Caractérisation génétique par la compatibilité végétative et l effet de certain Triazoles sur la croissance du Fusarium oxysporum

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1 Caractérisation génétique par la compatibilité végétative et l effet de certain Triazoles sur la croissance du Fusarium oxysporum f.sp.radicislycopersici

2 Après avoir remercié dieu le tous puissant qui m a aidé d accomplir mes études, je tiens à dédier ce modeste travail, fruit de mes années d études à ceux qui ont tant rêvé de cuiller ces fruits. A mes très chers parents que mon cœur les hébrège dans ce bas monde en témoignage de toute l affection que je leur porte et à l expression de mon amour pour tous leurs sacrifices. C est pour eux que j étudie, que je mènerai contre vents et marrés tous les chemins du savoir pour leurs prouver ce que je peux faire déjà aujourd hui et plus encor demain. «Que leurs vœux soient exaucés». A mes petits anges ; mes nièces Douaa et Alaa ; mes neveux : Abd Elsamad, Med Zin, Ismail. A ma sœur Hadjer, mes frères Wahid, Med, Salim et Nadir. A mes belle sœurs Hayet et Mama. A tous mes cousins et cousines ainsi mes amies : Nacera, Asmaa, Dalila, Nouria, Houta, Fathia, Mira, Hasnia et Hala. A mes collègues : Faïza, Mirvet, Abdeslem, Wassim, Younes, Ben Adda, Fouzia, Amina et Med. A tous qui m ont aidé de prés ou de loin Med Gougui, Med enfin, je remercie toute personne qui lira ce mémoire d avoir une pieuse pensé pour mes parents.

3 Les travaux présentés dans cette thèse ont été effectués au laboratoire de phytopathologie sous la direction de Monsieur Henni Jamel Eddine Professeur à la faculté des sciences département de Biologie à l'université d'oran. Je tiens à le remercier de m avoir accueillie dans son laboratoire et de m avoir encadrée tout au long de mes études graduées. Sa disponibilité, son soutient académique ainsi que son éthique de travail mon permis d apprendre énormément tout au long de mon cheminement. J aimerais également le remercier des nombreuses opportunités d acquérir de l expérience professionnelle qu il m a offertes au cours des dernières années. Toutes mes reconnaissances vont à Monsieur Aoues Abdel Kader, Professeur à la faculté des sciences département de Biologie à l'université d'oran, pour l honneur qu il me fait en acceptant de présider le jury malgré ses nombreuses tâches et responsabilités. Je tiens à manifester ma gratitude à Monsieur Kihal Mabrouk, Professeur à la faculté des sciences département de Biologie à l'université d'oran, pour les moyens qu il a mis à ma disposition au sein de son Laboratoire de Microbiologie Appliquée et d avoir accepter de juger ce travail. Mes vifs remerciements s adressent à Monsieur Haddadji Miloud et Guessas Battache Maîtres de conférences à la faculté des sciences département de Biologie à l'université d'oran, pour avoir accepté de juger ce travail. Qu il retrouve ici l expression de ma profonde reconnaissance. J exprime ma plus profonde reconnaissance au Monsieur Karkachi Noreddine, maître assistant à la faculté des sciences département de Biologie à l'université d'oran, a suivi avec un grand intérêt ce travail depuis le début et m a énormément aidé et conseillé jusqu au dernier moment pour le mener à bien. Pour m avoir fourni les substances synthétisées de triazoles nécessaires à mon travail et pour m avoir fait profiter de ses connaissances. Ses critiques et suggestions m ont été fort utiles pour la réalisation de ce document. C est avec émotion, que je voudrais témoigner l expression de mon profond respect. Je tiens à remercier Mme Karkachi Samia, pour ses encouragements constants ainsi que pour son soutien moral qui ont rendu le travail beaucoup plus agréable. Je remercie chaleureusement mes collègues qui m'ont soutenu et aidé moralement et matériellement pendant la réalisation de ce travail Fatiha, Abdeslam. J adresse également des remerciements à l équipe de laboratoire de phytopathologie du Pr Hanni.

4 Sommaire Introduction.... Chapitre 1 : Analyse bibliographique I- La plante hôte (Tomate) Description botanique Origine et historique Étymologie la position systématique Composition biochimique et valeur nutritionnelle Culture de la tomate * Culture en sol...4 * Culture hors-sol Condition de croissance en serre Aspect économique Diverses espèces La culture en Algérie Les principaux ennemis de la culture de tomates Fontes des semis...9 II- La maladie de la tomate...17 *La fusariose vasculaire Origine et historique Description de la fusariose Symptômes de la maladie...20

5 4- Classification scientifique...21 III- La caractérisation génétique du Fusarium oxysporum IV- Moyen de lutte Les méthodes culturelles Les méthodes physiques La lutte biologique...25 *Trichoderma harzianum La lutte chimique...32 *Triazole...34 V- Etude de polymorphisme enzymatique Estérase Phosphatase acide...36 Chapitre 2 : Matériels et méthode I - Le matériel fongique...37 I -1- Origine de la souche I -2- Isolement et purification *A partir du sol...38 *A partir de la plante...38 I -3- Identification des isolats Culture monospore II- Caractérisation

6 II-1- Etude macroscopique (sur boîte pétri)...40 II-2- Etude microscopique...41 II-3- Caractérisation biométrique des isolats...41 II-4- Conservation des isolats...42 III- Etude physiologique III-1- Influence de la température sur la croissance III-2- Influence de la source carbonée sur la croissance...42 III-3- Influence de la source d Azote sur la croissance...43 III-4- Influence du PH sur la croissance...43 III-5- Influence de la lumière et l obscurité sur la croissance...43 III-6- Influence de l humidité sur la croissance...43 IV- Etude de pouvoir pathogène...44 IV-1- la virulence des espèces isolée...44 IV-2- Condition d obtention des plantules...44 IV-3- Préparation de l inoculum et Inoculation...44 IV-4- Estimation des symptômes...45 IV-5- Réisolement de l agent pathogène...45 V- Effet inhibiteur in vitro et in vivo du Trichoderma harzianum sur Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici...46 V-1- Confrontation par contacte direct sur milieu de culture solide...46 V-2- Confrontation à distance sur milieu de culture solide...47 V-3- Effet de Trichoderma sur l expression de la maladie...47

7 VI- Effet inhibiteur in vitro du triazoles sur Fusarium oxysporum f.sp.radicislycopersici...48 VI-1- Evaluation de l effet antifongique des triazoles...48 V-2- Pourcentage d inhibition par rapport au témoin...49 VII- Etude de la VCG...49 VII-1- Le clonage...49 VII-2- La sélection des mutants...50 VII-3- La caractérisation des mutants...50 VII-4- La complémentation...51 VII-5- Mode de regroupement...52 VIII- Technique d étude de polymorphisme enzymatique Culture des champignons Préparation des extraits enzymatiques L électrophorèse Lecture des zymogrammes Analyse des zymogrammes...55 Chapitre III : Résultats et Discussion

8 Annexe Composition des milieux de culture utilisés dans l'étude physiologique de Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici : Milieu PDA (Pomme de terre Dextrose Agar) g/l Pomme de terre Dextrose Agar Eau distillée q.s.p 200 gr 20 gr 15 gr 1000 ml Milieu Czapeck g/l KH 2 PO g Na 2 NO g KCl 0.5 g FeSO 4,7H 2 O 0.1 g Glucose 30.0 g Gelose 20.0g Eau distillée q.s.p ml Milieu Mathur g/l MgSO 4,7 H 2 O KH 2 PO 4 Extrait de levure Peptone Glucose Gélose Eau distillée q.s.p g 2.72 g 0.50 g 1.50 g 2.80 g g 1000 ml Composition des milieux de culture utilisés dans l'étude de la compatibilité végétative chez Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici : Milieu de base : utilisé pour la préparation de tous les autres milieux

9 Saccharose KH2PO4 MgS04 FeS04 KCL Agar Solution d'oligeéléments Eau 30 g l g 0,5 g 1 ml 0,5 g 20 g 0,2 ml l000 ml Milieu de sélection des mutants chlorate-résistants : MMC Milieu de base Asparagine KC103 NaN03 l000 ml 1,6 g 15 g 2g Milieux de caractérisation des mutants pour l'assimilation des nitrates - Milieu nitrate minimum : MM Milieu de base NaN03 l000 ml 2g - Milieu nitrite : NIT Milieu de base NaN ml 0,5 g - Milieu hypoxanthine : HYPO Milieu de base hypoxanthine l000 ml 0,2 g Milieu PDA (Potato Dextrose-Agar): conservation et multiplication des cultures Pomme de terre Glucose Agar Eau distillée 200g 15 g 20 g l000 ml Milieu Asparagine pour la conservation des différents mutants Milieu MM Asparagine 1000 ml 1,6 g

10 Liste des abréviations Abréviations des noms de microorganismes : FCRR: Fusarium crown and root rot F.O.R. L: Fusarium oxysporum f.sp. Radicis-lycopersici F.O.N.P: Fusarium oxysporum non pathogène T:Trichoderma F : Fusarium Principales autres abréviations : C: degré Celsius cm: centimetre FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations. Fig(s). : Figure (s) h: heure min: minute ml: millilitre mm: millimètre PDA: Potato-Dextrose-Agar ph: potentiel Hydrogène q.s.p : quantité suffisante pour MM : Milieu nitrate minimum MMC : Milieu contenant le chlorate HYPO : Milieu Hypoxanthine NIT : Milieu nitrite

11 Chapitre I : Analyse bibliographique Tableau 01 : La tonner de la tomate en éléments nutritif...4 Tableau 02 : Production de la tomate...6 Tableau 03 : Evolution de la production de la tomate en Algérie...7 Tableau 04. : Les ennemies de la tomate...10 Chapitre II : Matériel et Méthodes Tableau 01 : Origine des isolats...37 Tableau 02 : Les cultivars de la tomate...44 Tableau 03 : L identification des mutants...51 Tableau 05 : Composition des gels d acrylamide...55 Tableau 06 : Systèmes enzymatique étudiés...55 Tableau 07 : Milieu réactionnel de révélation des activités enzymatiques...56 Chapitre III : Résultats et Discussion Tableau 01 : caractérisation morphologique et biométriques des isolats...61 Tableau 02. : L influence de la lumière et obscurité sur la croissance...62 Tableau 03. : L influence de la température sur la croissance...64 Tableau 04 : l influence de la source carbonée sur la croissance...66 Tableau 05. : L influence des milieux de culture sur la croissance...68 Tableau 06. : L influence de l humidité sur la croissance...71 Tableau 07. : L influence du PH sur la croissance...72 Tableau 08. : Les mesures de diamètre des colonies traité avec les molécules de Triazoles...85

12 Tableau 09 : Détermination de la CMI Tableau 10: Identification des mutants...102

13 Chapitre I : Analyse bibliographique Figure 01 : Grappe de tomates Solanum lycopersicum...02 Figure 02 : Dommage causé par Phytium ultimum dur des semis de Tomate...10 Figure 03 : Symptôme de racine pourri...21 Figure 04 : Cycle de vie du Fusarium oxysporum...22 Figure 05 : Trichoderma harzianum...26 Chapitre II : Matériels et Méthodes Figure 01 : A. Isolement à partir des racines...39 Figure 01 : B. Isolement à partir des tiges...39 Figure 02 : A. Confrontation de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici et de T. harzianum par contact direct...46 Figure 02 : B. Confrontation à distance entre F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici et T. harzianum...47 Figure 03 : A: mycélium aérien abondant sur la zone de confrontation, résultat Figure 03 : B : aucune apparition de mycélium aérien sur la zone de confrontation, résultat Chapitre III : Résultats et Discussion Figure 01 : Pigmentation des thalles...58 Figure 02 : Microconidies vues sous microscope...59 Figure 03 : Macroconidies vues sous microscope...59 Figure 04 : Chlamydospores vues sous microscope...60

14 Figure 05 : A. l effet de l obscurité sur la croissance...63 Figure 05 : B. l effet de la lumière sur la croissance...64 Figure 06 : Isolat F7 dans différents degrés de température...65 Figure 07 : Isolats F7, F1 dans différents sources de carbone...67 Figure 08 : Isolat F7 dans différents sources d azote...69 Figure 09 : l effet de l humidité sur la croissance...71 Figure 10 : l effet du PH sur la croissance...73 Figure 11 : Réisolement à partir des racines et tiges...75 Figure 12 : La pathogénécité de l isolat F4 sur des variétés de Tomate...76 Figure 13 : Effet inhibiteur direct de Trichoderma sur la croissance...78 Figure 14 : Lyses au niveau du mycélium de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici en présence de T. harzianum...80 Figure 15 : Transformation en cordons du mycélium de F. oxysporum f. sp. radicislycopersici en présence de T. harzianum...80 Figure 16 : A. Début d enroulement du mycélium du T. harzianum sur celui du F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici...80 Figure 16 : B. Enroulement du mycélium du T. harzianum sur celui du F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici...80 Figure 17 : Effet inhibiteur à distance de Trichoderma sur la croissance...82 Figure 18 : Comparaison entre une plante repiquée dans le mélange d inoculum et une plante témoin...83 Figure 19 : Racines d une plante inoculée par Fusarium oxysporum f.sp.radicislycopersici...84 Figure 19 : Effet inhibiteur du Triazole sur la croissance du Mol Figure 19 : Effet inhibiteur du Triazole sur la croissance du Mol Figure 19 : Effet inhibiteur du Triazole sur la croissance du Mol Figure 19 : Effet inhibiteur du Triazole sur la croissance du Mol Figure 19 : Effet inhibiteur du Triazole sur la croissance du Mol Planche 01 : profil éléctrophorétiques des Phosphatase acide...98

15 Planche 02 : profil électrophorétique des Estérase...98 Figure 20: F7, F8 sur milieu chlorate Figure 21 : Représentation des mutants Figure 22 : Résultats de complémentation...103

16 Graphe 01 : Le taux d inhibition de la Mol Graphe 02: Le taux d inhibition de la Mol Graphe 03: Le taux d inhibition de la Mol Graphe 04: Le taux d inhibition de la Mol Graphe 05: Le taux d inhibition de la Mol Graphe 06 : L effet des vingt molécules à 0 ppm sur la croissance...92 Graphe 07 :L effet des vingt molécules à 50 ppm sur la croissance Graphe 08 : L effet des vingt molécules à 100 ppm sur la croissance...93 Graphe 09 : L effet des vingt molécules à 200 ppm sur la croissance...93 Graphe 10 :L effet des vingt molécules à 400 ppm sur la croissance...94

17 Résumé : La Fusariose de la tomate est une maladie vasculaire causée par Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici et Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Ces derniers sont des champignons telluriques dotés d une spécificité stricte d hôtes. Dans de travail, nous avons utilisé quatre souches de Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici et quatre souches de Fusarium oxysporum non pathogène dans différent régions d Algérie. Plusieurs formes spéciales du Fusarium oxysporum sont identifier par des techniques différentes et la compatibilité végétative c est l un des moyen génétique utilisé pour la caractérisation. La température optimale de croissance est de 28 C. La croissance mycélien est favorisé dans le milieu PDA par contre elle est lente sur d autre sources. La représente la source d azote la plus favorable à la croissance et la sporulation du FORL. Les quatre souches représentent un pouvoir pathogène sur les trois variétés de la tomate, la souche F4 c est la plus virulente que les autres. La lutte chimique est le moyen le plus couramment utilisé pour le contrôle de cette maladie par l utilisation de certain molécules de triazole, les résultats obtenus à moyen et à long terme témoignent l efficacité limitée de ce moyen de lutte. A l heure actuelle comme la lutte biologique contre la Fusariose de la tomate, basée sur l utilisation du Trichoderma harzianum, fait l objet de plusieurs études. Diverses méthodes de confrontation avec le champignon phytopathogènes (Fusarium oxysporum f.sp. Radicis-lycopersici) ont été utilisées, parmi les méthodes in vitro la méthode par confrontation directe et indirect sur boîte de Pétri a donné les meilleurs résultats avec les quatre souches F1, F4, F7 et F8. La confrontation de l antagoniste avec le champignon in vivo est due à L inoculation des plantules de tomate par les souches ont pour la plupart montrées une diminution de la gravité de ces maladies. Mots clés : Tomate, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, fusariose, Trichoderma, Contrôle Biologique.

18 Summary F. oxysporum is a widespread soilborne plant pathogen, is a recent damaging disease of greenhouse crops in the word, which causes diseases such as vascular wilt caused by Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici and crown and root rot caused by Fusarium oxysporum Schlect f. sp. radicis-lycopersici Jarvis and Shoemaker. Several special forms of Fusarium oxysporum are to identify by different techniques and the vegetative compatibility it one of average the genetics is used for the characterization. The optimal temperature which gave good growth is 28 C. The development of the mycelium is favoured in PDA source but it was slow with another source. Pathogenecity of al strains is observed in three varieties of tomato; however F4 is very pathogenic strain on these varieties. The chemical fight is the means most usually used for the control of this disease by using triazole the results obtained in the medium and long term testify L `effectiveness limited to this means of fight. For these reasons, there is an urgent need to establish a biological control method for this disease. Biological control shows promise in the management of FCRR, with several antagonists already known to control FCRR us Trichoderma. Pathogenic fungi (Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici) is used, among in vitro methods the method by direct and indirect confrontation on Petri dishes gave the best results and especially with the four strains F1, F4, F7 and F8. In vivo methods, the confrontation between the antagonist and the champignon is used with the inoculation of tomato seedlings by strains. They have mostly shown a decrease in the severity of these diseases. Key words: Fusarium oxysorum f. sp. radicis-lycopersici, Fusarium crown and root rot, tomato, biological control, Trichoderma.

