RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex
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- Henriette Picard
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1 RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex Réf. : G09031 / G09031A R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Allemagne Tél. : +49 (0) / Fax : +49 (0)
2 1. Application Pour usage diagnostique in vitro. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex est un test immunoenzymatique destiné à la détermination quantitative des complexes hémoglobinehaptoglobine humains dans des échantillons de selles. 2. Résumé et explication du test Chaque année, l'allemagne recense près de nouveaux cas de cancer de l'intestin, et environ personnes meurent tous les ans des suites de cette maladie. Le carcinome du côlon est donc l'une des formes de cancer les plus fréquentes et provoque des décès dans toute la nation. Environ 10 % des nouveaux cas sont classés dans un groupe à haut risque. Compte-tenu de la forte incidence de la maladie, l'association médicale allemande Bundesärztekammer recommande de faire pratiquer des examens préventifs réguliers à partir de 50 ans. Les carcinomes du côlon se développent lentement, sur une période de 10 à 12 ans, à partir d'adénomes visibles sous macroscopie, qui sont souvent présents sans changement pendant une longue durée. Si ces formes sont détectées et éradiquées à un stade précoce, les perspectives de guérison et de récupération complète sont très bonnes. La coloscopie constitue la méthode de détection directe de référence. Les carcinomes et certains adénomes plus volumineux libèrent du sang/de l'hémoglobine par intermittence dans la lumière de l'intestin. Le complexe hémoglobine-haptoglobine (Hb/Hp), qui joue un rôle important dans la récupération de l'hémoglobine dans les érythrocytes lysés, entre dans l'intestin par la même voie. L'hémoglobine et les complexes Hb/Hp peuvent tous deux servir à détecter la présence de sang masqué (invisible) dans les selles. La méthode de test non invasive, qui est aujourd'hui la plus utilisée pour détecter le sang occulte dans les selles, consiste à convertir la teinture de gaïac incolore en colorant bleu sous l'effet de l'activité non spécifique de la pseudo-peroxydase qu'assure le noyau porphyrique (hème), qui est le principal composant fonctionnel de l'hémoglobine. Le test ne repose donc pas sur la chaîne protéique spécifique à l'espèce de l'hémoglobine humaine, ce qui peut générer de faux positifs en présence d'hémoglobine et de myoglobine issues de produits à base de viande animale ou de composants alimentaires ayant une activité de peroxydase (par ex. fruits et légumes de type radis et raifort). Les faux négatifs peuvent être dus à des matières végétales secondaires telles que les antioxydants (par ex. dans le vin rouge) et à la vitamine C (acide ascorbique), qui est ajoutée à de nombreux aliments en guise que conservateur. Sans régime suffisamment contrôlé avant et pendant le prélèvement d'échantillons, la méthode de test à la teinture de gaïac ne permet pas de garantir la pertinence des résultats. Cela s'explique en partie par la faible sensibilité (28-40 %) de ce type de méthode de test. Utilisant des anticorps spécifiques, qui détectent seulement l'hémoglobine humaine ou le complexe hémoglobine-haptoglobine humain, les tests immunologiques modernes présentent un avantage RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 2
3 manifeste par rapport à la détection biochimique des tests à la teinture de gaïac. Il est inutile de faire un régime avant le test et les faux positifs dus à des composants alimentaires sont quasiment exclus. Le test immunologique est également sensible à des concentrations d'hémoglobine humaine 100 fois inférieures à celles nécessaires avec les méthodes biochimiques. La détermination des complexes hémoglobine-haptoglobine présente un autre avantage en termes de diagnostic. Le complexe Hb/Hp étant très résistant à la décomposition par les acides ou les enzymes protéolytiques, il reste détectable dans les selles après de longues périodes dans l'intestin. Par conséquent, des adjuvants du sang provenant de polypes intestinaux plus volumineux ou de carcinomes du côlon situés plus haut dans l'intestin