de lapin couplé à la peroxydase ; SIGMA, référence A1949-0,5 ml ; - Tween 20 ; SIGMA. Variante pour protocole de réalisation sans kit : - préparer une solution de BSA à 5µg/ml dans du tampon phosphate (0,26 g de phosphate monosodique + 2,2 g de phosphate disodique + 9 g de NaCl pour 1 litre, ph 7,2 avec HCl ), - préparer une solution PBST = PBS + 0,1% Tween (solution tampon contenant un détergent = solution de lavage), - préparer une solution de PBSA = PBS + 0,5% BSA (solution d antigène à fixer au fonds des puits), - préparer la solution d anticorps anti-bsa = dilution 1/10000 dans PBS, - préparer la solution d anticorps conjugué selon les indications du fabricant ; pour la référence SIGMA dilution 1 / dans PBSA, - préparer la solution PBSC = 1% caséine dans PBST (la caséine sert à bloquer les sites non spécifiques du plastique des plaques). Préparer à l avance les plaques ELISA («coater» les plaques avec l antigène = fixer l'antigène au fond des puits) : remplir les puits avec 100 µl de la solution de BSA et incuber soit 2 h à température ambiante soit toute la nuit à 4 C. On peut alors utiliser les plaques pour le test. On peut aussi les conserver au congélateur indéfiniment après les avoir vidées, ou bien les conserver à 4 C pendant quelques jours après les avoir vidées et avoir rempli les puits avec du PBS (emballer les plaques dans de l aluminium ou du film transparent). Pour réduire la durée de la manipulation élève, on peut faire juste avant la séance les étapes 1 et 2 du protocole élève, donc modifier la fiche technique en conséquence. Il vaut mieux préparer les solutions d anticorps au dernier moment ainsi que le substrat de l enzyme. Pour vider les plaques, il suffit de les retourner énergiquement au dessus d un évier ou d un récipient si on veut récupérer les solutions qu elles contiennent. II / Protocole : Pour le protocole du test, voir la fiche technique élève ou suivre les indications des fabricants pour les kits. L élève devra disposer d une fiche technique adaptée au matériel prévu. Si les élèves savent utiliser des micropipettes automatiques, on peut travailler avec des quantités fixes et précises de 100 µl. Fournir seulement 3 puits aux élèves. Dans la barrette de 3 puits, des antigènes appelés BSA (albumine de sérum de bœuf) ont été fixés au fond des puits. Retourner énergiquement la barrette au-dessus de l évier afin d éliminer l excédant d antigène. Déposer dans les puits 2 gouttes de solution PBSC et incuber 5 min. Vider la barrette en retournant énergiquement la barrette au dessus de l évier. Suivant les groupes, on pourra donner comme sérum à tester soit du sérum contaminé, soit du sérum non contaminé et varier ainsi les résultats. Le document de secours est à choisir conformément au sérum proposé à l élève : document de secours 1/2 ou 2/2 (correspondant au type de kit utilisé), à imprimer (tirage couleur de qualité) ou à afficher à l écran ; utiliser alors le fichier à choisir parmi 05_I7_B_Pro_03a.doc ou 03b ou 03c ou 03d.

6 Document de secours 1/2 Kit Sordalab RESULTATS OBTENUS 1 : sérum de lapin contaminé 2 : eau distillée 3 : sérum à tester 1 2 3

7 Document de secours 2/2 Kit Sordalab RESULTATS OBTENUS 1 : sérum de lapin contaminé 2 : eau distillée 3 : sérum à tester 1 2 3

8 Document de secours Kit APBG RESULTATS OBTENUS 1 : sérum de lapin contaminé 2 : eau distillée 3 : sérum à tester 1 2 3

9 Document de secours Kit APBG LISA RESULTATS OBTENUS 1 : sérum de lapin contaminé 2 : eau distillée 3 : sérum à tester 1 2 3

10 Fiche barème d'évaluation Capacités et critères d évaluation ( en gras, évaluation pendant la séance ) Barème Nom des élèves 1- Réaliser une manipulation d après un protocole : - respect des différentes étapes du protocole ; - utilisation maîtrisée du matériel ; - repérage des produits et des puits ; - résultats : coloration (ou non) dans le puits 3 en fonction du sérum fourni ; - organisation de la paillasse et rangement du matériel en fin de manipulation. 2- Adopter une démarche explicative : - test avec eau distillée : témoin, non coloré car pas d anticorps ; - test avec sérum de lapin contaminé : référence (accepter témoin) colorée, car présence certaine d anticorps ; - la première incubation permet aux anticorps anti-bsa éventuellement présents d avoir le temps de se fixer, la deuxième incubation laisse le temps à l anticorps conjugué de se fixer sur l anticorps anti-bsa. 3- Représenter des résultats sous forme d un tableau : - choix raisonné des intitulés des lignes et des colonnes ; - contenu des cases (relation coloration et molécules présentes) ; 3 - rédaction d un titre cohérent. - Traduire des informations par un schéma : - respect des modèles proposés ; - associations moléculaires correctes et cohérence entre résultats et schémas proposés Adopter une démarche explicative : - cohérence de la déduction avec les résultats du tableau 2 Note /

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