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20 Introduction : Les Fusarium sont parmi les champignons telluriques les plus agressifs, causant des flétrissements et des pourritures sur de nombreuses espèces végétales cultivées. En dépit des pertes économiques qu ils entraînent, le contrôle de ces pathogènes reste toujours limité à des mesures prophylactiques ; la désinfection du sol n est jamais complète en raison d une part, de la difficulté de sa réalisation (Benhamou et al., 1997) et d autre part, à l induction de souches résistantes. Fusarium oxysporum est l'une des espèces les plus importants dans la microflore fongique des sols cultivés, puisqu'ils représentent 40à70 de la flore fusarienne totale (Bettache, 1993). L'espèce Fusarium oxysporum comporte un ensemble de forme identiques morphologiquement mais présentant des spécificités parasitaires parfois très étroites, dénommés pour cette raison formes spécialisés (Correll et al.1987). Une autre caractéristique a été utilisée pour diviser différentes formes spéciales de en sous-groupes :c'est la compatibilité végétative (Puhalla, 1984).. Dans le bassin méditerranéen, la tomate peut être victime de deux maladies fusarienne différentes soit la flétrissure fusarienne (fusarium wilt) causée par Fusarium oxysporum lycopersici abrégée FOL et la pourriture de la racine et du collet (fusarium crown and root rot) causée par Fusarium oxysporum radicis-lycopersici abrégée FORL (Komi, 1989 ; Jean Duval, 1991). L élimination de ces agents pathogènes n est pas aisée, différentes méthodes ont été utilisées pour lutter contre la fusariose de la tomate. La lutte chimique est le moyen de lutte le plus couramment utilisé pour le contrôle de ces agents pathogènes. Les techniques de lutte biologique via l utilisation des bactéries PGPR «plant growth- promoting rhizobactéria» peut être une alternative pour le contrôle de ces agents pathogènes.

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22 I. La plante hôte (tomate) : 1)- Description botanique : La tomate (Solanum lycopersicum L. ou Lycopersicon lycopersicum (L.) est une plante annuelle de la famille des Solanacées, originaire d'amérique du Sud (Laumonnier, 1979). C est l'un des légumes les plus importants dans l'alimentation humaine et qui se consomme frais ou transformé. C'est l'ingrédient de cuisine le plus consommé dans le monde après la pomme de terre. Elle est cultivée sous presque toutes les latitudes, sur une superficie d'environ 3 millions d'hectares, ce qui vaut près du tiers des surfaces mondiales consacrées aux légumes. La tomate est une plante herbacée vivace cultivée comme annuelle, à port rampant, aux tiges ramifiées. Il existe trois ports : retombant, semi-retombant et horizontal. Chez la tomate, le système racinaire est très puissant et ramifié sur les trente premiers centimètres. On dit que ce système racinaire est pivotant. La tige est pubescente, épaisse aux entre-nœuds. On trouve deux sortes de poils sur la tige et les feuilles : des poils simples et des poils glanduleux qui contiennent une huile essentielle, qui donne l'odeur de la tomate et la coloration verte. La fleur est hermaphrodite. Le pistil est entouré d'un cône de 5 à 7 étamines à déhiscence introrse et longitudinale. Les fleurs, à corolle soudée en forme d'étoile à cinq pointes sont jaune vives. Elles sont réunies en cymes et s'épanouissent de fin mai à septembre. 5 sépales + 5 pétales + 5 étamines + 2 carpelles. Les fruits charnus sont des baies à 2 ou 3 loges, à graines très nombreuses, de taille, de forme et de couleur très variées : o la taille va de quelques grammes (tomate groseille, tomate cerise) à près de 2 kg ; o la forme est généralement sphérique, plus ou moins aplatie, plus ou moins côtelée, mais il en existe en forme de cœur ou de poire ; o la couleur, d'abord verdâtre, vire généralement au rouge à maturité, mais il en existe des blanches, des jaunes, des noires, des roses, des bleu, des violettes, des oranges et des bicolores. 1

23 La graine est petite (250 à 350 graines par gramme) et poilue ; sa germination est épigée. Après le stade cotylédonaire, la plante produit 7 à 14 feuilles composées avant de fleurir. Figure 01 : Grappe de tomates Solanum lycopersicum 2)- Origine et historique : Cette plante est originaire du nord-ouest de l'amérique du Sud (Colombie, Équateur, Pérou, nord du Chili). Longtemps appelée "pomme d'amour" ou "pomme d'or", son nom de «tomate» n'a été accepté par l'académie française qu'en Il a été emprunté au nahuatl (langue de la famille uto- aztèque) tomatl (Rick, 1979 ; Laterrot et Philouze, 1995). Le nom lycopersicum signifie littéralement «pêche de loup», et fait référence au caractère toxique attribué initialement à ce fruit. Introduite en Europe, Italie, Espagne au XVI e siècle comme plante ornementale (Damidaux, 1989). Elle est cultivée depuis le XVIII e siècle pour son fruit, consommé comme légume. (Laumonnier, 1979 ; in Abderrezak, 2001). L'introduction en France fut lente. En 1600, Olivier de Serres, un des premiers agronomes français, classe la tomate parmi les plantes d'ornement. La plante étant de la 2

24 même famille que la belladone, ses fruits n'étaient pas considérés comme comestibles, mais utiles en médecine. 3)- Étymologie : Tomate vient de l'espagnol tomate par confusion avec le mot nahuatl tomatl qui désignait le fruit des tomatillos (Physalis ixocarpa), en revanche le mot nahuatl xictomatl (nahuatl : xictli «nombril» ; tomatl «tomatillo», «tomatillo du nombril» ; espagnol mexicain : jitomate) désigne la tomate (Lycopersicon esculentum). 4)- la position systématique : (Gaussen, 1982 et Crêter 1965) Embranchement : phanérogames Sous-embranchement : Angiospermes Ordre: Polenomiales Classe : Dicotylédones Sous classe : Gamopétale Famille : Solanacées Genre : Lycopersium Espèce : Lycopersium esculentum- 5)- Composition biochimique et valeur nutritionnelle : Ce fruit consiste la principale source de nourriture dans plusieurs pays. (Gacem, 1999). La tomate est un aliment diététique, très riche en eau (plus de 90 %) et très pauvre en calories (18 kcal pour 100 grammes), riche en éléments minéraux et en vitamines (A, C et E). (Steven, 1996 et Rioneng, 1999) (Tableau 1) Elle est composés notamment de : potassium : environ 280 mg pour 100 g de tomate, lycopène : pigment rouge de type caroténoïde, qui est un antioxydant, contenu à raison de 30 mg dans 200 ml de sauce tomate. 3

25 Elle contient un alcaloïde (la solanine) ainsi que de la saponine c'est d'ailleurs ce dernier produit lié à l'histamine qui la rend pour certains indigeste. La tomate aurait un usage traditionnel de phytothérapie notamment grâce à sa teneur en lycopène et en pigments caroténoïdes antioxydants. Tableau 1 : la teneur de la tomate en éléments nutritifs pour 100g 15 Kcal. (Steven, 1996 et Rioneng, 1999) Minéraux (g) Potassium Phosphore Calcium Magnésium Soufre Sodium Chlore Bore Fer Cuivre Zinc Manganèse Nickel Cobalt Chrome fluor Iode VITAMINES (mg) Vitamine C (ac.ascorpique) Provitamine A (carotène) Vitamine B1 (thiamine) Vitamine B2 (riboflavine) 0/040 Vitamine B3 ou pp (nicotinamide) Vitamine B5 (ac.panothi) Vitamine B6 (pyridoxyne) Vitamine B8 (biotine) Vitamine B9 (ac. folique) Vitamine E (tocophérols) Composants (g) Glucides 2.80 Protides 0.80 Lipides 0.10 Eau 94.0 Fibres alimentaires 1.20 Apports / énergétiques K Calories K Joules )- Culture : *Culture en plein-sol : La tomate est une plante de climat tempéré chaud. Sa température idéale de croissance se situe entre 15 C (la nuit) et 25 C (le jour). Elle craint le gel et ne supporte pas les températures inférieures à + 2 C. C'est une plante héliophile, elle demande une hygrométrie moyenne, parfois un apport de CO 2 (sous 4

26 serre verre). Sa période de végétation est assez longue : il faut compter jusqu'à cinq à six mois entre le semis et la première récolte. La multiplication se fait par semis, opération qu'il faut faire assez tôt, vers février-mars, et donc sous abri en climat tempéré (en serre ou sous châssis vitré). Les jeunes plants obtenus sont à repiquer entre le 15 avril et le 15 mai, sitôt que la période des gelées est passée. C'est une culture très exigeante, qui demande un sol profond et bien fumé, et la possibilité d'irrigation. C'est une plante neutrophile. *Culture hors-sol : Les tomates de production industrielle sont généralement cultivées hors sols dans des serres de plusieurs hectares sur de la laine de roche et la fibre de coco sont les plus utilisé par les producteur canadiens. Elles sont alimentées de manière totalement artificielle par un mélange d'eau et d'engrais qui expliquent leur popularité (Papadopoulos, 1991). Elles sont cultivé de la même façon dans les régions chaudes désertiques comme par exemple le désert du Néguev en Israël en remplaçant la laine de verre par du sable. Cela permet d'étendre considérablement la période de production (aux dépens de la qualité des tomates) en chauffant les serres en hiver. 8)- Aspects économiques : La tomate est cultivée dans presque tous les pays du monde. C'est, par le volume de production, le troisième "légume" au plan mondial, derrière la pomme de terre et la patate douce. 5

27 Elle est présente dans le monde entier, sur des plants de 0,40 à 7 mètres de haut suivant les variétés et les pays (Tableau 2). Tableau 2 : Production en tonnes. Chiffres Données de FAOSTAT (FAO) Base de données de la FAO, accès du 14 novembre 2006 Chine ,00 24 % ,00 26 % ÉtatsUnis ,00 10 % ,00 9 % Turquie ,00 8 % ,00 8 % Égypte ,00 6 % ,00 6 % Inde ,00 6 % ,00 6 % Italie ,00 6 % ,00 6 % Espagne ,00 4 % ,00 4 % Iran ,00 3 % ,00 3 % Brésil ,00 3 % ,00 3 % Mexique ,00 2 % ,00 2 % Russie ,00 2 % ,00 2 % Grèce ,00 2 % ,00 1 % Chili ,00 1 % ,00 1 % Maroc ,00 1 % ,00 1 % Ouzbékistan ,00 1 % ,00 1 % Ukraine ,00 1 % ,00 1 % Portugal ,00 1 % ,00 1 % Irak ,00 1 % ,00 1 % Syrie ,00 1 % ,00 1 % Tunisie ,00 1 % ,00 1 % Autres pays ,00 18 % ,00 17 % Total , % , % Pour les principaux pays francophones (chiffres de la production mondiale 2004 en tonnes, source FAO) : France : tonnes Canada : tonnes Belgique : tonnes 6

28 Suisse : tonnes 9)- Diverses espèces : Le genre Solanum de la famille des Solanacées, comprend plusieurs espèces dont : Solanum lycopersicum, cette espèce compte plusieurs variétés, dont : o Solanum lycopersicum esculentum à gros fruits, c'est la tomate cultivée de laquelle découlent presque toutes les variétés trouvées sur le marché. o Solanum lycopersicum cerasiforme, la tomate cerise, c'est la seule forme sauvage du genre rencontrée aussi en dehors de l'amérique du Sud (Rick, 1986). Connue dans les Antilles et en Guyane françaises sous le nom de tomadose. Il est possible que la tomate cultivée ait été domestiquée à partir de cette forme sauvage. reproductives avec Solanum lycopersicum (ou Lycopersicon esculentum) o Solanum cheesmaniae (ou Lycopersicon cheesmaniae), la «tomate des Galapagos», elle est tolérante au sel o Solanum chmielewskii (ou Lycopersicon chmielewskii) pousse dans les zones montagneuses ( m) et humides des Andes o Solanum galapagense, autre espèce de «tomate des Galapagos» o Solanum habrochaites (ou Lycopersicon hirsutum) à fruits verts, pousse dans les zones montagneuses ( m) et humides de l'amérique du Sud. o Solanum lycopersicoides (ou Lycopersicon lycopersicoides) o Solanum neorickii (ou Lycopersicon parviflorum) pousse dans les zones montagneuses ( m) et humides des Andes. o Solanum pennellii (ou Lycopersicon pennellii) à fruits verts, elle pousse dans les milieux montagneux ( m) et secs de l'amérique du Sud, car elle a la capacité d'absorber l'humidité atmosphérique grâce à la présence de nombreux stomates sur la face supérieure de ses feuilles. C'est une tomate naturellement très sucrée et elle constitue la base du véritable ketchup. o Solanum pimpinellifolium (ou Lycopersicon pimpinellifolium) à fruits rouges 7

29 o Solanum rickii non reproductives avec Solanum lycopersicum o Solanum chilense (ou Lycopersicon chilense) pousse dans les environnements secs du sud chilien, où son enracinement profond lui permet d'exploiter les rares réserves en eau. Elle a de longs bouquets floraux, de 14 à 20 centimètres. o Solanum corneliomuelleri (ou Lycopersicon glandulosum) o Solanum juglandifolium (ou Lycopersicon juglandifolium) o Solanum ochranthum (ou Lycopersicon ochranthum) o Solanum peruvianum (ou Lycopersicon peruvianum) o Solanum sitiens (ou Lycopersicon sitiens) 10)- La culture de la tomate en Algérie : La tomate se place au premier rang parmi les cultures maraîchères en Algérie selon l Institut technique des cultures maraîchères et industrielles (2000). Elle représente 51% de la production totale en produits maraîchers. Sa superficie est de l ordre de 1737 ha, soit 40% de la superficie serre (4350 ha) (Nechadi et al., 2002). L évolution de la production de la tomate en Algérie entre les années est donnée dans (le Tableau 3) suivant : (Abderrezak, 2001). Tableau 3 : Evolution de la production de la tomate en Algérie Années Tonnage (tonnes) Avec près de 1 million de tonnes de tomates produites en 2001, l Algérie subvient à ses besoins. Cependant le volume de production en tomate fraîche demeure encore faible comparativement aux pays voisins, notamment la Tunisie et le Maroc. 8

30 11)- Les ennemies de la tomate : 9

31 Tableau 04 :les annemies de la tomate, les symptomes et moyens de luttes. Ravageurs : (J-François, 2001) Les ennemies de la tomate Les symptômes Moyens de luttes Acariens*** (Tetranychus urticae, T. turkestani, T. cinnabarinus) -Utiliser du soufre en poudrages ou mouillages directement sur la plante, ou en poudrage au pied des aubergines. -Bassiner, en particulier en période de canicule : augmenter l hygrométrie de l air par des brumisations courtes et répétées. Ne pas agir trop tôt pour limiter les risques de botrytis sur fruits. La protection biologique intégrée par des insectes auxiliaires n est pas très efficace à l heure actuelle. 10

32 Acariose bronzée* (Vasa- tes lycopersici) Aspect terne de la plante et nécrose des folioles à partir des pétioles Aleurodes** (Trialeurodes vaporarium) Altises (Psylliodes affinis) Cicadelles (Hyalesthes obsoletus) Rabougrissement des apex et développement de fumagine sur le miellat produit par les larves blanches ; piégeage par panneaux jaunes englués (sur- veillance) Transmission du stolbur, mycoplasm -ose se traduisant par l arrêt de la croissance de la plante et par des anomalies florales -Effectuer des traitements insecticides répétés (savon noir) afin d éliminer les adultes et les larves ; ne pas traiter si la lutte biologique est déjà en place. Protection biologique intégrée par lâchers de Macrolophus caliginosus, Encarsia formosa, Eretmocerus eremicus dès le repérage du 1 er ravageur, ou en préventif à l aide de plantes banques. Effeuiller les 3-4 feuilles basales toutes les 3-4 semaines afin d éliminer les larves âgées. Attention aux excès -Filet anti-insectes sur jeunes plants -Mélange roténone + pyrèthre (Biophytoz) ou pyrèthre seul Mélange roténone + pyrèthre (Biophytoz) ou pyrèthre seul 11

33 Doryphore (Leptinotarsa decemlineata) Mineuses (Liriomyza trifolii, L. strigata, L. huidobrensis) Dégâts sur feuilles et fruits par larves -Traiter à l aide d une souche spécifique de et adultes Bacillus thurengiensis (Novodor) à 5 l/ha : l application doit coïncider avec l émergence du maximum de jeunes larves L1 ; les traitements peuvent commencer dès le mois de mai et seront renouvelés en fonction des populations de doryphore et de la croissance des plantes. Le produit agit par ingestion : on peut ajouter 10 kg/ha de sucre (1 kg/hl de bouillie) pour renforcer l appétit des larves. Produit lessivable : attention aux aspersions et pluies. -Pour les adultes : destruction manuelle uniquement -Protection biologique intégrée : lâchers de la punaise Podisus maculiventris ; solution encore trop coûteuse. -Eviter d utiliser des insecticides non spécifiques type roténone. Galeries occasionnées par les larves -Protéger la culture par des filets anti-insectes Dans le limbe des feuilles âgées (type Filbio, Euronet) -Protection biologique intégrée : lâchers de Dacnusa sp, Diglyphus isaea soit dès les1 er symptômes (points blancs de piqûres au bord des feuilles), soit lorsque la larve s apprête à sortir de la galerie. Entre les deux, la larve est protégée par la feuille. Si des attaques ont eu lieu l année précédente, il ne faut pas hésiter à effectuer le 1er lâcher dès la plantation 12

34 Nématodes (Meloidogyne incognita) Noctuelles des fruits*** (Manestra oleracea, Chloridea armigera, Heliothis armigera) Noctuelles terricoles (Agrotis segetum, A. ipsilon) Formation de galles sur racines et perturbation de l absorption racinaire Sur fruits et également destruction de jeunes plantes -Variétés résistantes (BRENDA) -Recours au greffage -Intégrer des engrais verts dans la rotation (seigle, phacélie, crucifères nématicides) ; aérer le sol en profondeur -Effectuer une solarisation ou une désinfection à la vapeur avant plantation -Vérifier la qualité des plants -Protection biologique intégrée par champignons nématicides : encore à l étude -Bacillus thurengiensis -Protection biologique intégrée par lâchers de Trichogramma brassicae, Podisus maculiventris -A titre préventif, effectuer des binages fréquents afin de détruire mécaniquement les larves; observer régulièrement les cultures afin d'intervenir dès l'apparition des premiers dégâts. -En traitement curatif, utiliser un appât au son (pour 1 hectare : 20 kg de son, 2 kg de sucre, 10 litres d'eau et 2 litres de pyréthrine). Distribuer l'appât le soir, à proximité immédiate des cultures à protéger. Pour prolonger la durée d'efficacité, enfouir l'appât très superficiellement. 13