peuvent également être détectés avec une grande sensibilité. Concernant la détection précoce du cancer de l'intestin (carcinome du côlon jusqu'à 96 % et adénomes plus volumineux jusqu'à 80 %), la sensibilité maximale a été obtenue dans le cadre d'études utilisant la détermination immunologique combinée de l'hémoglobine (par ex. RIDASCREEN Haemoglobin ; réf. G09030) et du complexe hémoglobine-haptoglobine. Dans la mesure où les carcinomes et les polypes peuvent plus ou moins saigner par intermittence, il est conseillé d'analyser plusieurs (2 à 3) échantillons de selles, y compris avec des méthodes de détection immunologiques. Le diagnostic plus fiable et, dans certains cas, plus précoce que l'on peut obtenir avec les tests immunologiques permet généralement d'éliminer les polypes, les adénomes et les carcinomes plus tôt dans le cadre d'une coloscopie ultérieure. Cela améliore les pronostics de guérison et diminue les frais pour les patients. 3. Principe du test Le test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex a recours à des anticorps spécifiques dans le cadre d'une méthode de type sandwich. Des anticorps polyclonaux dirigés contre les épitopes de l'haptoglobine humaine sont appliqués à la surface du puits de la microplaque. Une suspension de l'échantillon de selles à tester est pipetée dans un puits de la microplaque, puis incubée. Cette étape est suivie d'un lavage, puis d'une seconde phase d'incubation avec un anticorps monoclonal anti-hémoglobine conjugué à de la peroxydase de raifort. En présence du complexe hémoglobine-haptoglobine, un complexe en sandwich se forme à partir des anticorps immobilisés, du complexe Hb/Hp et des anticorps conjugués. Les anticorps marqués à l'enzyme non liés sont éliminés au cours de l'étape de lavage suivante. Si le test est positif, l'enzyme liée change de couleur après l'ajout du substrat : précédemment incolore dans les puits de la microplaque, elle devient bleue. Lors de l'ajout du réactif d'arrêt, la couleur passe du bleu au jaune. L'extinction mesurée est proportionnelle à la concentration de complexe hémoglobinehaptoglobine présent dans l'échantillon. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 3
4 4. Réactifs fournis Une trousse suffit pour 96 déterminations. Tableau 1: Contenu de la trousse RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex (G09031) Plate 96 dét. Microplaque, 12 barrettes à micropuits (sécables) sur le support ; revêtue d'anticorps polyclonaux (de lapin) dirigés contre l'haptoglobine humaine Extract 10x 100 ml Tampon d'extraction 10x (concentré 10 fois) ; solution de NaCl tamponnée au phosphate ; contient du Tween et 0,1 % de NaN 3 Diluent ml Tampon de dilution d'échantillon 3 (pour dilution finale), solution de NaCl tamponnée à la protéine ; contient 0,1 % de NaN 3 ; prêt à l'emploi ; rouge Wash 10x 100 ml Tampon de lavage 10x (concentré 10 fois), solution de NaCl tamponnée au phosphate ; contient 0,1 % de thimérosal Calibrator 4 unités Étalon (pour l'étalonnage standard) ; 0,5 ml, lyophilisé Control + 4 unités Contrôle positif ; 0,5 ml, lyophilisé Low control + 4 unités Contrôle faiblement positif ; 2 ml, lyophilisé Conjugate 12 ml Conjugué ; anticorps monoclonal dirigé contre l'hémoglobine humaine (de souris) conjugué à de la peroxydase dans une solution protéique stabilisée ; prêt à l'emploi SeroSC 12 ml Substrat ; peroxyde d'hydrogène / TMB ; prêt à l'emploi SeroStop 12 ml Réactif d'arrêt, acide sulfurique 1 N ; prêt à l'emploi RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 4
5 Une trousse suffit pour 192 déterminations. Tableau 2: Contenu de la trousse RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex (G09031A) Plate 2 x 96 dét. Microplaque, 12 barrettes à micropuits (sécables) sur le support ; revêtue d'anticorps polyclonaux (de lapin) dirigés contre l'haptoglobine humaine Extract 10x 2 x 100 ml Tampon d'extraction 10x (concentré 10 fois) ; solution de NaCl tamponnée au phosphate ; contient du Tween et 0,1 % de NaN 3 Diluent 3 2 x 100 ml Tampon de dilution d'échantillon 3 (pour dilution finale), solution de NaCl tamponnée à la protéine ; contient 0,1 % de NaN 3 ; prêt à l'emploi ; rouge Wash 10x 2 x 100 ml Tampon de lavage 10x (concentré 10 fois), solution de NaCl tamponnée au phosphate ; contient 0,1 % de thimérosal Calibrator 4 unités Étalon (pour l'étalonnage standard) ; 0,5 ml, lyophilisé Control + 4 unités Contrôle positif ; 0,5 ml, lyophilisé Low control + 4 unités Contrôle faiblement positif ; 2 ml, lyophilisé Conjugate 2 x 12 ml Conjugué ; anticorps monoclonal dirigé contre l'hémoglobine humaine (de souris) conjugué à de la peroxydase dans une solution protéique stabilisée ; prêt à l'emploi SeroSC 2 x 12 ml Substrat ; peroxyde d'hydrogène / TMB ; prêt à l'emploi SeroStop 2 x 12 ml Réactif d'arrêt, acide sulfurique 1 N ; prêt à l'emploi 5. Instructions de conservation Tous les réactifs, ainsi que l'étalon lyophilisé, le contrôle positif et le contrôle faiblement positif, doivent être conservés entre 2 et 8 C. Dans ces conditions, ils peuvent être utilisés jusqu'à la date de péremption imprimée sur l'étiquette du réactif concerné. Après avoir remis l'étalon en solution, le contrôle positif et le contrôle faiblement positif doivent être utilisés immédiatement dans le test. Les liquides restants doivent être éliminés une fois le test terminé. Le tampon de lavage dilué 10x peut être utilisé pendant 4 semaines au maximum lorsqu'il est conservé entre 2 et 8 C. La contamination microbienne doit être évitée. Après la date de péremption, la qualité n'est plus garantie. Le sachet en aluminium contenant les barrettes à micropuits doit être ouvert sans arracher le joint d'étanchéité. Les barrettes à micropuits qui ne sont pas nécessaires doivent être remises immédiatement dans le sachet en aluminium et conservées entre 2 et 8 C. Le substrat RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 5
6 incolore doit également être protégé de la lumière directe pour éviter qu'il ne se décompose ou ne bleuisse sous l'effet d'une auto-oxydation. Lorsque le substrat est bleu, il ne doit pas être utilisé. 6. Autres réactifs et matériel nécessaires 6.1. Réactifs - Eau distillée ou désionisée 6.2. Accessoires - Tubes à essai - Micro-balance ou RIDASCREEN Stuhlröhrchen (GZ3002) - Malaxeur au vortex (en option, voir rubriques 9.4 et 9.5) - Micropipette pour volumes de 20 à 100 µl et 1 ml - Éprouvette graduée (1000 ml) - Chronomètre - Laveur de microplaque ou pipettes multicanaux (300 µl) - Lecteur de microplaque (450 nm ; longueur d'onde de référence 620 nm) - Papier filtre (serviettes de laboratoire) - Conteneur de déchets contenant 0,5 % de solution d'hypochlorite 7. Précautions à prendre par l'utilisateur Exclusivement réservé au diagnostic in vitro. Ce test ne doit être réalisé que par un personnel de laboratoire formé. Les consignes de travail dans des laboratoires médicaux doivent être appliquées et les instructions d'exécution du test doivent être respectées à la lettre. L'étalon, le contrôle positif et le contrôle faiblement positif contiennent du sang humain testé négatif pour le VIH et l'hépatite. Malgré tout, ces composants et les échantillons de selles doivent être traités comme des agents potentiellement infectieux et manipulés conformément aux règlements de sécurité nationaux. Les échantillons ou réactifs ne doivent pas être pipetés à la bouche et tout contact avec une peau ou des membranes muqueuses lésées doit être évité. Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons et se laver les mains une fois le test terminé. Ne pas fumer, manger ni boire dans les zones où des échantillons ou des réactifs de test sont utilisés. Le tampon de lavage 10x contient du thimérosal à 0,1 % comme conservateur. Cette substance ne doit pas entrer en contact avec la peau ou les membranes muqueuses. Le tampon d'extraction et de dilution d'échantillon 3 contient 0,1 % de NaN 3 comme conservateur. Cette substance ne doit pas entrer en contact avec la peau ou les membranes muqueuses. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 6
7 Le peroxyde d'hydrogène peut provoquer des brûlures. Le manipuler avec prudence. Le réactif d'arrêt contient de l'acide sulfurique 1 N. Éviter tout contact avec la peau et les vêtements. Si la peau est contaminée par le réactif, la rincer à l'eau. Tous les réactifs et matériaux entrant en contact avec des échantillons potentiellement infectieux doivent être traités avec des désinfectants adaptés ou passés en autoclave à 121 C pendant au moins 1 heure. MISE EN GARDE : Pour éviter que des gaz toxiques ne se forment, tout déchet liquide contenant du réactif d'arrêt doit être neutralisé avant d'ajouter la solution d'hypochlorite. 8. Prélèvement et conservation des échantillons Les échantillons de selles doivent être transportés réfrigérés, dans la mesure du possible, et conservés entre 2 et 8 C avant le test. S'ils ne sont pas utilisés immédiatement à leur arrivée, nous recommandons de les conserver à -20 C ou une température inférieure. Éviter de congeler et décongeler les échantillons plusieurs fois. Les échantillons de selles ne doivent pas être recueillis dans des conteneurs de transport renfermant un milieu de transport et des conservateurs, du sérum animal, des ions métal, des agents oxydants ou des détergents car ces substances peuvent interférer avec le test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin. 9. Procédure de test 9.1. Informations générales Tous les réactifs et la microplaque Plate doivent être ramenés à température ambiante (20-25 C) avant utilisation. Les barrettes à micropuits ne doivent pas être retirées du sachet en aluminium avant d'avoir atteint la température ambiante. Les réactifs doivent être bien mélangés juste avant leur utilisation. Après utilisation, les barrettes à micropuits (placées dans des sachets fermés hermétiquement) et les réactifs doivent être conservés entre 2 et 8 C. Une fois utilisées, elles ne doivent pas être réutilisées. Les réactifs et les barrettes à micropuits ne doivent pas être utilisés si l'emballage est endommagé ou si les flacons fuient. Pour éviter toute contamination croisée, les échantillons ne doivent pas entrer en contact direct avec les composants de la trousse. Le test ne doit pas être réalisé à la lumière directe du soleil. Nous recommandons de couvrir la microplaque ou de placer un film dessus pour éviter toute perte par évaporation Préparation du tampon de lavage Mélanger 1 volume de tampon de lavage 10x Wash 10x avec 9 volumes d'eau distillée (1:10). Les cristaux éventuellement présents dans le concentré doivent être dissouts au préalable, en les réchauffant dans un bain d'eau à 37 C. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 7
8 9.3. Préparation du tampon d'extraction Mélanger 1 volume de tampon d'extraction 10x Extract 10x avec 9 volumes d'eau distillée (1:10). Les cristaux éventuellement présents dans le concentré doivent être dissouts au préalable, en les réchauffant dans un bain d'eau à 37 C Préparation de l'étalon et du contrôle positif (contrôle faiblement positif facultatif) L'étalon Calibrator, le contrôle positif Control + et le contrôle faiblement positif Low control + sont lyophilisés et doivent systématiquement être fraîchement remis en suspension dans le tampon de dilution d'échantillon 3 Diluent 3 juste avant le début du test. Par conséquent, l'étalon Calibrator et le contrôle positif Control + sont à nouveau mis en solution dans 500 µl, tandis que le contrôle faiblement positif Low control + est à nouveau mis en solution dans 2 ml de tampon de dilution d'échantillon 3 Diluent 3. Le lyophilisat doit être entièrement dissout avant utilisation, sans résidu. Un malaxeur au vortex peut être utilisé à cette fin. Les liquides restants doivent être éliminés une fois le test terminé Préparation des échantillons Les échantillons de selles doivent toujours être conservés entre 2 et 8 C, si possible, avant utilisation et traités immédiatement à leur arrivée au laboratoire. S'ils ne sont pas utilisés immédiatement à leur arrivée, nous recommandons de les conserver à -20 C ou une température inférieure. Les échantillons congelés doivent être ramenés lentement à température ambiante Préparation et mise en suspension des échantillons par pesée Peser précisément 100 mg d'échantillon de selles dans un tube à essai étiqueté, puis ajouter exactement 5 ml de tampon d'extraction dilué à l'aide d'une pipette (dilution 1:50). Il est également possible de peser entre 80 et 130 mg de selles, puis de les mettre en suspension dans un volume réduit ou augmenté en conséquence (voir tableau 3) de tampon d'extraction dilué (pour s'assurer que le rapport de dilution [1:50] est constant). RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 8