35 Pucerons (Macrosyphon Présence d exuvies (mûes) sur les euphorbiae, Myzus persicae) feuilles (les insectes étant sous les feuilles supérieures), enroulement des feuilles, fumagine et transmission de virus -Protection biologique intégrée par lâchers d Aphidoletes aphidimyza, Aphidiussp., Aphelinus abdominalis : attention à la spécificité de l auxiliaire vis-à-vis des espèces de pucerons ; par sécurité, on pourra effectuer des lâchers simultanés avec les 3 auxili -aires. Egalement, utilisation de plantes-banques. -Eviter d utiliser des insecticides (roténone, pyrèthre) sauf très tôt ou en cas de nécessité. Thrips* (Bemisia tabaci, Transmission de virus, TSWV Thrips tabaci, Frank- liniella en particulier occidentalis) -Protection biologique intégrée par lâchers d Amblyseius cucumeris, Orius sp. ou plantesbanques. -Piégage curatif par grands panneaux bleus englués (au moins un tous les deux mètres) et battage des plants Maladies : Alternariose*** (Alterna- ria solani) Taches nécrotiques sur feuilles avec halo jaune et lésions sur tige ou sur calice évoluant en chancres -Produits à base de cuivre -Désinfecter les semences 3 ; éliminer les déchets de récolte ; éviter les excès d humidité (irrigation localisée, ne pas mouiller le feuillage) ; aérer Cladosporiose* (Fulvia fulva) Pied noir de la tomate* (Didymella lycopersici) Taches jaunes angulaires sur face - Variétés résistantes aux 5 races de supérieure de la feuille avec duvet Cladosporium (DIPLOM) brun- violacé à la face inférieure Chancres de couleur foncé sur feuilles, fruits et surtout sur tige au collet de la plante ou près du sol 14

36 Phoma (Phoma destructiva) Plutôt en climat méditerranéen, taches nécrotiques sur feuilles avec halo jaune et lésions sur tige plus petites et plus nombreuses que celles d Alternaria -Désinfecter le sol par solarisation ou par la vapeur (ainsi que le terreau) Désinfecter les semences Rotation longue ; utilisation de matière organique bien décomposée ; éviter les excès d humidité (irrigation localisée, ne pas mouiller le feuillage) Mildiou de la tomate*** (Phytophthora infestans) Oïdium* (Leveillula taurica) Pourriture des fruits* Pourriture grise** (Botry- tis cinerea) Taches foliaires nécrotiques irrégulières -Eliminer les déchets de récolte ainsi que les avec halo jaune d extension rapide avec organes et les plants malades ; aérer duvet blanc fugace à la face inférieure ; la culture très tôt le matin ; sur tige, grosse taches brunes préférer l irrigation localisée ; longues rotations (peut être confondu avec Le cuivre peut légèrement ralentir la maladie (par Phytophthora parasitica provoquant des exemple bouillie bordelaise à 2,5 kg pour 10 chancres sur tige) litres) ; il faut bien atteindre le dessus et le dessous des feuilles, et même les fruits ; en période humide, effectuer un traite- ment préventif tous les 15 jours Surface supérieure de la feuille plages Hors période de canicule, traiter au soufre jaunes avec nécrose centrale et feutrage après le coucher du soleil blanc Divers agents responsables : Colletotri- Désinfection du sol par la vapeur ou par discret chum coccodes (= anthracnose des fruits solarisation à maturité du fruit, taches déprimées avec centre noir), Phytophthora sp., Rhizoctonia solani, Alternaria alternata, A. tenuis lésions zonées sur fruits de base A température assez basse, développe- -Eliminer les déchets de récolte ; aérer la ment d un feutrage gris sur feuilles, culture ; préférer l irrigation localisée ; plaies limiter la fertilisation azo- tée de taille ou organes étiolés -Traiter au silicate de soude 15

37 Maladie des racines A température moyenne, lésions -Recours au greffage liégeuses**(corky root) (Pyrenochaeta lycopersici) brunes sur racines évoluant en épaississement liégeux freinant l absorption hydrique Verticilliose** (Verticil- lium Flétrissement et, le plus souvent, -Variétés résistantes (DIPLOM, CINDEL, dalhiae) Fusariose de la tomate*** (Fusarium oxysporum f. sp. jaunissement et nécroses internervaire BRENDA, sur ESTIVA) feuilles en commançant de bas en haut -Recours au greffage -Effectuer de longues rotations -Pas de traitement curatif. Par température élevée,jaunissement -Variétés résistantes aux différentes races du feuillage à partir du bas de la plante (DIPLOM,ALEXANDROS, CINDEL, BRENDA, lycopersici et F. oxysporum f. qui sp. se dessèche ; tissus ligneux ESTIVA) radicis lycopersici) colorés en brun-rouge, surtout sur -Désinfection des terreaux par la vapeur racines et collet dans le cas du FORL Chancre bactérien de la Flétrissement unilatéral de la -Semences saines tomate**(clavibacter Feuille sans jaunissement, le plus -Produits à base de cuivre michiganensis ssp. michi- Souvent à partir du sommet de la Pplante -Eliminer les déchets de récolte ; ganensis) modérer la fertilisation azotée ; éviter les excès d humidité (irrigation localisée, ne pas mouiller le feuillage) Maladie de la moelle noire (Pseudomonas corrugata) Sur plante vigoureuse suralimentée en azote et par temps humide, boursouflure de la tige avec pourriture noire de la moelle -Produits à base de cuivre -Eliminer les déchets de récolte ; modérer la fertilisation azotée ; éviter les excès d humidité (irrigation localisée, ne pas mouiller le feuillage) ; aérer 16

38 Viroses de la tomate** - virus de la mosaïque du (TMV) transmis par la semence et par voie mécani - virus de la mosaïque du concombre (CMV), donnant des feuilles fili- formes ou en fougère - virus Y de la pomme de terre (PYV), donnant des nécroses sur feuilles avec dessèchement - Tomato yellow leaf-curf virus (TYLCV), provoquant crispation et jaunissement des feuilles (feuilles en cuillère) - Maladie bronzée de la tomate due au tomato spotted-wilt -virus (TSWV), aspect bronzé de la plante qui reste naine et stérile, transmis respectivement par les pucerons, Bemisia tabaci et thrips II. La maladie : * la fusariose vasculaire : 1)- origine et historique : Depuis la création du genre par Link en 1809, et de sa délimitation actuelle par Appel et Wollenweber en 1910, de nombreux travaux ont été consacrés à sa taxonomie (Wollenweber et Reinking, 1935 ; Snyder et Hansen, 1940 ; Raillo, 1950 ; Gordon, 1952 ; Messiaen et Cassini, 1968 ; Booth, 1971 ; Joffe, 1974 ; Nelson et al., 1983 ; in Belabid, 2003). Le genre tire son nom du latin fusus car ses spores sont en forme de fuseau. Fusarium oxysporum (Schlecht.) emend. Snyder et Hansen, se distingue des autres espèces de Fusarium par la 17

39 production abondante de microconidies, rassemblées en fausse tête à partir de monophialides courtes. Seule la reproduction asexuée est connue chez cette espèce, ce qui la place dans le groupe des Deutéromycètes ainsi qu à la sous-classe des Hyphomycètes et à la famille des Tuberculariacées ; il fait partie de la section Elegans (Messiaen et Cassini, 1968 ; Booth, 1971 ; Nelson et al., 1983 ; in Belabid, 2003). Le genre est économiquement très important car il regroupe beaucoup d'espèces phytopathogènes susceptibles d attaquer un grand nombre de plantes. Ainsi, plus de 120 formes spécialisées et races ont été décrites chez F. oxysporum attaqués également au parasite, sa variété et sa virulence (Joly, 1965 ; Armstrong et Armstrong, 1981). De plus beaucoup d espèces saprophytes sont capables de se développer en tant que pathogènes secondaires sur des tissus végétaux sénescents. Les plantes semblent être particulièrement sensible à cette maladie vasculaire lorsqu'elles manquent d'azote, le phosphate et de calcium et lorsqu'elles sont soumises à des jours cours et peu lumineux (Blancard, 1997). 2)- Description de la fusariose : La tomate (Lycopersicon esculentum Mill. «Priscas») est sujette à deux maladies fusarienne : la flétrissure fusarienne classique (Fusarium wilt) causée par Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) Snyder et Hansen et la pourriture des racines et du collet (Fusarium crown and root rot (FCRR) causée par Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (FORL) (Jarvis and Shoemaker, 1978 ; Katan et al., 1997; Kuninaga & Yokosawa, 1991) est connue parmi les maladies les plus dévastatrices de cette culture à travers le monde (Rowe and Farley, 1977 ; Diter et Geneviève, 2005). FCRR ;découvert au japon en 1969, après une perte de 33% et 44% du rendement en tomate, il a été identifié dans les pays occidentaux : Amérique du nord (Sonoda, 1976), canada, Mexique, Israël, japon 18

40 et d autres ville des états unis comme la Californie, New Jersey, New York, New Hampshire, Ohio, Pennsylvanie et Texas ( Roberts et., al 2001). Ainsi, Colorado en FCRR à s'écarter maintenant à tous les secteurs de production de tomate dans Japon et dans le monde entier et cause des pertes significatives dans la production de tomate (Blankard, 1994 ; Jones et al.,1991), si les plantes sont dans les serres ou sur champ. Dans les systèmes fermés, avec le recyclage de la solution d'éléments nutritifs et des laines de roche comme milieu de culture, la pourriture des racines et du collet Peuvent poser des problèmes graves [Hartman & Fletcher, 1991., Rattink, 1997). Cette maladie affecte 40% de la surface cultivée examinée en Florida (Sonoda, R.M., 1976). En provoquant des dégâts commerciaux 15-65% 5 (Anonymous, 1999 ; McGovern et al.,1998 ; Sonoda, 1976). Ce dernier pathogène, signalé aussi sur une culture hors-sol de tomates dans les payés méditerranéens :dans les serres géothermales du sud tunisien durant la campagne (Hajlaoui et al., 2001 ; Hibar, 2002), a occasionné des dégâts pouvant atteindre 90 % des plantes dans certaines serres géothermiques. L élimination de ces agents pathogènes n est pas aisée, car leur pouvoir saprophyte et leur aptitude à coloniser les plantes non hôtes lui permettent de survivre à des conditions défavorables, ainsi ils sont capables de persister dans le sol infesté pendant plus de 10 ans en absence de la plante de la tomate. Différentes méthodes ont été utilisées pour lutter contre la fusariose de la tomate : des variétés de tomate qui sont plus résistantes au FCRR mais sont peu employés en raison du coût élevé et leur, efficacité, est insuffisante (Elgersma et al., 1972; Scott and Jones, 2000., Datnoff, 1995) ; des pratiques culturelles (Hartman & Fletcher, 1991) ; des pesticides (Mihuta-Grimm, 1990., Dodson et al., 2001) ; des fumigènes ( Dodson et al., 2001). La lutte chimique est le moyen de lutte le plus couramment utilisé pour le contrôle de ces agents pathogènes par le benomyl ou le captafol (Marios, Mitchell, 1981 ; Mihuta- Grimm et al, 1990), lʼutilisation répétée des produits de synthèse entraîne souvent la pollution de 19

41 lʼenvironnement, lʼapparition de souches résistantes et augmente la quantité des résidus sur les fruits (Ozbay, Newman, 2004). Cependant, leur phytotoxicité, leur faible durée de persistance d action ainsi que leur effet néfaste sur toutes les composantes de l environnement rend ce moyen de lutte en recours obligé en absence d autres moyens de lutte efficaces. Vu les exigences du marché extérieur sur le plan de la teneur minimale en matière de résidus sur les fruits et dans le but de chercher des alternatives de lutte contre le F. oxysporum f. sp. radicislycopersici, on est orienté vers la lutte biologique. Les techniques de lutte biologique via l utilisation des bactéries PGPR «plant growthpromoting rhizobactéria» peut être une alternative pour le contrôle de ces agents pathogènes. Le genre Pseudomonas,a fait l objet de nombreuses recherches comme antagoniste en vue d une éventuelle utilisation comme agent de contrôle biologique de certaines maladies phytopatogènes (Dekkers et al., 2000; Duffy and Defago, 1997; Piga et al., 1997; David Weller et al.,2002). Bacillus subtilis (Phae et al.,1992), d autre antagonistes telle que : Trichoderma harzianum (Marois et al., 1981; Sivan et al., 1987), Fusarium non pathogène (Komada, 1994; Louter and Edgington, 1990). 3)- Symptômes de la maladie : On reconnaît la maladie aux symptômes suivants (Kraft et al., 1994): Brunissement des racines, de leur cylindre central et des vaisseaux situés au niveau du pivot et du collet; Chancre brun, légèrement déprimé se développant sur un seul côté du collet et de la tige, en forme de flamme; Système racinaire, brun et pourri, vaisseaux brun chocolat dans les parties basses de la tige. Brunissement des vaisseaux, des tissus corticaux, du pivot et du collet. Lésion brun rose s'étendant sur plusieurs centimètres au-dessus du collet. Flétrissement juste avant que les premiers fruits soient prêts à cueillir. Les plants récupèrent la nuit et les jours sombres ou quand la récolte allègent les plants. Feuilles hautes fanent avant les feuilles basses et il y a décoloration jaune ou doré. 20

42 Les fruits n'ont pas leur brillance normale. Figure 03 : symptôme de racine pourri La condition favorable à la maladie est habituellement un sol froid (18-20C). Il semble que la disponibilité du fer dans le sol soit aussi favorable à la maladie. 4)- Classification scientifique : Royaume : Phylum : Classe : Sous-classe : Ordre : Famille : Genre : Espèces : Mycètes Ascomycota Sordariomycetes Hypocreomycetidae Hypocreales Nectriaceae Fusarium F.oxysporum f.sp.radicislycopersici 21

43 Figure 04 : Cycle de vie de Fusarium oxysporum (Agrios, 1970). III- La caractérisation génétique du Fusarium oxysporum: Le Fusarium oxysporum est un parasite vasculaire très répandu des plantes cultivées. Les espèces de F. oxysporum sont souvent hautement spécifiques pour leur hôte. Cette spécificité a mené Snyder et Hansen à diviser ces espèces en formes spéciales basées sur le fait qu'une espèce est capable de causer la maladie sur un hôte unique la plupart du temps (Correll et al.1987). Certaines formes spéciales peuvent être divisées en plus en races, basées sur leur virulence sur différents cultivars d'un hôte spécifique. Cependant, les études sur la virulence ont montré que celleci était influencée par de nombreuses variables : la température, l'âge de l'hôte, la méthode d'inoculation (Correll et al. 1987). 22

44 Une autre caractéristique a été utilisée pour diviser différentes formes spéciales de en sous-groupes :c'est la compatibilité végétative entre deux isolats (Puhalla, 1984). Les deux mutants confrontés sont différents pour leur site de mutation. Chez un champignon imparfait comme le F. oxysporum f.sp.radicis-lycopersici, les échanges de matériel génétique ne peuvent avoir lieu (reproduction sexuée inconnue) qu'à la suite de l'hétérocaryose obtenue après fusion de filaments appartenant à des souches de génomes différents. Les noyaux ainsi réunis dans un cytoplasme commun peuvent éventuellement compenser réciproquement des déficiences de tous ordres; il arrive exceptionnellement qu'ils fusionnent et que des échanges génétiques aient lieu entre chromosomes lors de l'haploïdisation (recombinaison mitotique). Cependant des obstacles à l'hétérocaryose existent chez certains champignons imparfaits. La compatibilité végétative est sous le contrôle d'un certains nombre de loci d'incompatibilité appelés gène vic ou het, ce qui conduit à la définition des groupes de compatibilité végétative (Puhalla, 1989 ; Corell et al,1987): deux isolats appartenant au même groupe de compatibilité végétative, s'ils ont les mêmes allèles de leur loci, peuvent fusionner leurs filaments et former des hétérocaryons, en revanche deux isolats rangés dans des groupes différents de compatibilité végétative ne peuvent fusionner pour former des hétérocaryons, si leurs hyphes sont confrontées (ensemencement simultané d'une bouture de chacune des souches à 1 à 1,5 cm l'une de l'autre sur milieu nutritif dans une boîte de Pétri), la réaction la plus fréquente observée dans la zone de confrontation est la suivante : fusion des filaments puis mort plus ou moins rapide de la cellule résultant de la fusion. Même après l'anastomose des filaments, la réaction léthale observée au niveau du cytoplasme empêche la formation d'hétérocaryons fonctionnels. La notion de groupe de compatibilité végétative (VCG) sur le plan de la biologie des populations revêt un intérêt important. Les isolats appartenant au même VCG sont susceptibles d'évoluer proche géographiquement les uns des autres, en revanche s'ils appartiennent à des VCG différents, ils évoluent séparément, même s'ils sont proches géographiquement. 23

45 Selon Puhalla (1979), la complémentarité végétative permet la détermination d'un nouveau pathotype et de suivre son épidémiologie. Correll et al (1988), ont trouvé que des souches de Verticillium albo-atrum d'origines géographiques trés éloignées (Amérique, Europe) appartiennent au même VCG, ont émis l'hypothèse que ces isolats ont une origine commune. IV- Les moyens de lutte : Le a une température de croissance optimale comprise entre 25 et 30 C, cependant il peut résister à un spectre plus large allant de 5 à 37 C. Les désherbages chimiques sont réalisés avec des produits habituels à base de Métribuzine à 70 %, mais aussi par une couverture fongique classique. IV-1- Les méthodes culturales : Les mesures préventives contre la flétrissure fusarienne consistent à éviter les conditions qui favorisent la maladie soit : un sol léger et acide, un manque d'azote et de calcium, des températures élevées l'optimum pour le développement du FOL est 28C- et un manque de lumière en intensité et en temps. Barna et al. (1985) souligne l'importance de maintenir une fertilisation azotée élevée surtout sous forme de nitrates (fumier) afin de produire beaucoup de pousses jeunes. La méthode de prévention la plus courante est de chauler afin de maintenir le ph entre 6.4 et 7.0 (Scott,1923). Des chercheurs de Taiwan (Sun et Huang, 1985) ont mis au point un amendement organique et minéral qui à raison de 1% par poids de sol permet de contrôler efficacement diverses espèces de Fusarium. Leur mélange- le mélange S-H - contient: 4,4% de bagasse (résidus de canne à sucre); 8,4% de son de riz; 4,25% de coquilles d'huitres; 8,25% d'urée; 1,04% de nitrate de potassium; 13,16% de superphosphate de calcium; 60,5% de cendres minérales constituées de 31% de dioxide de silice, 4,4% d'oxide de calcium, 1,7% d'oxide de magnésium, 18% d'oxide d'aluminium et 1% d'oxide ferreux. Une rotation de la récolte de 4 à 5 années diminue la densité de l inoculum dans le sol, mais ne freine pas complètement la maladie (Bayaa et Erskine, 1998 ; in Belabid, 2003). 24

46 IV-2- La lutte génétique : La sélection de variétés résistantes donne de bons résultats, cependant il faut entretenir une diversité génétique de manière à ne pas faciliter les mutations adaptatives et les expansions géographiques du champignon. Depuis quelques années, la recherche se concentre surtout sur l identification des gènes impliqués dans la résistance, ceux codant pour des enzymes entrants dans la biosynthèse de composés toxiques pour le champignon, et ceux codant pour des toxines protéiques qui inhibent directement sa croissance (Cornelissen et Melchers 1993; Terras et al., 1998 ; Valpuesta, 2002). IV-3- Les méthodes physiques : Anchisi et al. (1985) ont développé un traitement à l'eau chaude pour protéger les plants dans un sol où l'on sait la maladie présente. La méthode consiste à traiter les racines avec de l'eau à 48-49C pendant 30 secondes avant de transplanter ou moins de 48 heures après. Cela stimule la croissance des racines. La taille des racines amène aussi une protection contre la fusariose pour la même raison. La stérilisation ou la solarisation ne sont pas des solutions à long terme. IV-4- La lutte biologique : I-HISTORIQUE : La lutte biologique des agents pathogènes est maintenant une sous-discipline dans la science de la phytopathologie. Bien qu elle ait débuté il y a plus de 70 ans, c est seulement autour de 1960 que la théorie et petite fraction du nombre et des ventes de produits chimiques destinés pour le champ, les vergers et la culture des arbres. En 1993, la vente des biofongicides représentait moins de $1 million tandis que les ventes totales de fongicides excédaient $5.5 billions. Pourtant, des estimateurs optimists avian projected queue les ventes des produits biologiques atteindraient $15 millions avant l an 2000 (Powell et Jutum, 1993). Cependant, l agriculture destinée à la culture serricole et sous- abri offre une niche 25

47 unique pour le développement et l utilisation d agents de lutte biologique. Sur les 33 produits biologiques commerciaux énumérés par Fravel et al.(1999), plus de la moitié ont une application dans les pépinières et les serres et plusieurs sont spécifiquement développés pour le contrôle des agents pathogènes du sol Pythium, Fusarium oxysporum et Rhizoctonia, qui sont des agents pathogènes majeurs dans les serres. La lutte biologique est plus intéressante dans les serres et cultures abritées qu au champ, même si le secteur des serres représente seulement 0,02% de toute la zone utilisée pour faire l agriculture. TRICHODERMA HARZIANUM : Dans la nature, la plupart des micro-organismes sont utiles, tandis que d'autres constituent de véritables ennemis et entravent le développement de la plante et de son système racinaire. Certains agents pathogènes du sol sont responsables d'importantes pertes de récoltes en causant diverses maladies dont : Conidies Mycélium Figure 05 : Trichoderma harzianum 1) pourritures des semences, 2) fontes des semis, 3) pourritures racinaires et 4) flétrissements des plantes (Agrios, 1988; Anonyme, 1992) tandis que des parasites du phylloplan sont responsables des 1) chancres de tiges, 2) taches foliaires, 3) flétrissement des plantes et 4) pourritures sur les fruits, 26

48 etc (Agrios, 1988). Pour réduire l importance de ces ennemis, les producteurs ont souvent recours à tout un arsenal de pesticides (Jarvis, 1993; Lumsden et Lewis 1989; Ole Becker et Schwinn, 1993) et de fumigants (Chet et Baker, 1981; Larkin et Fravel, 1998) avec des résultats souvent mitigés (Besnard et Davet, 1993; De Waard et al., 1993; Jarvis, 1993) et des effets secondaires sur l environnement et les organismes utiles parce que non sélectifs. Plusieurs micro-organismes peuvent, par contre, avoir un effet bénéfique dans le contrôle des champignons pathogènes et ainsi minimiser l'effet délétère des pesticides (Adams, 1990). La découverte de tels agents de lutte biologique et la démonstration de leur capacité à réduire l'incidence et la gravité des maladies ont trace la voie à plusieurs recherches prometteuses (Alabouvette et al., 1993; Bélanger et Labbé, 1994; Boland, 1990; Lewis et Papavizas, 1987). Dans ce contexte, une attention particulière a été portée aux champignons antagonistes, principalement à cause de leur potentiel à diminuer la densité de l'inoculum des champignons pathogènes (Dennis et Webster, 1971b; Elad et al., 1982; Larkin et Favrel, 1998; Lockwood, 1988). Parmi les champignons antagonistes qui ont démontré un bon potentiel de lutte, Trichoderma spp. (Monte, 2001; Benitez et al., 2004 ; Vinale et al., 2008) est sans contredit le plus rapporté dans la littérature (Elad et al,. 1982; Harman, 2000) ayant démontré des effets contre : Pythium (Bolton, 1980; Chet et al., 1981; Clavet et al., 1993); Phytophthora cinnamomi (Kelley, 1976), Rhizoctonia solani (Elad et al., 1980; Lewis et Papavizas, 1987; Windham et al., 1986); Sclerotium rolfsii (Backman et Rodriguez-Kabana, 1975), etc. En particulier, un déterminant enzymatique dans l action antagoniste (Deng et al., 2007) et un éliciter protéique impliqué dans l induction du résistance (Djonovic et al., 2007) ont été récemment identifié dans Trichoderma spp. En outre, une kinase était identifié dans Trichoderma-induite la résistance en concombre (Shoresh et al., 2006) et gènes des plantes systémiquement modulés par Trichoderma ont été récemment analysés dans les plantes de tomate (Alfano et al., 2007). Ces champignons pathogènes causent d'importants dégâts dans les cultures fruitières, légumières, terricoles et ornementales. I-DESCRIPTION : Trichoderma. Est un genre qui regroupe un ensemble de champignons imparfaits saprophytes qui est naturellement abondant dans le sol et la matière organique telle le bois mort ou en décomposition, les 27

49 débris végétaux et la paille (Papavizas, 1985, Sippell et al., 1985, Widden et Scattolin, 1988). Les espèces de ce genre possèdent également des aptitudes à dégrader de nombreux substrats organiques du sol pour se nourrir et se développer ce qui suggère qu'elles peuvent survivre dans plusieurs niches écologiques (Papavizas, 1985). Dans une perspective de lutte biologique, il est important de sélectionner des isolats adaptés aux conditions climatiques du milieu et à l écologie du parasite à combattre. Les propriétés antagonistes des diverses espèces de Trichoderma ne se manifestent qu entre des limites précises de températures (Papavizas, 1985). Le spectre d activité optimal de Trichoderma varie entre 18 et 25 C tandis que pour un agent pathogène comme Botrytis cinerea, il peut agir dans un spectre beaucoup plus large (entre 5 et 28 C. l étude en laboratoire de ces modes d action renseigne sur le potentiel d un champignon antagoniste à l égard du pathogène (Papavizas, 1985). Caron (1993) a évalué le potentiel antagoniste de 142 souches indigènes de Trichoderma isolées à partir de sols provenant de différentes régions agricoles du Québec. De toutes ces souches, Trichoderma harzianum fut la souche retenue en raison de son développement adapté aux conditions climatiques observées dans les serres au Québec. La vitesse de croissance de Trichoderma, à différentes températures, est connue puisque toutes les souches de Trichoderma ont subi une caractérisation thermique (entre 5 et 30 C par gradation de 5 C) ce qui permet de travailler avec des souches adaptées aux conditions climatiques où elles seront utilisées (Caron, 1993). Ce paramètre est important pour l installation de l agent biologique car plus sa vitesse de croissance sera grande, meilleures seront ses chances de s établir rapidement et d accroître le contrôle de la maladie. La vitesse de croissance est certes un facteur important mais elle peut également être contournée en appliquant plus tôt l agent antagoniste dans le but de favoriser son installation avant l arrivée de l agent pathogène. Trichoderma est également sensible aux variations climatiques (sécheresse, basses températures). Au cours des derrieres années, le potentiel antagoniste de T. harzianum a également été démontré contre les agents pathogènes des substrats dans les cultures serricoles (productions légumières et plantes ornementales) (Caron et al., 2002). 28

50 Une technique de production massive de spores de Trichoderma a également été mise au point (Caron et al., 1994a; 1998, 2002; 2003). Suite aux tests effectués, Trichoderma ne cause pas de stress aux plants, qu il n a pas d effets négatifs observés sur le développement des plants et qu il peut accroître la production (Caron et al., 2002a). En production commerciale, Trichoderma a permis d accroître les rendements de 7% par rapport aux parcelles traitées chimiquement (Caron et al., 1994b). Par contre, pour que Trichoderma soit efficace, il doit être appliqué en prévention. Selon Davet et Camporota (1986), à mesure que les traitements Trichoderma augmente, la population initiale augmente assurant un niveau croissant de contrôle. Par contre, à l arrêt des traitements, les populations de Trichoderma diminuent et sont ramenées à son niveau initial lors de l arrêt définitif des traitements. Selon Caron (2002b), l'emploi de l'agent biologique Trichoderma harzianum tel qu il est disponible actuellement, permettrait de : Restreindre l'utilisation de fongicides en agriculture : protection du consommateur et de l'environnement; Favoriser le développement des plantes en l absence d agents pathogènes dans les substrats (effet stimulant); Offrir un contrôle efficace, In vitro, contre Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp. radicislycopersici (FORL), Pythium ultimum, Phytophthora nicotiana var. parasitica, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Thielaviopsis basicola et Verticillium dahliae; Contrôler efficacement, in vivo, Botrytis cinerea, FORL, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Thielaviopsis basicola et Verticillium dahliae et à un niveau moindre, Pythium ultimum et Phytophthora nicotiana var. parasitica; Survivre et se multiplier dans les substrats pour toute la période de germination et de production des semis; Lutter efficacement contre plusieurs agents pathogènes présents en même temps dans un substrat; Se comporter de façon égale ou supérieure à un biofongicide actuellement homologué au États- Unis ; 29

51 Offrir un produit facile à manipuler, disponible sous forme de poudre mouillable, pour les arrosages ou les incorporations directes au substrat; Ne laisser aucun résidu sur les fruits; Être compatible avec la majorité des pesticides chimiques; Être d'utilisation sécuritaire en production commerciale (aucune nocivité pour les utilisateurs, l'environnement, le consommateur et les cultures). L'emploi de l'agent biologique Trichoderma harzianum permettrait également les caractéristiques économiques suivantes (Caron, 2002b) : II-MODE D ACTION ET PRINCIPE ACTIF : Trois modes d action sont principalement utilisés par Trichoderma dans la lutte aux agents pathogènes (Baker et Cook, 1982; Whipps, 1992, Papavizas, 1985). Il y a 1) la compétition, 2) le mycoparasitisme et 3) l antibiose (Harman, 2006). Ces modes d action peuvent par contre être utilisés en synergie et signalés l activation de la défense des plante (Djonovic et al., 2007). Les modes 1 et 3 étant les plus communs. Ces modes d action permettent à Trichoderma de s installer prioritairement avant l agent pathogène ce qui facilite sa survie et conservation dans le milieu. Compétition et mycoparasitisme : La compétition permet à Trichoderma d utiliser les ressources du milieu aux dépens de l agent pathogène tandis que le parasitisme fait référence à l altération ou la destruction des hyphes de l agent pathogène par des mécanismes de prédation et/ou de lyses enzymatiques (chitinases et β(1,3) glucanases) (Harman et al., 1993; Widden et Scuttolin, 1988 ;Elad, 1996). la compétition et le mycoparasitisme se sont manifestés par contact entre les deux antagonistes : 1) La croissance de l agent pathogène s arrête tandis que celle de Trichoderma se poursuit et envahit l agent pathogène ou 2) au contact entre les deux protagonistes, Trichoderma sporule abondamment avant de poursuivre sa progression vers l agent pathogène. Lors de la compétition, Trichoderma croît fréquemment en parallèle avec son hôte et s attache au mycélium de l hôte par des crochets ou haustorium soit par enroulement ou appressorium. 30

52 La dégradation des parois mycéliennes se fait grâce à la présence d enzymes telles les (1,3) glucanases, les chitinases et parfois des cellulases (Elad et al., 1983; Harman et al., 1993; Papavizas, 1995). L enroulement des hyphes de Trichoderma autour de ceux de l agent pathogène a été mis en évidence par Scanning Electronic Microscopy (SEM) (Bélanger et al., 1995; Caron, 1993). De plus, Trichoderma a un effet inhibiteur sur les sclérotes de l agent pathogène Botrytis (Dubos et al., 1982). Il diminue le nombre de conidies provenant des sclérotes par effet putrescible, ce que les fongicides ne font pas. Trichoderma inhibe également la formation de nouveaux sclérotes. Lors des différentes expériences réalisées, le mode de compétition a été mis en évidence sur les blessures d effeuillage puisque Trichoderma ne détruit pas ou n empêche pas les autres microorganismes de croître contrairement aux fongicides (Caron et al., 1994 à 97). Antibiose : L antibiose se manifeste par un arrêt de la croissance mycélienne des deux champignons (Elad and Freeman, 2002; Howell, 2003). In vitro, aucune évolution des champignons dans le temps n est observée et les fronts mycéliens sont séparés par une zone claire, généralement de 3 à 5 mm (Caron, 1993). Ghisalberti et Sivasithamparam (1991) ont décrit une batterie de substances antibiotiques produites par Trichoderma qui serait responsable de leurs propriétés antagonistes et qui sont classés dans différents groupes basés sur leur origine biosynthétique ou leur structure chimique, et ils incluent des composés non-volatile (e.g. peptaibols) et volatile (e.g. simples métabolites aromatiques, terpènes, les métabolites d'isocyano, quelques polyketides, butenolides et pyrones). (Cardoza et al., 2005; Reino et al., 2008). Bélanger et al (1995) ont démontré, dans l interaction entre Trichoderma et Botrytis, que l antibiose et le parasitisme par des enzymes pouvaient être impliqués, simultanément ou séquentiellement. Dans ce cas, des changements au niveau de la membrane de Botrytis ont été détectés 12 heures avant un contact physique entre les deux antagonistes. 31

53 Cette réaction a été suivie par une perturbation graduelle et généralisée du cytoplasme et une perte complète de la turgescence des cellules (24 heures plus tard). Dans tous les échantillons étudiés, cette réaction a toujours été observée avant la pénétration de T. harzianum dans les cellules de l hôte. Les changements ultrastructuraux notés, incluant la rétraction de la membrane, affaissement des organelles, désintégration cytoplasmique et la perte de turgescence, sont des manifestations typiques de cellules fongiques exposées à des antibiotiques (Klecan et al., 1990; Hajlaoui et al., 1992; Hajlaoui et Bélanger, 1993). Compatibilité : Trichoderma est reconnu pour avoir un large spectre de tolérance vis-à-vis les pesticides comparativement à beaucoup de micro-organismes du sol (Harman, 2002; Papavizas, 1985). De plus, Trichoderma possède la capacité de coloniser les sols traités chimiquement. Il peut être appliqué avec les mêmes appareils que ceux employés pour pulvériser les pesticides chimiques. Les tests effectués en laboratoire (Caron et al., 1993; 1994a; Venne et al., 2003 (non publié)) ont permis d établir la charte de compatibilité de Trichoderma avec les pesticides les plus couramment utilisés dans les serres. Trichoderma est compatible avec tous les insecticides vérifiés et résistant ou tolérant à la majorité des fongicides. Par contre, elle est sensible à la famille des captanes, produit largement utilisé dans les serres. IV-5- Lutte chimique : GÉNÉRALITÉS IV-5-1- Les fongicides : La découverte et le développement de molécules destinées à combattre les champignons parasites de l homme et des animaux datent du début du siècle. En effet, Drouhet et Dupont (1988) mentionnent que c est en 1903 que de Beurmann et Raymond ont préconisé l utilisation d iodure de potassium par 32

54 voie orale dans le cadre du traitement de la sporotrichose. Le triazole et ses dérivés représentent une des classes le plus biologiquement actives des composés, possédant une gamme étendue d activités. Le noyau de triazole est associé à l activité pharmacologique divers tel que l'antibactérien, antifongique, hypoglycémique et en agrochimie (Hamoir et al, 2001) Un hétéroatome, est un atome d'une molécule organique différent du carbone ou de l'hydrogène. Les plus fréquents sont l'oxygène, l'azote, le soufre des molécules d'origine biologique. Mais la synthèse utilise fréquemment les halogènes, le phosphore, les métaux, on rencontrera à peu près tous les éléments possibles sauf les plus rares et les plus lourds. Un hétérocycle est une molécule de structure cyclique comportant un ou plusieurs hétéroatomes (Zhang et al, 2002). IV-5-2- Hétérocycle à cinq éléments : Les saturés ne sont pas les plus importants, leur comportement est celui des fonctions simples. tétrahydrofurane, tétrahydrothiophène, pyrrolidine. Les insaturés sont par contre très fréquents dans les composés naturels, ils peuvent comporter plusieurs hétéroatomes différents. IV-5-3- Les dérivés azolés : L utilisation de cette classe pharmacologique à destination antifongique a pris son essor à partir de Les dérivés azolés possèdent un noyau : soit diazolé comme le kétoconazole soit triazolé comme l itraconazole 33