9 Tableau 3: Quantités de tampon d'extraction dilué requises en fonction de la quantité de selles pesée Poids [mg] Volume [ml] 80 4, , , , , , , , , , ,50 Lors de la remise en suspension de l'échantillon de selles dans un volume fixe de 5 ml de tampon d'extraction, le facteur de dilution variable doit être pris en compte dans l'évaluation (voir tableau 4). Tableau 4: Caractéristique du facteur de dilution en cas d'ajout fixe de tampon d'extraction dilué (5 ml), en fonction de la quantité de selles pesée Poids de l'échantillon [mg] Facteur de dilution [ml] 80 62, , , , , , , , , , ,46 Quelle que soit la méthode employée pour peser l'échantillon, la suspension de selles est homogénéisée en la mélangeant complètement dans un malaxeur au vortex. Si les selles sont liquides, utiliser une pipette pour prélever précisément 100 µl et les mettre en suspension dans exactement 5 ml de tampon d'extraction dilué. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 9
10 La suspension homogénéisée doit ensuite être centrifugée à plus de 3000 g pendant 10 minutes pour sédimenter les grosses particules de selles. a. Dilution manuelle de l'échantillon Diluer 100 µl du surnageant clarifié dans 900 µl de tampon de dilution d'échantillon 3 Diluent 3 (1:10). Ensuite, utiliser 100 µl d'échantillon de selles ayant subi la dilution finale pour le test. Il est également possible d'utiliser un flacon de coproculture RIDASCREEN Stuhlröhrchen (réf. GZ3002, voir ) comme méthode de préparation et d'homogénéisation de l'échantillon. b. Dilution d'échantillon dans un système automatisé Si le test doit être effectué sur un système ELISA automatisé DSX (Dynex Technologies, Inc.), le protocole de test à appliquer doit être demandé auprès de R-Biopharm AG et installé sur le système. Ce système effectue une dilution d'échantillon automatisée, comme expliqué cidessous. Le système ELISA automatisé commence par pipeter 50 µl de surnageant clarifié dans une plaque à puits profonds, puis les dilue dans 450 µl de tampon d'extraction dilué (1:10). Deux cycles de mélange sont ensuite réalisés. Le nombre de puits revêtus requis est introduit dans le support de la microplaque RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex Plate. Le système retire 100 µl d'aliquotes de l'échantillon dilué de la plaque à puits profonds, puis les transfère vers la microplaque RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex Microwell Plate (dilution finale : 1:500). Pour obtenir des instructions sur l'exécution du test avec d'autres systèmes de pipetage automatisés ELISA, contacter R-Biopharm AG Préparation et mise en suspension de l'échantillon à l'aide de RIDASCREEN Stuhlröhrchen (réf. GZ3002) Comme expliqué dans la rubrique 9.5.1, RIDASCREEN Stuhlröhrchen (réf. GZ3002) peut représenter une alternative à la fois rapide et propre à la procédure de préparation et de mise en suspension des échantillons, qui nécessite de peser les échantillons de selles. Ces tubes, qui sont fournis en tant qu'accessoires au test RIDASCREEN Haemoglobin, simplifient considérablement la préparation des échantillons. Chaque flacon RIDASCREEN Stuhlröhrchen est pré-rempli avec 2,5 ml de tampon d'extraction prêt à l'emploi et peut accueillir un échantillon de selles de 10 mg. Pour traiter des échantillons de selles liquides, il est possible de mesurer 10 µl de l'échantillon de selles à l'aide de la pipette, puis de placer directement la substance pipetée dans le tampon d'extraction. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 10
11 La procédure de prélèvement et d'extraction d'échantillon est décrite en détails dans la notice, qui est fournie dans l'emballage de chaque RIDASCREEN Stuhlröhrchen. Cette notice peut également être téléchargée sur le site Les extraits de selles ne doivent pas être conservés plus de 48 h entre 2 et 8 C. a. Dilution manuelle de l'échantillon Diluer 50 µl de la suspension de selles présente dans le flacon RIDASCREEN Stuhlröhrchen (réf. GZ3002) avec 50 µl de tampon de dilution d'échantillon RIDASCREEN 3 Diluent 3 directement dans la microplaque, comme expliqué dans la rubrique 8 de la notice du produit GZ3002. b. Dilution automatique de l'échantillon Si le test doit être effectué sur un système ELISA automatisé DSX (Dynex Technologies, Inc.), le protocole de test à appliquer doit