55 Ces différentes molécules modulent la synthèse de l ergostérol (Figure 2), un stéroïde présent dans la paroi fongique, en interagissant avec une enzyme fongique cytochrome P-450 dépendante. In fine, une altération de la perméabilité des membranes cellulaires induit la mort des cellules fongiques sensibles. Les avantages et inconvénients de ces différents dérivés peuvent être des critères importants lors du choix raisonné de telle ou telle molécule (Garanti et Molteni, 2003). IV-5-4- Test l'effet antifongique des triazoles In vitro : a- La synthèse des triazoles : Les substances triazoliques sont synthétisées selon deux méthodes (Chauffage classique et irradiation micro-ondes). Le choix de la chimie hétérocyclique a été effectué du fait de la grande importance des hétérocycles en pharmacochimie. En effet on peut estimer à 60-70% le pourcentage de substances d'intérêt pharmacologique qui possèdent au moins un hétérocycle. En général, la synthèse organique se fait en présence de solvants, ce qui présente un certain nombre d inconvénients, à savoir la difficulté d élimination des solvants à haut point d ébullition, leur toxicité, le risque de pollution. Pour éliminer les risques, des nouvelles méthodes ont été utilisées parmi elles : synthèse par sono chimie et par utilisation des liquides ioniques comme catalyseur et une synthèse sous irradiations micro-onde, cette dernière permet de réaliser soit des nouvelles synthèses, soit des synthèses déjà citées dans la littérature et d obtenir des produits d une grande pureté avec d excellents rendements à des temps très courts R 1 R 1 N N R 1 R 2 -HCN ArN3 + N R 2 N 1 2 CN N CN 3 Ar N Ar R 2 R 1 = Phenyl, p-no 2 -Phenyl, p-meo-phenyl - R 2 = CN, CO 2 Me, CO-Phenyl 34

56 b- Mode d'action biochimique : Présents chez presque tous les eucaryotes, les stérols semblent absents des procaryotes. Chez les animaux, le stérol le plus répandu est le cholestérol. Il est rare chez les plantes supérieures, qui contiennent un mélange de stérols alkylés en C 4 parmi lesquels dominent des 24-éthylstérols {sitostérol, stigmastérol). Les champignons sont, en général, riches en ergostérol {24-méthylstéroI}. Plantes, vertébrés et champignons synthétisent leurs stérols, alors que les insectes doivent se les procurer dans leur nourriture : les insectes phytophages déalkylent les stérols végétaux en cholestérol. Le rôle principal des stérols est d'entrer dans la constitution des membranes cellulaires dont ils contrôlent la perméabilité et la fluidité. Ce sont aussi des précurseurs des hormones stéroïdes (androgènes, oestrogènes, ecdysones...). La biosynthèse de l'ergostérol et les étapes auxquelles interviennent les fongicides qui l'inhibent sont connues. L,'un des premiers précurseurs, le mévalonate, est condensé en plusieurs étapes, en squalène. Celui-ci est oxydé en oxy-2,3 squalène par un système enzymatique des microsomes, qui utilise le NADPH comme accepteur d'électrons. On fait l'hypothèse que In cycli sation du squalène, initiée par l'attaque d'un proton sur l'oxygène de I'époxyde, conduit à un carbocation sur la chaîne portée par le cycle D, par un processus concerté ou non. Une série de transpositions qui passent par la migration d'un ion hydrure et tic deux groupements méthyle, et la perte d ' un proton en position 9 conduisent au lanostérol. L'alkénylation en C-24 par la S-adénosyl méthionine conduit au méthylène-24 déhydrolanostérol- Ce dernier s'accumule dans les cellules traitées avec l'un des fongicides ci-dessus. C'est que la déméthylation en position 14, qui conduit normalement au diméthyl-4,4 fécostérol, ne se produit pas. Cette déméthylation fait intervenir un complexe enzymatique comprenant un cytochrome P-450 (Hamoir et al, 2001). 35

57 V- Etude du polymorphisme enzymatique chez Fusarium oxysporum : Les estérases sont des hydrolases, enzymes qui dégradent les composés pectiques de la paroi. Elles assurent la rupture des liaisons ester entre des acides organiques, des minéraux et des alcools ou phénols et peuvent de ce fait jouer un rôle dans la pathogenèse. Dans le cas des champignons phytopathogènes, la cutine du végétal peut constituer un substrat probable pour ces enzymes, car elle est composée d esters dont l hydrolyse peut fournir les nutriments nécessaires à la croissance du parasite. Les phosphatases acides ne sont que des estérases un peu particulières dans la mesure où elles hydrolysent des liaisons ester formées avec un groupement phosphate. L analyse électrophorétique, est de plus en plus utilisée pour vérifier des données taxonomiques préétablies et fournir des critères supplémentaires, utilisables pour clarifier les problèmes posés par la taxonomie de certains groupes. Elle peut nous permettre donc de séparer les espèces ou les races physiologiques entre elles, car elle peut mettre en évidence une certaine variabilité intra spécifique (sous espèces) ou interspécifique. Le recours à l électrophorèse chez les champignons a permis de procéder à leur taxonomie en considérant un critère génétique. Son usage est basé sur la supposition que les caractères biochimiques des molécules enzymatiques produites par les allèles d un même gène seront plus semblables entre elles que celles de molécules produites par des gènes différents (Pasteur et al, 1987). 36

58 36

59 I -Le matériel fongique : I -1- Origine de la souche : Les isolats de Fusarium utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir des plantes de tomate présentant des symptômes de flétrissement et de pourriture du collet. Ils ont été confirmés comme étant du Fusarium.oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ; Fusarium oxysporum non pathogène (Tableau 1). Tableau 1. Isolats de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici utilisés dans cette étude. Origine des souches Localisation Isolats Espèces Année Mohammedia Racine F 1 FORL 2007 Bel Abbes Sol F 1' FONP 2007 Mohammedia Sol F 3 FONP 2007 Bel Abbes Racine F 4 FORL 2007 Bel Abbes Tige F 5 FONP 2007 Bel Abbes Tige F 6 FONP 2007 Oran Tige F 7 FORL 2007 Mostaganem Racine F 8 FORL 2007 *FORL: Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici. *FONP: Fusarium oxysporum non pathogène. I 2 Isolement et purification : *Milieu de cultures utilisées : Le milieu PDA (Potato dextrose agar) a été utilisé pour l isolement, la purification des souches et l obtention de l inoculum, c st un milieu qui favorise une croissance rapide et une sporulation abondante (Rappily, 1998). 37

60 Le milieu SNA : c est un milieu pauvre utilisé pour la purification des souches. *Méthodes d isolement et de purification : A partir du sol : L isolement de Fusarium oxysporum a été réalisé selon la méthode de Komada (1975) qui utilise un milieu de base auquel est ajouté une solution de pentachloronitrobenzene (PCNB) à 75% de matière active (MA) à 0,1 % (0,1g /100 ml). Nous avons utilisé aussi dans notre isolement un antibiotique (Thiophynécol, streptomycine...) pour éliminer toutes les bactéries trouvés dans le sol. Le sol rhizosphérique des plantes malades est récolté dans des sachets en plastique avec des spatules stériles ; Au laboratoire, une partie du sol est conservée au réfrigérateur à 4 C. L autre partie su sol est mise à sécher à l étuve à 60 C, tamisé bien le sol. Un gramme de ce dernier est suspendu dans le 9 ml d eau distillé stérile en tube à essai, cette solution représente la dilution 10-1, avec quelque dilutions jusqu on atteindre C est dilution est utilisé pour l isolement du champignon et 0,5 ml de la solution est étalée à la surface du milieu nutritif en boîte pétrie (15 ml du milieu agar 2%). Les boîtes pétries sont incubées dans une étuve 22 C avec une photopériode de 12 heures. A partir de la plante : L'isolement se fait par un prélèvement de parasite sur des plantes présentant des symptômes de fusariose au niveau du système racinaire et de l hypocotyle. Après lavage de l eau de robinet, le matériel végétal est coupé en petits fragments de cinq mm qui sont trempés dans l eau de javel à 2 % pendant 2 mn puis rincer à l eau distillé pendant 3 mn. Les fragments sont ensuite coupés longitudinalement, trempés dans de l alcool à 70, flambés, puis et à l'aide d'un pince, on dépose les fragments sur le milieu PDA coulé dans des boîtes de pétri. L'incubation se fait à 28 C. Après l'apparition d'une masse mycélienne à la surface des boîtes pétries on prélève un petit fragment et on le repique sur une autre boîte pétri contenant le milieu PDA, puis on incube à 28 C pendant 7 jours. Cette opération à été répétée trois fois pour purifié les isolats obtenu. 38

61 Après la purification; on obtient des différents souches à partir des quelles on a marqué notre point de départ de notre travail (Figure 01.A et B). Figure 01. A : Isolement à partir des racines. Figure 01. B : Isolement à partir des fragments de la tige. 39

62 I-3- Identification des isolats : Les différentes formes de reproduction asexuées de chlamydospores, microconidies et macroconidies représentant des caractères morphologiques stable et spécifique au Fusarium oxysporum permettant ainsi l'identification de la culture mycélienne en utilisant la clé de détermination des champignons (Messiaen et Cassini, 1968, Booth, 1971, Nelson et al 1983). Culture monospore : Le but de cette technique est obtenir un matériel fongique génétiquement homogène, les cultures monospores sont obtenues de la manière suivante dans des conditions stériles. Un fragment de mycélium est introduit dans 9 ml d eau distillé stérile, après une agitation avec le vortex la suspension sporale est diluée à fin de minimiser le nombre de spores / ml. Une goutte de la suspension contenant, généralement 2 à 5 microconidies est déposée et étalée à la surface du milieu gélosé 2% en boîte de pétri, après l incubation à l obscurité à 25 C, sous une loupe binoculaire, les germinations issues d une seul spore unique sont repiqués sur une autre boîte de pétri contenant un milieu PDA (Buxton, 1954, El Ani, 1968; In Henni, 1994). Après huit (08) jours, le comportement de chaque thalle issue de la germination des microconidies est observée (croissance, aspect du mécylium et pigmentation).si tous les thalles présentent des caractères morphologiques identiques entre eux et a ceux de la culture mère, un seul est choisi pour constituer le clone présentatif de la souche de départ. II- Caractérisation : II-1- Etude macroscopique (sur boîte pétri) : Cette étude se fait à l'œil nue ; se base essentiellement sur la vitesse de croissance, l'aspect du mycélium (cotonneux, ras...) et la couleur de colonies (Rose, blanc...) ainsi la sporulation. Pour réaliser cette étude on devrait ensemencer un fragment du mycélium âgé de 7 jours sur un milieu PDA incubé pendant 7 jours à 22 C et une photopériode de 12h. 40

63 La vitesse de croissance est évalué en mesurant chaque jour le diamètre des colonies obtenues, du quel on réduit le diamètre de l'ex plant. II-2- Etude microscopique : Cette étude elle est mise en œuvre pour reconnaître et identifier les différentes formes spéciales du fusarium. Et cela est réalisé à l'aide d'une lame et un colorant qui va nous permettre une bonne observation microscopique on basant sur certains caractères telle que la taille, la forme des «microconidies, macroconidies et les chlamydospores» et l apparition des monophialides. La culture sur lame est une technique approprié pour l'examen directe au microscope (Eyquem et al, 1998 ; Guiraud, 1998). Sur une lame de verre on déposé quelque goûtes en forme de U, la boîte de pétri contenant quelque ml d'eau distillé stérile. La culture est incubée à 28 C pendant trois (3) jours, la préparation est observée en présence de bleu de couton puis observé sous le microscope optique aux différents grossissements. L identification des espèces fongiques isolée est effectuée en utilisant les clés de l identification du genre fusarium (Messaenet Cassini, 1968, Booth, 1971; Nelson et al 1983). II-3- Caractérisation biométrique des isolats : L examen direct au microscope photonique permet d effectuer les mensurations (Langueur et Largeur) des microconidies, des macroconidies et les chlamydospores produites par les isolats de FORL. Les mensurations ont été évaluées à l aide d un micromètre, toutes les observations sont effectuées au grossissement (40 10), des observations microscopiques complémentaires sur l absence ou présence des chlamydospores sont faites. Nous avant identifié quatre souches pathogènes du genre Fusarium oxysporum f sp radicislycopersici et quatre souches sont du genre Fusarium oxysporum non pathogènes parmi les quatre-vingt isolas qui ont été testé par la technique de PCR au France par madame Hamini Kadar Nesrine. 41

64 II-4- Conservation des isolats : Deux milieux sont utilisés pour la conservation des souches : *Milieu PDA *Milieu SNA Conservation sur milieu gélose inclinée : Le champignon purifié est Repiqué sur milieu incliné et après l incubation dans des conditions citées précédemment ceux-ci sont conservés à 4 C (les bases températures augmentant considérablement la longévité des cultures) (Rappily, 1998). III- Etude physiologique : III-1- Influence de la température sur la croissance : Le milieu utilisé est le milieu PDA incorporé dans des boîtes de pétri (90mm de diamètre) qui ont été ensemencées au centre par un plant de mycélium d'une culture âgée de sept jours. Les boîtes sont mises ensuite à incuber à différentes températures : 4 C, 10 C, 20 C, 28 C, 37 C et 45 C. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque isolat et pour chaque milieu. Après sept jours d incubation des cultures à 22 C et 12 heures de photopériode, le diamètre des colonies a été mesuré. III-2- Influence de la source carbonée sur la croissance : Le milieu utilisé est le milieu PDA dans lequel le saccharose à été remplacé par d'autres sources carbonée: le glucose, le maltose, le fructose, le lactose et l'amidon. Ces milieu (20 ml) dans des boîtes de pétri seront ensemencées par des implants de mycélium âgée de sept jours; et par la suite on va les mettre à incubation pendant sept jours à 22 C et 12 42

65 heures de photopériode, le diamètre des colonies a été mesuré pour les trois répétitions de chacune. III-3- Influence de la source Azoté sur la croissance : L effet de cinq milieux de culture (PDA, Mathur, Czapeck et) (voir l annexe 01) sur les caractères culturaux de FORL. Un explantât circulaire de 5 mm prélevé d une culture jeune a été déposé au centre d une boîte de pétri (90mm de diamètre) contenant 20 ml de milieu gélosé. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque isolat et pour chaque milieu. Après sept jours d incubation des cultures à 22 C et 12 heures de photopériode, le diamètre des colonies a été mesuré. III-4- Influence de différents PH sur la croissance : Les différents PH testés sont : 4,5, 5,5, 7, 8. Pour chaque isolats nous avons utilisé trois répétitions, la mensuration de diamètre des colonies a été faite pendant les sept jours de croissance et dans les même conditions (22 C et 12h de photopériode). III-5- Influence de la lumière sur la croissance : Six boîtes de pétri contenant le milieu PDA (20ml) ont été ensemencées au centre par un fragment circulaire de 5 mm prélevé d une culture jeune. Trois boîtes ont été couvris par un sachet noir (obscurité) pendants les sept jours d incubation à 22 C cependant les trois autre boîtes ont été exposées à la lumière et dans les mêmes conditions d incubation. III-6- Influence de l humidité sur la croissance : Les boîtes pétries ensemencées ont été placées dans des dessiccateurs clos d un même volume dont le fond est rempli d une solution saturée d acide sulfurique à des différentes concentrations (Annexe 02), incubées pendant sept jours à une température ambiante, nous avons réalisé trois répétitions pour chaque traitement. 43

66 IV- Etude de pouvoir pathogène : IV-1- Etude de la virulence des espèces isolées : La détermination de la forme spéciale de ce pathogène a été réalisée moyennant des tests de pathogénécité en utilisant une série de cultivars différentiels de tomate (Hibar, 2002). Les cultivars de tomate (Lyco- persicon esculentum Mill. «Priscas») utilisés dans cette étude sont présentés dans le (Tableau 02). Tableau 02 : Les différents cultivars de tomate utilisés. Les variétés Sensible/Résistante Sain pierre S Heintz S Riogrande S Dijon R *S : sensible vis-à-vis de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. *R : résistante vis-à-vis de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. IV-2- Conditions d obtention des plantules : Les graines des variétés utilisé sont prétraitées a l eau de javel 2% pendant 3 min puis désinfectées par l eau distillé stérile et séchée, les graines sont mises à germer dans des boîtes de pétri entre deux feuilles de papiers filtres stériles imbibées d eau stérile, puis incubées à 22 C. Les semences pré germées sont repiquées dans un substrat constitue d un tiers de sable + un tiers de tourbe, ce mélange est stérilisé pendant 1h à 120 C. Les pots ont été maintenus à une température variant entre C. Les plantules arrivées au stade des deux premières feuilles étalées ont été sélectionnées pour l inoculation. IV-3- Préparation de l inoculum et l inoculation : Chaque fragment de Fusarium oxysporum à été ensemencé par un milieu PDA et incubé à 25 C pendant dix (10) jour, le mycélium de chaque souche été raclé avec 50ml d eau distillé stérile, il a 44

67 été filtré à travers une couche de papier filtre. La concentration de la suspension sporale à été ajustée a l aide de cellule de mallasez à 10 6 conidie /ml, concentration qui s était révélée suffisante pour provoquer la manifestation des symptômes selon Westerland et al (1974). L inoculation des plantules à été réalisée par immersion des racines préalablement lavées à l eau courante puis on découpe les extrémités des racines environ 1 cm et les plonger dans la suspension sporale pendant 30 mn.les plantes inoculée ont été remise dans les même pots et les plantes témoins sont plongé dans une solution d eau distillée stérile pendant 30 mn. IV-4- Estimation des symptômes : Lʼévaluation des symptômes est réalisée 30 jours après la transplantation des plantules (Woo et al., 1996) en se basant sur une échelle de notation de symptômes proposée par Vakalounakis et Fragkiadakis (1999) et qui comprend quatre valeurs allant de 0 à 3 : 0 : plante saine ; 1 : léger jaunissement, légère pourri- ture du pivot et des racines secondaires et pourriture du collet ; 2 : jaunissement important des feuilles avec ou sans flétrissement, rabougrissement des plantes, pourriture sévère du pivot et des racines secondaires, pourriture importante du collet et brunissement des vaisseaux de la tige ; 3 : mortalité totale de la plante. Lʼincidence de la maladie (%) est calculée en utilisant la formule suivante (Song et al., 2004) : ( Valeurs Nombre de plants infectés) 100 (La valeur la plus élevée Nombre total des plants) IV-5- Réisolement de l agent pathogène : Pour confirmer la virulence de la souche inoculé, les plantes présentant des symptômes on été récupérées en vue de réisolé l agent pathogène (vérification du postulat de koch), le réisolement a été fait par incubation d un fragment du segment inférieur de la tige de toute les plantes sur le 45