être demandé auprès de R-Biopharm AG et installé sur le système. Le nombre de puits revêtus requis est placé dans le support de la microplaque RIDASCREEN Haemoglobin Complex Plate. Lorsqu'un système ELISA automatisé est utilisé, la suspension de selles extraite dans un flacon RIDASCREEN Stuhlröhrchen est automatiquement diluée selon un rapport 1:2 (dilution finale : 1:500) sur la microplaque Plate. Pour ce faire, 50 µl de la suspension de selles sont pipetés directement du flacon RIDASCREEN Stuhlröhrchen (réf. GZ3002) dans la microplaque RIDASCREEN Haemoglobin, puis dilués avec 50 µl de tampon de dilution d'échantillon 3 Diluent 3. Pour obtenir des instructions sur l'exécution du test avec d'autres systèmes de pipetage automatisés ELISA, contacter R-Biopharm AG Première incubation Après avoir placé un nombre de puits suffisant dans le support, ajouter 100 µl d'étalon Calibrator dilué (en double), de tampon de dilution d'échantillon Diluent 3 (= contrôle négatif), de contrôle positif Control + et de suspension de selles à analyser dans les puits qui conviennent. Le cas échéant, ajouter également 100 µl du contrôle faiblement positif Low control + dans les puits appropriés. Ensuite, incuber la plaque à température ambiante (20-25 C) pendant 1 heure. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 11
12 9.7. Premier lavage Il est important de réaliser le lavage soigneusement pour obtenir des résultats corrects et donc, de respecter les instructions à la lettre. La substance incubée dans les puits doit être vidée dans un conteneur de déchets contenant de l'hypochlorite à des fins de désinfection. Ensuite, retourner la plaque et la tapoter vigoureusement contre un papier absorbant pour s'assurer que tout le liquide a été retiré des micropuits. Ensuite, laver la plaque 5 fois systématiquement avec 300 µl de tampon de lavage dilué (voir la rubrique 9.2). S'assurer que les puits sont complètement vidés en les tapotant sur un morceau de papier absorbant encore sec et inutilisé après chaque lavage. Lorsqu'un laveur de microplaque est utilisé, s'assurer qu'il est correctement réglé par rapport au type de microplaque utilisée. En outre, une suspension de selles qui contient encore des particules avant le premier lavage doit être homogénéisée manuellement par centrifugation pour éviter d'obstruer les aiguilles de lavage. S'assurer également que tout le liquide est aspiré à chaque étape de lavage. Après le dernier lavage, retourner la plaque et la tapoter vigoureusement contre un papier absorbant pour s'assurer que tout le liquide a été retiré des micropuits Seconde incubation Pipeter 100 µl de conjugué Conjugate dans chaque puits. Ensuite, incuber la plaque à température ambiante (20-25 C) pendant 1 heure Second lavage La substance incubée dans les puits doit être vidée dans un conteneur de déchets contenant une solution d'hypochlorite à des fins de désinfection. Retourner la plaque et la tapoter vigoureusement contre un papier absorbant pour s'assurer que tout le liquide a été retiré des micropuits. Ensuite, laver la plaque 5 fois systématiquement avec 300 µl de tampon de lavage dilué. Retourner la plaque et la tapoter vigoureusement contre un papier absorbant pour s'assurer que tout le liquide a été retiré des micropuits Troisième incubation Ajouter 100 µl de substrat SeroSC dans chaque puits. Ensuite, incuber la plaque à température ambiante (20-25 C), dans le noir, pendant 15 minutes. Puis, arrêter la réaction en ajoutant 50 µl de réactif d'arrêt SeroStop dans chaque puits. Après un mélange soigneux (en tapotant légèrement le côté de la plaque), mesurer l'extinction à 450 nm (longueur d'onde de référence 620 nm) dans un lecteur de plaque. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 12
13 10. Contrôle qualité signes de réactif périmé À des fins de contrôle qualité, l'étalon Calibrator (en double), le contrôle positif Control + et le tampon de dilution d'échantillon 3 Diluent 3 servant de contrôle négatif doivent être utilisés à chaque test pour s'assurer que les réactifs sont stables et que le test se déroule correctement. Le test s'est bien déroulé si l'extinction (DO) du contrôle négatif à 450 nm / 620 nm est inférieure à 0,015 et que l'extinction déterminée (DO) de l'étalon se situe dans la plage spécifique au lot indiquée sur la fiche technique jointe. Pour valider les résultats de test, il est recommandé d'utiliser le contrôle positif en routine. Dans ce cas, le contrôle positif doit se situer dans la plage spécifique au lot indiquée sur la fiche technique. Si le test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex est utilisé sur des appareils de traitement ELISA, la valeur DO mesurée de l'étalon Calibrator peut être différente de celle indiquée sur la fiche technique spécifique au lot, selon l'instrument utilisé. Le contrôle positif est donc décisif pour la validité des résultats et doit toujours être employé lorsque le test est pratiqué sur des appareils de traitement ELISA. L'utilisation du contrôle faiblement positif Low control + est facultative. Des valeurs qui diffèrent de celles requises et un substrat trouble ou bleu avant d'être ajouté dans les puits peuvent être des signes indiquant que les réactifs sont périmés. En cas d'écart par rapport aux valeurs indiquées, les points suivants doivent être contrôlés avant de recommencer le test : Date de péremption des réactifs utilisés Capacité de fonctionnement de l'équipement utilisé (par ex. étalonnage) Procédure de test correcte Inspection visuelle des composants de la trousse à la recherche d'une contamination ou de fuites ; une solution de substrat devenue bleue ne doit pas être utilisée. Si les conditions ne sont toujours pas satisfaites après avoir recommencé le test, consulter le fabricant ou un distributeur R-Biopharm local. 11. Évaluation et interprétation Quantification à un point selon la loi log-logistique à 4 paramètres La concentration du complexe hémoglobine-haptoglobine en µg/g de selles est déterminée avec le test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex, selon la loi log-logistique à 4 paramètres (4PL). Le logiciel d'évaluation RIDA SOFT Win.net est nécessaire pour calculer les résultats. RIDA SOFT Win.net ou une mise à jour sont disponibles auprès de R-Biopharm AG ou du distributeur R-Biopharm local. RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 13
14 Les paramètres (A - D) de la courbe d'étalonnage requis pour le calcul 4PL et la valeur théorique de l'étalon, du contrôle positif et du contrôle faiblement positif sont répertoriés sur la fiche technique spécifique au lot jointe à la trousse et doivent être comparés aux valeurs indiquées dans le logiciel d'évaluation avant chaque mesure. R-Biopharm AG a déterminé la courbe d'étalonnage (y compris les paramètres A - D), ainsi que la valeur théorique et la plage autorisée de l'étalon, du contrôle positif et du contrôle faiblement positif dans des conditions optimales pour chaque lot de trousses lors du contrôle qualité final. L'étalon Calibrator est testé en routine afin de compenser les fluctuations de test et de contrôler la qualité de chaque analyse. En cas de traitement manuel, le contrôle positif est exclusivement réservé à la validation interne du laboratoire. Si l'analyse est réalisée sur des appareils de traitement ELISA, le contrôle positif est décisif pour la validité des résultats de test. La valeur moyenne de la double détermination du contrôle et de l'étalon et sa valeur théorique permet au logiciel RIDA SOFT Win.net de calculer un facteur de correction F en interne puis de le rapprocher des extinctions pour les échantillons de selles. Une évaluation sûre et fiable des résultats de test peut être réalisée dans le cadre des limites de la courbe d'étalonnage. Un autre logiciel d'évaluation disposant de la loi log-logistique à 4 paramètres peut également être utilisé en tant qu'alternative au RIDA SOFT Win.net Résultat du test Avec une valeur seuil > 2 µg/g du complexe hémoglobine-haptoglobine dans des échantillons de selles humaines, le résultat doit être considéré comme positif. Si les résultats se situent audessous de la valeur seuil, les échantillons doivent être considérés comme négatifs. Nous recommandons à chaque laboratoire d'établir sa propre plage de valeurs standard. 