68 milieu PDA à 22 C et à l obscurité, les cultures fongiques obtenues sont comparées à leur culture mère (postulat de koch). V- Effet inhibiteur In vitro et in vivo du Trichoderma harzianum sur Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici: L agent antagoniste utilisé dans notre travail pour lutter contre le F. oxysporum f. sp. radicislycopersici c est le Trichoderma harzianum Rifai ; ce dernier a été isolé à partir d un sol et il est cultivé sur PDA à 25 C (Daami-Remadi, El Mahjoub, 2001). L activité antagoniste in vitro du T. harzianum a été étudiée selon deux méthodes : V-1- Confrontation par contact direct sur milieu de culture solide : Cette technique consiste à placer, dans la même boîte de Pétri contenant un milieu PDA, deux pastilles gélosées (6 mm de diamètre), l une portant le T. harzianum et l autre le F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici. Les deux pastilles sont placées suivant un axe diamétral à 3 cm et à équidistance du centre de la boîte (Figure 2A) (Benhamou, Chet, 1996). radicis-lycopersici 3 cm T. harzianum MilieuPDA Figure 2A. Confrontation de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici et de T. harzianum par contact direct sur milieu PDA Equidistant confrontation of F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and T. harzianum. L incubation est réalisée à 25 C pendant six jours. Des notations concernant l inhibition de la croissance diamétrale des colonies de F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici et leur envahissement par le mycélium du T. harzianum sont effectuées tous les deux jours. Le témoin est constitué par un repiquage du pathogène au centre de la boîte. 46

69 V-2- Confrontation à distance sur milieu de culture solide : Cette méthode consiste à repiquer l antagoniste et le pathogène dans deux boîtes séparées ; par la suite, un assemblage est réalisé par superposition des deux boîtes, le Trichoderma en bas et le Fusarium en haut (Figure 2B). F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici Milieu PDA Parafilm T. harzianum Figure. 2B. Confrontation à distance entre F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici et T. harzianum Remote confrontation between F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and T. harzianum. La jonction entre les deux boîtes est assurée par des couches de Parafilm afin d éviter toute déperdition des substances volatiles (Daami-Remadi, El Mahjoub, 2001). Les conditions de culture sont identiques à celles de la confrontation par contact direct sur milieu de culture. Le témoin est formé par superposition de deux boîtes, celle du haut contenant une pastille de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, alors que celle du bas ne contient que le milieu PDA. La notation du diamètre moyen des colonies traitées est réalisée lorsque les filaments mycéliens atteignent la périphérie de la boîte dans les lots témoins. L évaluation de l inhibition exercée par T. harzianum est estimée par le calcul du pourcentage d inhibition de la croissance mycélienne selon la formule suivante (Hmouni et al., 1996) : où I (%) = (1- Cn/Co) x 100 Cn : est le diamètre moyen des colonies en présence de l antagoniste et Co le diamètre moyen des colonies témoins. V-3-Effet du T. harzianum sur l expression de la maladie : Dans le but de tester l effet antagoniste du T. harzianum sur F. oxysporum f. sp. radicis- 47

70 lycopersici, un essai de lutte in vivo est mis en place, nécessitant les étapes suivantes. Préparation des plantules à inoculer. Les graines de chaque cultivar sont désinfectées superficiellement par trempage dans de l éthanol absolu pendant cinq minutes, puis rincées abondamment à l eau distillée stérile afin d éliminer les restes de pesticides utilisés en traitement de semences (Benhamou et al., 1997). Après séchage, les graines sont mises aseptiquement dans des boîtes de Pétri stériles contenant des papiers filtres imbibés d eau distillée stérile, à raison de 30 graines réparties uniformément sur toute la surface de la boîte ; la germination des graines est assurée suite à l incubation de ces boîtes dans une étuve réglée à 20 C pendant quatre à cinq jours. Une fois celles-ci prégermées, le repiquage des graines est réalisé dans des pots contenant de la tourbe préalablement désinfectée. L élevage des plants est réalisé dans une cellule de serre vitrée sous une température d environ 23 C et une photopériode de 12 heures. Traitement des plantules. Le repiquage des plantules de chaque cultivar de tomate est réalisé lorsque ces dernières atteignent le stade deux feuilles bien étalées (Woo et al., 1996). La transplantation des plantules est réalisée dans des sachets en polyéthylène (7,5 cm de diamètre et 12 cm de hauteur) remplis d un mélange de 50 % de perlite inoculée par le T. harzianum et 50 % de perlite inoculée par le F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. Les plantules ainsi transplantées sont mises en croissance dans une cellule de serre vitrée sous une température d environ 23 C et une photopériode de 12 heures. Des plants de chaque cultivar de tomate transplantés dans de la perlite inoculée par le F. oxysporum f. sp.radicis-lycopersici. VI- Effet inhibiteur In vitro du triazoles sur Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici: VI- Evaluation de l'effet antifongique des triazoles : Cette étude été conduite In vitro, par des tests en croissance mycélienne à partir de cultures âgées de 10 jours sur milieu PDA solide (volume final 20 ml). Dans un premier, nous avons préparé des solutions de chaque molécule de triazoles (20 molécules) à tester à une concentration de 400 ppm, puis nous avons préparé des dilutions de 50,100 et 200 ppm. 48

71 1) sur milieu PDA solide : Des implants mycéliens (diamètre calibré de 5 mm) de chacune de ces cultures ont été prélevés à la marge du mycélium en croissance active et déposés au centre de boîtes de Pétri sur milieu PDA amendé (Triazole inclut dans le milieu). L isolat de Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici a été confronté à une gamme de concentrations de chacune des vingt molécules de triazoles actives étudiées. L incubation a été faite à 22 C pendant 10 jours, la lecture se fait quotidiennement. La mesure de la croissance de chaque colonie a été faite sur deux diamètres perpendiculaires, le rayon moyen de chaque boîte a été ensuite calculé en retranchant celui de la rondelle d inoculum de départ (Kaboré et al, 2001). Pour chaque dose, on détermine le pourcentage d inhibition qui se calcule à partir de la formule suivante: Taux d' inhibition % diamètre du mycélium témoin diamètre du diamètre du mycélium mycélium témoin traité 100 VI-Pourcentage d inhibition par rapport au témoin : L estimation des concentrations d inhibition 50% (CMI 50) de chaque culture a été réalisée, pour chaque des substances actives, par la méthode graphique à partir des courbes représentant le pourcentage d inhibition en fonction du logarithme (log 10 ) des concentrations testées. VII- Etude de la compatibilité végétative (VCG) : VII-1- Le clonage : Les isolats obtenus à partir du sol ou à partir des fragments des tiges de tomate malade peuvent renfermer des noyaux génétiquement différents (le mycélium récolté peut être hétérocaryotique ou représenter un mélange de plusieurs souches récoltées simultanément dans le sol ou dans la plante malade). Avant d'étudier la compatibilité végétative, chaque isolat doit donc être cloné. 49

72 Un explant d'environ 1 cm sur 2 cm de l'isolat à cloner est prélevé soit à l'aide d'une anse (culture en tube), soit avec un microscalpel (culture en boîte de P6n-i) et déposé dans une petite quantité d'eau. Une goutte de la suspension obtenue est étalée en stries sur PDA. La germination des spores est observée généralement après 24 h à l'obscurité. Les spores (microconidies) germées sont repérées sous la loupe binoculaire. Elle sont distinguées des chlamydospores par leur petite taille et l'absence d'épaississement de la paroi, et des macroconidies en germination par l'absence de cloisons. Elles sont prélevées à l'aide d'un microscalpel et déposées sur le milieu de culture. Les thalles issus de ces spores constituent les clones. Ils sont bouturés en tube sur PDA pour conservation en chambre de culture et/ou au réfrigérateur. VII-2- La sélection des mutants : Les champignons sont généralement capables de transformer le C1O en C1O 2 qui leur est toxique. Le C1O est un analogue du NO 3 qui peut être réduit en N0-2 par le nitrate réductase. C'est ce même gène qui intervient dans la transformation du ClO - 3 en ClO - 2. Les champignons spontanément mutés au site du nitrate réductase ne peuvent pas transformer le ClO - 3. Donc en mettant une bouture d'un clone sur un milieu minimum contenant du chlorate (MMC), seules les souches mutées pousseront. Ces mutants sont appelés mutants NIT, déficients pour l'assimilation du nitrate. VII-3-La caractérisation des mutants : Elle consiste à déterminer le site de la mutation (Correll et al. 1987). Trois types de mutations sont possibles d'où trois mutants à caractériser qui sont : NIT 1, NIT 3, NIT M. Leur reconnaissance est permise grâce à la différence de leur développement sur des milieux contenant différentes sources d'azote (Correll et al., 1987) (Tableau 3). Chez Aspergillus nidulans, deux enzymes sont nécessaires à la réduction du NO 3- en NH 4+ : la nitrate réductase (NO - 3 en NO - 2 ) et la nitrite réductase (NO en NH4 + ). De nombreux gènes contrôlent ces enzymes, leur régulation est complexe. Les mutants, chlorates résistants, des espèces de Fusarium rentrent généralement dans les trois types : nit 1, nit 3, nit M (Leslie, 1990). -Pour les NIT 1, la mutation est au site du gène de structure du nitrate réductase. -Pour les NIT 3, la mutation est au site du gène de régulation du nitrate et de la nitrite réductase. 50

73 -Pour les NIT M, la mutation est aux sites des gènes de structure d'un cofacteur à molybdène nécessaire à l'activité du nitrate réductase. C Tableau 3 : Identification des mutants non utilisateur de nitrate par leur croissance sur trois des cinq sources d azote (Correll et al 1987). Site de mutation Croissance sur les différentes sources d azote Désignation Nitrate Nitrite Hypoxanthine du mutant Gène de structure de la Nit 1 nitrate réductase Gène de régulation de la nitrate réductase Nit 3 Gène de structure de Nit M cofacteur de molybdène + : Mycelium épais aérien et dense (type sauvage). - : Mycelium rasant très lâche. VII-4- La complémentation : On met en présence sur du milieu MM deux boutures des mutants nit 1 et nit M obtenus à partir de deux clones différents ou à partir du même clone (vérification de l'auto-compatibilité). Ces boutures sont déposées à un ou deux centimètres l'une de l'autre. Les mutants nit sont auxotrophes pour l'azote sous forme nitrique (milieu MM). Ils s'y développent en formant un mycélium grêle. Si les mutants sont végétativement compatibles, il y aura anastomose puis formation d'un hétérokaryon au niveau de la zone de contact des filaments des deux mutants avec l'apparition d'un mycélium aérien dense, preuve de l'hétérokaryose (Figure 3.A). S'ils ne le sont pas, il n'y aura pas de complémentation entre eux ; le mycélium restera ras et grêle même au niveau de la zone de confrontation (Figure 3.B). La confrontation entre un mutant nit M et un mutant nit 1 ou nit 3 donne le plus souvent un résultat rapide et assez net. La confrontation entre un mutant nit 1 et nit 3 donne de faibles complémentations peu apparentes même après une longue période d'attente. La confrontation préférentielle est celle entre un 51

74 mutant nit M et un mutant nit 1 (Correll et al. 1987). Celle-ci peut varier d'intensité selon les souches confrontées. VII-5- Mode de regroupement : Après la lecture, on regroupe les différents isolats selon que les résultats sont positifs (apparition d'un mycélium aérien au niveau de la zone de contact) ou négatif (si rien n'apparaît). Tous les mutants ayant complémenté avec un autre mutant sont classés dans un même groupe. Pour les réponses négatives, les deux isolats sont mis dans deux groupes distincts dont ils peuvent être l'unique représentant. Les isolats sont ainsi rassemblés dans des groupes dits de compatibilité végétative. A A Figure 3. A: mycélium aérien abondant sur la zone de confrontation, résultat +. 52

75 A B Figure 3. B : aucune apparition de mycélium aérien sur la zone de confrontation, résultat -. VIII- Techniques d étude du polymorphisme enzymatique : 1-Culture du champignon : Le champignon est cultivé dans des fioles de 200 ml posées à plat afin de favoriser un plus large développement du mycélium. Chaque fiole contenant 100 ml de milieu Jip liquide (annexe 01) est ensemencée avec cinq boutures de 5 mm de diamètre. Les cultures, à raison d'une fiole par isolat, sont conduites à 22 C pendant dix jours à 12 heures de photopériodes. 2- Préparation des extraits enzymatiques : Le mycélium, recueilli par filtration du milieu de culture sur une papier filtre, est, après élimination des implants, lavé soigneusement à l'eau distillée puis épongé dans du papier filtre. Il est ensuite broyé dans un mortier (maintenu au froid dans de la glace pilée) en présence de sable de Fontainebleau, avec addition de tampon phosphate 0,5 M PH 7, jusqu'à l'obtention d'une pâte fine et homogène. Cette dernière est ensuite centrifugée pendant 2 0 mn à tr/min à 4 C. Le surnageant est réparti dans des tubes Eppendorf par fractions de 100 µl, puis, soit utilisé 53

76 immédiatement pour l'électrophorèse soit conservé au congélateur. Il constitue l'extrait enzymatique qui sera déposé sur les gels d'électrophorèse. Un extrait enzymatique, une fois décongelé, n est plus recongelé. 3-L électrophorèse : L'électrophorèse verticale, en conditions non dénaturantes, est conduite sur des gels de polyacrylamide. A-Préparation des gels : Le gel d acrylamide utilisé possède des propriétés physiques qui l apparentent de près au gel d amidon. Polymère synthétique formé a partir des produits à faible pois moléculaires et de haute pureté, ce gel assure un mécanisme électrophorétique lié à deux phénomène distincts : *l un est le déplacement sous l action d un champ électrique de molécules chargées différemment à un PH donné ; *l autre est une filtration moléculaire dans la masse du gel qui a pour effet de ralentir le déplacement des molécules. Les gels ont été préparés selon la technique de Laenlmli, 1970 modifiée de la manière suivante Tableau 04: Tableau 04 : Composition des gels d acrylamide. Solutions mères Gel de concentration Gel de séparation 5% (ml) 10% (ml) Solution acrylamide 30% 25 5 Solution bis-acrylamide 1% Tampon de séparation (ph: 8.8) Tampon de concentration (ph: 6.8) Eau distillée Temed Solution persulfate d Ammonium 10% Agiter délicatement et dégazer avant d ajouter le persulfate d ammonium 54

77 Tampon de migration Nous avons utilisé le tampon Tris-glycine ph 8,3 qui nous a permis d'obtenir une bonne migration et une bonne résolution de tous les systèmes enzymatiques révélés. B-Dépôt des extraits et migration : Pour les protéines, les extraits sont dilués dans le tampon charge avec SDS et chauffé (quantité égale) sur bain marie pendant deux mn puis sont déposés dans les puis de gel d acrylamide SDS-PAGE. Pour les enzymes, les extraits bruts de chaque échantillon sont dilués dans du tampon de charge (25 % v/v) avant d'être déposés dans les puits des gels d acrylamide PAGE. Vingt-cinq microlitres (25 µl) de cette dilution sont déposés à la seringue dans chaque puits. La migration se déroule en chambre froide à 4 C sous tension constante de 120 V, avec une intensité de 50 ma, durant 1heure. Deux systèmes enzymatiques ont été étudiés (Tableau 05). Tableau 05: Systèmes enzymatiques étudiés. SIGLE NOM CODE EST Estérases E.C ou 2 PAC Phosphatase acide E.C C-Révélation des activités enzymatiques : Après démoulage, chaque gel est placé dans le milieu réactionnel correspondant à l'activité enzymatique à révéler (Tableau 06); les conditions de révélation et la composition des différents milieux réactionnels sont celles indiquées par Pasteur et al.,1987 ou Brewer, 1970, modifié par Second et Trouslot Chaque zymogramme est analysé avant et après séchage puis archivé sous forme de document photographique. 55

78 Tableau 6: Milieu réactionnel de révélation des activités enzymatiques. SYST.ENZY MILIEU REACTIONNEL QUANTITE ESTERASE PAC Fast Blue RR Salt ; Phosphate de Na 0,1 M, ph 7,1 ; B Naphthyl Acétate 2% dans l'acétone. Naphthyl-Acid-Phosphate ; Fast Blue BB ; Acétate / Na011 0,15 M, ph 5, mg 97 ml 1,5 ml 50 mg 50 mg 40 ml 4-Lecture des zymogrammes : La position relative des bandes iso-enzymiques est facilitée par la présence, sur chaque plaque électrophorétique, d'un extrait d un isolat témoin, toujours la même, fourni ssant un profil enzymatique clair et stable. L'ensemble de ces analyses est faite en double (touts les enzymes de tous les isolats) et de manière indépendante: extractions enzymatiques à partir de nouvelles cultures de chaque isolat. 5-Analyse des zymogrammes : L'analyse des zymogrammes n'a tenu compte que de la présence et de l'absence des bandes qui sont considérées comme des caractères phénotypiques discriminants et indépendants. Pour chaque système enzymatique, l'ensemble des positions des iso-enzymes de tous les isolats est répertorié; ces positions sont numérotées de 1 à n, la position 1 correspondant à la bande dont la migration est la plus lente, et n, la plus rapide. L'ensemble des données fournies par les 14 systèmes enzymatiques constitue le "profil phénotypique" caractéristique de chaque isolat. Les isolats présentant le même phénotype appartiennent au même zymodème, phénon élémentaire au sens de Sneath. 56

79 56

80 I- Caractérisation morphologique et biométrique du FORL : A- Résultat : L étude morphologique et biométrique de quatre isolats de FORL à permis de distinguer trois morphotypes avec une variabilité dans l aspect, la pigmentation du mycélium fongique ainsi que dans les mensurations des macroconidies, microconidies et les chlamydospores. I-1- Caractéristique culturale : Les résultats obtenus dans le (Tableau 1) montrent trois morphotypes différents, cotonneux, duveteux et ras muqueux), la description des trois morphotypes est la suivante : Type cotonneux : les sporodochia sont absent, le mycélium aérien extrêmement vigoureux remplit le type de culture, ne produisant à 22 c que des microconidies, isolats présentent ce morphotype F1 - F7-F8 (Tableau 1). Type duveteux : le mycélium aérien est assez court mais dense, produit des microconidies en grande quantité, les chlamydospores se forment tardivement, trois isolats présente le morphotype : F5-F6 (Tableau 1). Type ras Muqueux : ne présente pas de mycélium aérien les microconidies sont abondantes et les macroconidies en faible quantité les deux types de spores sont produit dans des sporodochies, isolats présentes dans se morphotype F1 - F3 -F4 (Tableau 1) I-2- Pigmentation des thalles : Nous avons pu relever une pigmentation très diversifies, le mycélium présente des pigmentations violet, blanches, rose et rose orangé (Figure 1). 57

81 Figure 01 : quatre souches représentant quatre pigmentations différentes. I-3- Caractérisation biométriques des spores : Les mensurations des microconidies et des macroconidies et les chlamydospores produites par FORL les spores produites sont : *Les microconidies : Notre isolats étudié sont caractérisé par la présence abondante des microconidies ovoïdes, droites ou incurvées elles sont généralement unicellulaires porté par des conidiospores ramifies (Figure02) et mesurent de 4,85-5,71 et 6,42 (Tableau 1). *Les macroconidies : La production des macroconidies est très faible par apport les microconidies et elles sont formés de trois à quatre cloisons (Figure 03). 58

82 Ces spores se trouvent disperses sur le filament mycélien et leur mensurations sont de dimension est de 11,42 jusqu à12, 85 (Tableau 1). 1 µm 0,4mm Figure 02 : Microconidies vues au microscope ( 40). 1 µm 0,4mm Figure 03 : Macroconidies vues au microscope ( 40). 59

83 1 µm 0,4mm Figure 03 : Macroconidies vues au microscope ( 40). *Les chlamydospores : Après environ 15 jours de culture, les chlamydospores apparaissent sur le mycélium, elles sont intercalaires ou terminales, arrondies avec une double paroi (Figure 04) est mesurent de 2,85 jusqu à 4,28 (Tableau 1). Chlamydospores 1 µm 0,4mm Mycélium Figure 04 : Chlamydospores vues au microscope ( 40). 60

84 Tableau 01 : Caractérisation morphologique et biométrique des isolats. Caractérisation Caractérisation biométrique morphologique Microconidies (μm) Macroconidies (μm) Chlamidospores (µm) Isolats morphotype pigmentation longueur largeur longueur largeur diamètre F1 Ras muqueux mauve 7,14 1,42 18,57 1,42 4,28 F1 Cotonneux Violet 5,71 1,42 11,42 1,42 4,28 F3 Ras muqueux blanc 5,71 1,42 12,85 1,42 4,28 F4 Ras muqueux Violet 7,14 1,42 11,42 1,42 2,85 F5 duveteux Orangé 4,28 1,42 12,85 1,42 4,28 F6 Duveteux Orangé 5,71 1,42 11,42 1,42 4,28 F7 Cotonneux Violet 6,42 1,42 11,42 1,42 4,28 F8 Cotonneux Orangé 5,71 1,42 10,00 1,42 4,28 B- Discussion : En ce qui concerne la morphologie du thalle et la pigmentation, les résultats obtenus relèvent une variabilité nette entre les 7sept isolats du F.oxysporum. Les variations portent sur des caractères culturaux (aspect du mycélium aérien, pigmentation du thalle) et des organes fructifères (macromicroconidies et sporodochies). D après Messien et Cassim ; (1968), la variabilité mycélium est un phénomène commun chez les formes spéciales de F. oxysporum. La pigmentation cependant si elle constitue un critère d identification de certaines espèces, elle ne permet pas de distinguer les formes spéciales de F.oxysporum. Plusieurs d entre elles pouvant manifester une même coloration comme c est le cas des formes spéciales lycopersici, lini, pisi (Cherrab, 1989). Puisque les différents isolats incubés sur le même milieu et dans les même conditions, manifestent une gamme de coloration (Tableau 1), concordant avec celles définies par Messien et Cassini (1968, 1981) pour le fusarium oxysporum. Donc l influence du milieu ne pourrait être impliquée dans la variabilité des caractères culturaux observés (Terrestre, 2003). Les mensurations des microconidies, macroconidies et chlamydospores sont similaires à celle décrites par Haware et al (1986), la forme sexuée n est pas encore rapportée dans la nature, les 61

85 variations morphologiques et parasitaires de Fusarium doivent donc s expliquer sans faire appelle à des phénomènes sexuels (Messien et Cassini, 1968). Cette variabilité concerne aussi le taux d accroissement des colonies. Si ce taux est conforme au taux moyen de croissance mycélienne des souches de F. oxysporum (4,5 mm à 6,5mm par jour) selon Booth (1971). Il est néanmoins plus élevé que celui rapporte pour certaines formes spéciales telles que : albergiers, canariensis, lini lycopersici (Cherrab, 1989). L influence du milieu ne pourrait être impliqué dans la variabilité constante, les conditions d incubation étant stable et identique, cette diversité dans la morphologie et la pigmentation chez les Fusarium oxysporum en générale reste jusqu'à ce jour sans explication. Selon (Messien et Cassini, 1968), la variabilité phrénologique serait de probablement à des phénomènes de mutation d origine cytoplasmique ou d origine nucléaire, la variabilité lié à des mécanismes de compatibilité végétative est bien connu chez les champignons à reproduction asexuée. II- Etude physiologique : Dans cette étude on prend deus souches parmi les huit à tester comme exemple, l une c est l isolat F7 qui représente une souche de l espèce FORL et l autre c est l isolat F1 qui est parmi de la sélection de FONP. II-1-Effet de la lumière et l obscurité sur la croissance mycélienne de FORL : A- Résultat : Après sept jours de culture les mensurations des colonies des deux isolats étudiés de FORL (F4) et FONP (F 1') étant faite et les résultats sont décrits dans le Tableau 02 : Tableau 02 : l influence de la lumière sur la croissance de deux isolats étudiés F7 et F1 -. La lumière L obscurité 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h F7 2,0 2,9 4,2 5,4 7,2 1,5 1,9 2,3 3,8 4,6 F1-1,4 2,3 3,5 4,8 6,8 0,9 1,1 1,8 2,4 3,9 62

86 B- Discussion : La croissance mycélienne montre qu il ya des différences significatives entre les isolats, la croissance mycélienne et la sporulation sont optimales sur le milieu PDA avec un taux d accroissement quotidienne d un isolat à d autre. Selon les différents critères de croissance mycélienne de nos isolats, on distingue deux groupes : A et B. *A : par les isolats de FORL. *B : par les isolats de F.oxysporum non pathogène. Le groupe A, la vitesse de croissance est plus rapide par apport au groupe B avec ou sans lumière (obscurité) sur milieu PDA et dans les mêmes conditions de croissance (à 22 C). Les résultats obtenus ors nos essais (Figure 05) montré une indifférence du champignon à la lumière pour son aptitude à la croissance mycélienne. Toutefois, la lumière semble favoriser la production des macroconidies, alors que leurs productions en obscurité sont faibles. Figure 05.A :L effet de l obscurité sur la croissance de l isolat F1. 63

87 Figure 05.B : L effet de la lumière sur la croissance de l isolat F1. 2- L influence de la température sur la croissance mycélienne : A- Résultat : Les résultats obtenus dans le Tableau 03 montre la température optimale pour la croissance mycélienne des isolats étudiés FORL (F7)-FONP (F 1'). Tableau 03 : l influence de la température sur la croissance mycélienne. F7 F1' Y 4 C 10 C 20 C 28 C 37 C 42 C 4 C 10 C 20 C 28 C 37 C 42 C 72 h 0 1,7 3,6 4,6 1, ,2 3,0 2,4 1, h 0 2,4 4,6 6,7 1, ,1 4,3 4,2 1, h 0 2,7 6,4 7,2 2, ,2 5,4 5,3 2, h 0 2,8 7,3 8,2 2, ,9 6,2 6,4 2, h 0 4,5 8,0 8,5 2, ,9 7,5 7,8 2,5 0 64

88 B- Discussion : La température a exercé un effet très important sur la croissance et la sporulation du champignon, nous avons également remarqué que le diamètre des colonies varies de 0 à 8,5 cm, la température de 4 C paraît totalement défavorable au développement des huit isolats, à partie de 110 C le développement mycélien est progressif, la croissance mycélienne est optimale de 20 C à 28 C dont F7 a enregistré un diamètre de 08 jusqu au 8,5 cm et F1 un diamètre de 7,5jusqu à 7,8 cm (Tableau 03). On résulte donc un intervalle de températures varie entre 20 C et 28 C convenable pour la température du champignon (Figure 06). Les hautes températures supérieurs ou égales à 40 C sont défavorable pour les deux isolats, elles empêchent la croissance mycélienne, la croissance de F7, F1 s est manifestée aux températures supérieures à 10 C c'est-à-dire que le champignon peut se développer entre 10 C 37 C, ce ci confirme les résultats obtenus par Subramoniam (1974) (Figure 06) Figure 06 : l isolat F7 dans différant degrés de température. *1 :4 C *2 :10 C *3 :20 C *4 :28 C *5 :37 C *6 :42 C. Selon Bouhot et al. (1972), les températures cardinales de la croissance mycélienne sont : 4 C, 28 C et 37 C ; tandis que Couteaudier et al. (1986) ont trouvé la température obtimale du développement du Fusarium oxysporum f.sps.lycopersici est de 27 C, Gindrat (1979) et Laterrot (1988) ont montré que l optimum est de 28 C, selon Walker (1961) et (1971) les températures optimales de la fusariose 65

89 vasculaire de la tomate sont de l ordre de 28 C et le début d infestation commence à partir de 20 C. en 1953, Roger a trouvé que la température optimale pour l infection est de 27 C et encore très favorable entre 25 C et 30 C, la croissance est pratiquement inhibé à moins de 10 C et plus de 37 C, l optimum thermique de la maladie est de 28 C (Messiaen, 1981). 3- L influence de la source carbonée sur la croissance mycélienne : A- Résultat : Les deux isolats sont testés sur les différents milieux qui représentent la source de carbone et leurs résultats sont décrits dans le Tableau suivant : Tableau 04 : l influence de la source carbonée sur la croissance mycélienne. F7 F1' Lac Mal Sac Glu Fru Amid Lac Mal Sac Glu Fru Amid 72 h 2,1 2,0 1,9 1,9 2,1 2,1 1,9 1,8 1,8 1,9 1,5 1,5 96 h 3,1 3,0 2,5 2,8 2,8 2,9 2,9 2,4 2,6 2,6 2,0 2,3 120 h 4,8 4,2 4,1 4,5 4,2 4,4 4,4 3,9 4,0 4,0 3,4 3,9 144 h 5,9 5,3 5,3 5,8 5,5 5,8 5,6 5,0 5,2 5,1 4,9 5,2 168 h 7,8 8,5 7,0 8,5 7,0 7,5 7,5 6,4 6,9 7,0 6,8 6,5 B-Discussion : Les différents souches de FORL ont une croissance maximale en présence de Glucose ou de Maltose (8,5cm) et un peu moins avec les autre sources carbonées tel que : le Saccharose, Fructose, Lactose et Amidon qui ont à peu prés le même diamètre de croissance mycélien. A propos des souches concernant FONP, une croissance remarquable en présence de Lactose (7,5 cm) qui représente la source carboné la plus importante. Par contre le Saccharose, Fructose, Glucose et Maltose donne une croissance maie moins que selle de Lactose (Figure 07.A et B). 66

90 Figure 07.A : l isolat F1 dans différente sources de carbone. Figure 07.B : l isolat F7 dans différente sources de carbone. De nombreuses espèces fongique montrent des exigences généralement identiques ou très proches, mais chaque espèce ne manifeste une croissance et une sporulation optimale que dans les conditions très particulières (Moreau, 1983). 67

91 4- Etude de l effet des milieux de culture sur la croissance mycélienne : A- Résultat : Les résultats de notre travail sur l effet des différents milieux de culture sur la croissance des isolats de FORL et FONP sont mentionné sur le Tableau si-dissous (Tableau 05) : Tableau 05 : l influence des milieux de culture sur la croissance de deux isolats étudiés FORL (F7)-FONP (F 1'): 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h PDA 2,0 2,9 4,2 5,4 7,2 Czapek 1,8 2,3 3,7 4,5 5,8 Mathure 1,9 3,0 4,4 5,7 7,6 F7 Asparagine KNO 3 2,6 3,5 4,0 4,8 5,6 1,0 1,1 1,2 1,2 1,3 NH 4 SO 4 PDA 1,5 2,0 3,1 4 4,8 1,4 2,3 3,5 4,8 6,8 Czapek 0,9 1,5 1,8 2,9 3,8 F 1' Mathure Asparagine KNO3 NH 4 SO 4 1,2 2,3 3,9 4,5 5,5 2,3 3,6 4,3 5,4 6,3 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 0,8 1,5 2,6 3,9 5,5 B- Discussion : Sous les conditions de culture utilisées, le milieu PDA révèle une variation morphologique plus importante que les autres milieux. En effet, cinq caractères morphologiques variables (pigmentation des thalles, secteurs variants, couleur, aspect du mycélium et zonation des spores) sont notés sur milieu PDA (Figure 08). Nous avons également noté de faibles valeurs de la croissance sur le milieu synthétique d origine minérale Czapek, ce qui est sûrement lié en premier lieu à leur composition. D autre part, cette faible croissance pourrait être liée aussi aux besoins du pathogène en composés organiques et en facteurs de croissance présents dans ces milieux car les isolats phytopathogènes sont souvent auxotrophes. Nous avons remarqué que les isolats se sont bien développés sur les milieux, Mathur et PDA qui contiennent des quantités relativement importantes de composés organiques, par contre une faible production de mycélium est obtenue sur milieu Czapek. Pour les sept isolats (FORL et FO non pathogène) le mycélium prend une couleur différente selon les milieux. 68

92 F Cz PDA Figure 08 :l isolat F7 dans différents sources d azote. 5- Etude de l effet de l humidité sur la croissance mycélienne : A- Résultat : Les résultats de notre travail sur l effet des différents milieux de culture sur la croissance des isolats de FORL et FONP sont mentionné sur le Tableau si-dissous (Tableau 06) : 69

93 Tableau 06 : L effet l humidité sur la croissance de deux isolats étudiés FORL (F7)-FONP (F 1'): F7 F 1' 14% 50% 74% 80% 95% 100% 14% 50% 74% 80% 95% 100% 72 h 1,5 1,5 1,6 1,6 1,0 0 1,2 1,3 1,6 1,4 1, h 1,9 2,0 2,1 2,1 1,5 0 1,7 1,9 2,1 1,8 1, h 2,1 2,4 2,5 2,5 1,9 0 2,1 2,4 2,5 2,0 1, h 2,7 2,9 3,0 3,1 2,2 0 2,6 2,8 3,0 2,4 2, h 3 3,2 3,4 3,6 2,8 0 2,9 3,0 3,9 2,9 2,8 0 B-Discussion : Pour les deux isolats testés, nos résultats ont montré que le taux d humidité relative fourni n a aucun effet significatif sur la croissance mycélienne du champignon in vitro (Tableau 06) dont les intervalles de diamètre enregistré varies de, dans ce contexte Rapilly (1968) à signalé que l eau nécessaire à la croissance est apporté par le milieu de culture mais nous avons constaté un effet important de l humidité sur la sporulation du Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici, Figure 09.A :l effet de l humidité sur la croissance de l isolat F7. Étant donné que la tomate est une plante irriguée ou l irrigation peut constituer un moyen de transmission du champignon, ainsi que l humidité du sol influe sur la germination des 70

94 Chlamydospores et l apparition du tube germinatif et sa survie à proximité de la plante qui par la suite pénètre dans la plante hôte (Agrio, 1978 ; Besri, 1975). Figure 09.B :l effet de l humidité sur la croissance de l isolat F1. Selon Roger (1953), dans les terrains en permanence humide, gorges d eau, les activités biochimiques tendent à devenir anaérobiques et par conséquent à créer un milieu acide, qui convient particulièrement à la pullulation des nématodes ceux-ci à leur tour ou les blessures qu ils causent aux racines facilitent beaucoup la pénétration des Fusarium. 6- L effet du PH sur la croissance mycélienne : A- Résultat : Les résultats des différent PH sur la croissance mycélienne pendant les sept jours sont décrit dans le tableau suivant : 71

95 Tableau 07 : L effet du PH sur la croissance de deux isolats étudiés FORL (F7)-FONP (F 1'): F7 F1 4,5 5, ,5 5, h 1,0 2,9 3,3 2,9 0,8 2,5 2,8 2,6 96 h 1,7 3,6 4,5 4,2 1,2 2,8 3,4 3,5 120 h 2,4 5,1 6,1 5,4 2,0 3,9 5,1 4,8 144 h 3,0 6,6 7,0 6,5 2,8 5,0 6,0 5,9 168 h 3,5 7,2 8,0 7,0 3,0 6,0 7,1 6,7 B-Discussion : Il ressort de nos résultats que F7, F1 ont un comportement hétérogène vis-à-vis des différents PH du milieu de culture, la vitesse de croissance de F1 est faible par apport à celle de F7, alors la croissance mycélienne de F1 a eu lieu après 96h tandis que celle de F7 atteint 2,4 cm au PH 4 (Tableau 07). La réaction de F1 a été exprimée par une production de la pigmentation c'est-à-dire l apparition de zonassions autour du transplantât, ces zones sont légèrement différentes d un PH à d autre alors que F7 a réagi par une différentiation du type de mycélium (aérien, ras et dense) (Figure 10). Les isolats produisent un pigment rose sur un milieu acide avec une production de microconidies et un mycélium aérien (Figure 10). Ceci confirme les résultats obtenus par White (1927) cité par Walker (1971) dans le même contexte Sebeck cité par Walker (1971) a noté que cette pigmentation correspendant à une réaction importante qui se situe généralement entre le PH 2 et 6. Kreitmen (1949) cité par Walker (1971) a nommé ce pigment «lycopersin» localisé dans le mycélium et dans les chlamydospores n est pas diffusé dans le milieu. Nous remarquant que le PH 5,6 et 7 ont permit un bon développement mycélien et une bonne fructification pour les deux isolats (8,0 et 7,2) pour l isolat F7, (6 et 7) pour l isolat F1. Les PH 4 n empêchent pas le développement mycélien mais l optimum de la croissance est situé entre les PH5, 6 et 7. Laumon (1977) In Tebibel (1979) a constaté que la production des conodies est associée a une augmentation du PH ainsi que les études de Sherwood (1923) cité par Walker (1971) ont montré 72