12. Limites de la méthode Le test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex détecte les épitopes du complexe hémoglobine-haptoglobine humain dans les échantillons de selles. La présence de sang dans les selles peut être due à d'autres facteurs n'ayant rien à voir avec le cancer de l'intestin. Le test ne peut pas servir à établir une relation entre l'extinction déterminée et l'apparition de graves symptômes cliniques. Les résultats obtenus doivent toujours être interprétés conjointement au tableau clinique. Un résultat positif indique clairement une source de saignement dans l'intestin, mais peut également être dû à des facteurs non spécifiques du patient (par ex. saignement menstruel chez les femmes ou hémorroïdes). Un résultat négatif n'exclut pas un risque d'évolution pathologique du saignement de la paroi intestinale. Il peut être dû à une ségrégation intermittente du sang et au manque d'antigène associé dans l'échantillon ou une répartition hétérogène du complexe hémoglobine- RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 14
15 haptoglobine dans l'échantillon de selles. S'il existe des motifs anamnestiques de suspecter une maladie intestinale sérieuse, nous recommandons de tester plusieurs échantillons (2 à 3) de défécations séquentielles. 13. Performances Qualité du test Le test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex a été étudié en termes de sensibilité et de spécificité sur 80 échantillons de selles au cours d'une étude menée dans un laboratoire externe, et comparé au test immunochimiluminométrique (ILMA) utilisé en routine. Les recherches ont présenté la corrélation suivante : Sensibilité : % Spécificité : 91,3 % Limite de détection La limite de détection du test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex a été calculée en ajoutant la valeur B 0 (n=22) et deux fois son écart-type. Il en ressort une limite de détection de 0,38 µg/g de selles pour le complexe hémoglobinehaptoglobine Réactivité croisée Différents échantillons de sang d'animaux utilisés dans la production d'aliments ont été testés avec RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex. Aucune réactivité croisée n'a été observée (voir tableau 5). Tableau 5: Réactivité croisée de RIDASCREEN échantillons de sang non humains Échantillons Dilution/ Concentration DO Contrôle négatif (Diluent 3) 0,004 Contrôle positif (sang humain) 1/ ,581 Sang de chèvre 1:10 0,006 Sang de chèvre 1:100 0,003 Sang de cheval 1:10 0,004 Sang de cheval 1:100 0,003 Sang de mouton 1:10 0,005 Sang de mouton 1:100 0,004 Sang de poule 1:10 0,004 Sang de poule 1:100 0,004 Haemo-/Haptoglobin Complex avec des RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 15
16 13.4. Précision La reproductibilité intra et inter-test de RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex a été déterminée en procédant à plusieurs déterminations (n=72 ou n=24) de deux concentrations de sang différentes, sur différents jours, dans des conditions optimales. Les résultats sont exposés dans les tableaux 6 et 7. Tableau 6: Reproductibilité intra-test Intra-test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex Concentration 1 Concentration 2 Moyenne (DO) 0,285 1,186 ET 0,021 0,059 CV % 7,3 5,0 Tableau 7 : Reproductibilité inter-test Inter-test RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex Concentration 1 Concentration 2 Moyenne (DO) 0,296 1,214 ET 0,013 0,050 CV % 4,4 4,1 RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 16
17 Bibliographie 1. Lüthgens K, Maier A, Kampert I, Sieg A, Schmidt-Gayk H. Hemoglobin-Haptoglobin- Complex: A Highly Sensitive Assay for the Detection of Fecal Occult Blood. Clin Lab 1998; 44: Sieg A, Thoms C, Lüthgens K, John MR, Schmidt-Gayk H. Detection of colorectal neoplasms by the highly sensitive hemoglobin-haptoglobin complex in feces. Int J Colorectal Dis 1999; 14(6): Meguro T. Measurement of fecal hemoglobin-haptoglobin complex as a new diagnostic tool of lower gastrointestinal tract diseases. Hokkaido Igaku Zasshi 1994; 69(4): Xing PX, Young GP, Ho D, Sinatra MA, Hoj PB, McKenzie IF. A new approach to fecal occult blood testing based on the detection of haptoglobin. Cancer 1996; 78(1): Xing PX, Young G, McKenzie IFC. Development of a fecal occult blood test using a monoclonal antibody to haptoglobin. Redox Report 2001; 6(6): (3). 6. Labortipp: Sensitiver Test hilft, Tumoren im Kolon zu finden. Ärzte Zeitung RIDASCREEN Haemo-/Haptoglobin Complex 2021/05/13 17
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