96 aussi que le champignon pouvait se développer in vitro dans un intervalle de PH variant de 3,6 à 8,4 ceci est un accord avec nos résultats. Selon Pat et al (1972), l infection par le Fusarium oxysporum est plus sévère en sol légèrement acide qu en sol alcalin, la germination des spores étant située respectivement entre les PH 4,5 et 7,0. 5,6 7 PH 4,5 8 Figure 10 : l effet du PH sur la croissance mycélienne. III- Etude de pouvoir pathogène : A- Résultats : L étude de la virulence, a montré que les quatre isolats de FORL attaquent les plantules après quelques jours de l inoculation (15 jours), en provoquant chez celles-ci du jaunissement au niveau des feuilles inférieurs. Les résultats de ce test montrent que les isolats ont attaqué des variétés différentielles de tomate heintz, sainpierre et riogrand mais ils sont stoppé avec la 4emé variété (Dijon) qui est une variété résistance (hybride). 73

97 L isolat F4 qui présente une vitesse de croissance plus élevé par rapport aux isolats, a déclenché une réaction de forte sensibilité chez l hôte heintz, sainpierre et riogrand (Figure 12). Ainsi nous avons remarquée un système racinaire, brun et pourri, vaisseaux brun chocolat dans les parties basses de la tige. A-propos des souches qui représentent les quatre isolats de FONP ne correspond à aucun symptômes sauf qu elles sont provoqués par un stresse biotique du aux facteurs climatiques connus tel que la sécheresse, l humidité...ect D une manière générale nous avons noté que les huit isolats ont un pouvoir pathogène vis-à-vis les trois variétés différentiels. L isolat F4 s est montré plus agressif parce qu il présente en réalité un taux de sporulation et une vitesse de croissance relativement importance. Les symptômes obtenus lors de la dernière lecture (quatre semaines) sont évalués selon l échelle à 4 points décrite par (Song et al., 2004). Elle est essentiellement basée sur la réponse de l hôte et le développement des symptômes sur les différentes parties aériennes. Notre isolats n ont pas dépassé la valeur 02 qui présente un jaunissement important des feuilles avec ou sans flétrissement, rabougrissement des plantes, pourriture sévère du pivot et des racines secondaires, pourriture importante du collet et brunissement des vaisseaux de la tige. Pour confirmer la virulence de nos souches inoculés, les plantes présentant des symptômes on été récupérées en vue de réisolé l agent pathogène, et d après la Figure 11, on montre que les plantes inoculés et notre souches mères représentes les mêmes critères morphologiques, donc on peut dire que nous avons les mêmes souches. B- Discussion : L étude du pouvoir pathogène, nous a permis de démontrer la pathogénécité des huit isolats sur trois variétés différentiels tomate. En même temps d'affirmer l'appartenance des souches à l espèce de Fusarium oxysporum agent de fusariose de tomate, de part les symptômes apparus sur les plantules inoculées et qui sont identiques à ceux observés sur les plants ayant servi à l'isolement, Nous avons utilisé l'infection «in vivo» citée par Labdi, 1990; Bensouda, 1993 et El Biari, 1995, c'est la méthode qui a donné les meilleurs résultats puisque l'inoculation se fait au stade plantule permettant ainsi de réaliser le test dans un temps relativement court. 74

98 Saint pierre Figure 11.A : Réisolement à partir des racines. Saint pierre Figure 11.B : Réisolement à partir des fragments de la tige. 75

99 Figure 12.A : Comparaison entre une plante repiquée dans l inoculum (F. oxysporum f. sp. radicislycopersici) (A) et une plante témoin (B) ; A Figure 12.B : la pathogénécité de l isolat F4 sur des variétés de tomate. *A : jaunissement complet des feuilles. 76

100 B Figure 12.C : la pathogénécité de l isolat F4 sur des variétés de tomate. *B : flétrissement des tiges. IV-1- Confrontation directe sur milieu de culture entre F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici et T. harzianum : A- Résultat : Le repiquage simultané de T. harzianum et des isolats de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici a montré une croissance plus rapide de T. harzianum que des isolats de F. oxysporum f. sp. radicislycopersici. Au bout de quatre jours d incubation, la boîte est totalement envahie par l antagoniste, alors que les isolats de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici n occupent qu une surface de 0,6 cm de diamètre ; ce qui correspond à une inhibition de la croissance mycélienne supérieure à 65 %. Le témoin F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici cultivé seul occupe une surface d environ 50 mm de diamètre (Figure 13.A). La confrontation directe aussi de l antagoniste (Trichoderma harzianum) vis-à-vis du pathogène (Fusarium.oxysporum f.sp.radicis-lycopersici), in vitro, montre une séparation des fronts mycéliens des deux champignons par une zone claire (Caron, 1993) (Figure 13.B). 77

101 Cela signifie par une antibiose qui se manifeste par un arrêt de la croissance mycélienne des deux champignons (Elad and Freeman, 2002; Howell, 2003). F4 Tri Figure 13.A : Effet inhibiteur direct du T. harzianum sur la croissance mycélienne du F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici pour une durée d incubation de six jours à 25 C. Zone de séparation F8 Tri Figure 13.B : Effet inhibiteur direct du T. harzianum sur la croissance mycélienne du F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici pour une durée d incubation de six jours à 25 C. 78

102 B- Discussion : Au delà de cette période et au terme de six jours, T. harzianum envahit les colonies de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici et sporule même sur celles-ci, révélant ainsi son pouvoir hautement mycoparasitaire (Benhamou, Chet, 1996 ; Daami-Remadi, 2001 ; Daami- Remadi, El Mahjoub, 2001). L envahissement du mycélium du pathogène par T. harzianum a également été observé par Benhamou et Chet (1997) en réalisant une confrontation directe sur milieu de culture entre cet antagoniste et un autre champignon tellurique, le Pythium ultimum et ce au bout de quatre à cinq jours après l inoculation. Cependant, Daami-Remadi et El Mahjoub (2001) ont signalé, en testant l activité antagoniste de T. harzianum vis-à-vis de deux espèces de Pythium, que pendant les trois premiers jours la boîte de Pétri est totalement envahie par Pythium spp. et que T. harzianum ne commence à exercer son activité antagoniste qu à partir du 4e jour d incubation. Des observations microscopiques réalisées au niveau de la zone de contact entre T. harzianum et F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, montrent une modification profonde au niveau du mycélium du pathogène se marquant par une lyse importante (Figure 14), une transformation en cordons des filaments mycéliens (Figure 15) et un enroulement du mycélium du T. harzianum sur celui du F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Figure 16A et B) (In Khaled Hibar, 2005). Ce même isolat de T. harzianum a été testé par Daami-Remadi (2001) sur F. solani var coerulum, F. roseum var sambucinum et F. roseum var graminearum, responsables des pourritures sèches sur tubercules de pomme de terre envers lesquels ils induisent également une lyse importante au niveau du mycélium de ces pathogènes. Il en est de même des mycéliums de Pythium spp. En présence du même antagoniste (Daami-Remadi, El Mahjoub, 2001). Dans le même sens, Benhamou et Chet (1996) ont signalé une altération du mycélium de Sclerotinium rolfsii causée par T. harzianum, se traduisant par une agrégation, une rétraction et une vacuolisation du cytoplasme qui illustre bien le pouvoir hautement myco-parasitaire que possède T. harzianum. 79

103 Des résultats similaires sont obtenus avec T. lignorum qui est capable de s enrouler sur le mycélium du Rhizoctonia solani causant ainsi une dissolution du cytoplasme du pathogène (Howell, 2003). Figure 14. Lyses au niveau du mycélium de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici en présence de T. harzianum Lyses on F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici mycelium in the presence of T. harzianum ( 400). Figure 15. Transformation en cordons du mycélium de F. oxys- porum f. sp. radicis-lycopersici en prése -nce de T. harzianum- Transformation into cords of F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici mycelium in the presence of T. harzianum ( 400). Figure16. A. Début d enroulement du mycélium du T. harzianum sur celui du F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ( 400) Beginning of rolling up of T. harzianum mycelium on that of F. oxysporum f. sp. radicislycopersici ( 400). 16. B. Enroulement du mycélium du T. harzianum sur celui du F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ( 400) Rolling up of T. harzianum mycelium on that of F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ( 400). 80

104 Ghisalberti et Sivasithamparam (1991) ont décrit une batterie de substances antibiotiques produites par Trichoderma qui serait responsable de leurs propriétés antagonistes et qui sont classés dans différents groupes basés sur leur origine biosynthétique ou leur structure chimique, et ils incluent des composés non-volatile (e.g. peptaibols) et volatile (e.g. simples métabolites aromatiques, terpènes, les métabolites d'isocyano, quelques polyketides, butenolides et pyrones). (Cardoza et al., 2005; Reino et al., 2008). Bélanger et al (1995) ont démontré, dans l interaction entre Trichoderma et Botrytis, que l antibiose et le parasitisme par des enzymes pouvaient être impliqués, simultanément ou séquentiellement. Dans ce cas, des changements au niveau de la membrane de Botrytis ont été détectés 12 heures avant un contact physique entre les deux antagonistes. IV-2- Confrontation à distance entre FORL et T. harzianum : A- Résultat : Cette technique nous a permis de mettre en évidence l effet inhibiteur même à distance du T. harzianum exercé sur les isolats de F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici ; cet effet est évalué par la mesure des diamètres des colonies de ce dernier cultivé en présence ou en absence de l antagoniste. Les résultats obtenus montrent une nette réduction du diamètre moyen des colonies de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici en présence de T. harzianum par rapport au témoin non traité. Après six jours d incubation à 22 C, cette réduction atteint 4,8 cm pour l isolat F1 traduisant une inhibition de l ordre de 63 %. B- Discussion : Il ressort que, malgré l absence d un contact direct entre les isolats de Fusarium testés et T. harzianum, ce dernier a pu exercer une activité inhibitrice sur le développement des colonies de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Figure 17). Ceci s expliquerait par l aptitude de Trichoderma à produire des substances volatiles qui sont capables de limiter et même de stopper le développement de l agent pathogène. 81

105 Figure 17 : Effet inhibiteur à distance du T. harzianum sur la croissance mycélienne du F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici pour une durée d incubation de six jours à 25 C. Dans ce même sens, Daami-Remadi (2001) a montré l effet fortement antagoniste du même isolat de T. harzianum vis-à-vis des Fusarium responsables de la pourriture sèche sur des tubercules de pomme de terre. Cette inhibition était plus marquée (près de 93 %) si l antagoniste était apporté sous forme d une suspension de spores dans le milieu de culture. Dans le cas de Pythium spp. qui possède une vitesse de croissance plus importante que T. harzianum, cette inhibition n était pas marquée, toutefois, une lyse plus ou moins importante est observée au niveau des filaments mycéliens du Pythium spp. (Daami-Remadi, El Mahjoub, 2001). Des observations microscopiques réalisées au niveau du mycélium de F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici en présence de T. harzianum ont révélé la présence d une lyse importante et une transformation en cordons du mycélium du pathogène et ce comparativement au témoin non traité. Cela confirme les observations de la confrontation directe illustrées aux Figures 14 et 15. Ces résultats rejoignent ceux obtenus par Chérif et Benhamou (1990) qui ont signalé la présence d altérations avec une perte cytoplasmique du mycélium de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici suite à l action du T. harzianum, malgré l absence de contact direct entre les deux champignons. 82

106 IV-3- Effet de T. harzianum sur l incidence de la maladie : A- Résultat : Le repiquage des plants de tomate dans un mélange de perlite inoculée par le F. oxysporum f. sp. radicis- lycopersici et par le T. harzianum a engendré une faible attaque de ces derniers ; en effet l indice de mortalité, pour ces plants, n a pas dépassé 0,2 et le pourcentage des plants ayant une notation des symptômes supérieure ou égale à deux est nul. Cependant, pour les plants repiqués uniquement dans de la perlite inoculée par le pathogène, cette valeur (Deux) est observée sur au moins 66 % des plants des cultivars sensibles. Mieux encore, l observation de l état des plants repiqués dans le mélange de perlite inoculée par le pathogène et par l antagoniste, comparativement à ceux du témoin sain (non inoculé et non traité), montre que les plants traités par T. harzianum présentent un développement végétatif plus important (Figure 18.A et B). D A B Figure 18 : Comparaison entre une plante repiquée dans le mélange d inoculum (F.oxysporum f. sp. radicis-lycopersici + T. harzianum) (A) et une plante témoin saine (B). *D : Différance de développement entre les deux plants inoculés. De même, la comparaison du système racinaire des plants traités par l antagoniste et le pathogène à celui des plants témoins inoculés par le pathogène seul, montre une nette différence entre les deux (Figure 19). En effet, pour les plants traités avec le T. harzianum, le système racinaire se développe normalement et aucun brunissement ou pourriture ne sont observés. 83

107 Figure 19 : racines d une plante inoculées par Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici. B- Discussion : Les résultats obtenus montrent que l antagoniste utilisé dans ce travail (T. harzianum) joue un rôle très important dans l inhibition des parasites pathogènes (F.oxysporum f. sp.radicis-lycopersici) in vivo se qui indique que Trichoderma sécrète des substances dans le sol qui faiblesse la pathogénécité du parasite ou la stoppé définitivement et favorise la résistance des plante (Tomate). L effet bénéfique du T. harzianum a été signalé aussi par Sivan et al. (1987) qui ont montré que l enrobage des semences de tomate à l aide de cet antagoniste a réduit de 80 % l attaque de la fusariose des racines et du collet de la tomate. De plus l application de T. harzianum dans le substrat de culture réduit significativement l incidence de la maladie durant la saison de culture et par conséquent une augmentation significative (de 18,8 %) du rendement total est obtenue. Des résultats similaires ont été obtenus par Hjeljord et al. (2001), qui ont montré que l application des conidies quiescentes de T. harzianum sur les fleurs de fraisier permettait la réduction de plus de 85 % des attaques de Botrytis cinerea à une température de 24 C. Cet effet bénéfique est obtenu même en absence de tout agent pathogène. En effet, Windham et al. (1986) ont montré que l addition de T. harzianum et de T. koningii à un sol préalablement autoclavé a augmenté le pourcentage de germination des semences de tomate et du tabac en le comparant au témoin et que l application de ces deux espèces de Trichoderma au substrat de culture a amélioré le poids sec des racines ainsi que de la partie 84

108 aérienne de ces deux espèces qui représentait 213 % à 291 % de celui du témoin non traité. Dans ce même sens, Yedidia et al. (1999) ont rapporté que l application de T. harzianum à une culture hydroponique de melon a entraîné un meilleur développement des plants traités par rapport aux plants non traités par le Trichoderma. Cela s explique par une activation du système de défense de la plante, une augmentation de l activité chitinase et peroxidase et un accroissement de l activité enzymatique dans les feuilles induisant ainsi une résistance systémique chez ces plants. VI- Effet des molécules du Triazoles sur l inhibition du FORL : A- Résultats : Les triazoles sont connus pour leurs larges spectres d action vis-à-vis de nombreux champignons phytopathogènes. Dans cette étude nous avons testé in-vitro l efficacité de vingt molécules de triazoles sur la croissance d un isolat Fusarium oxysporum f sp radicis-lycopersici (F1). Lors de cet essai nous avons mesuré la croissance radiale. La sensibilité des résultats obtenus du test sont assez comparables. Les mesures de diamètre des colonies sont calculées après dix jours, et nous avons noté les résultats dans le Tableau 08. Tableau 08: la mesure du diamètre (cm) des colonies de l isolat F1 traité avec les vingt molécules Triazoles après 10 jours. Mol 11 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T-[C]/T)* 100% Mol 1 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T-[C]/T)* 100% [0] T ,26 [0] T ,9 [50] ,16 97,44 [50] ,9 0 [100] ,23 96,33 [100] ,9 0 [200] ,7 24,92 [200] ,9 0 [400] ,03 83,55 [400] ,1 22,87 85

109 Mol 12 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T-[C]/T)* 100% Mol2 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T[C]/T)* 100% [0] T ,55 [0] T ,9 [50] ,3 40,54 [50] ,9 0 [100] ,6 35,14 [100] ,9 0 [200] ,83 30,99 [200] ,9 0 [400] ,1-9,91 [400] ,6 3,8 Mol 13 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T-[C]/T)* 100% Mol 3 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T[C]/T)* 100% [0] T ,93 [0] T ,7 [50] ,7 89,90 [50] ,9-2,6 [100] ,57 [100] ,7 0 [200] ,8 1,83 73,59 [200] ,9-2,6 [400] ,9 72,58 [400] ,7 0 (T- (T[C]/T)* Mol 14 Test 1 Test 2 Test 3 Moy [C]/T)*100% Mol4 Test 1 Test 2 Test 3 Moy 100% [0] T [0] T ,9 [50] ,3-46,00 [50] ,3 20,25 [100] ,2-24,00 [100] ,9 0 [200] ,5-30,00 [200] ,9 0 [400] ,66-53,20 [400] ,03 11,01 (T-[C]/T)* (T[C]/T)* Mol 15 Test 1 Test 2 Test 3 Moy 100%100% Mol 5 Test 1 Test 2 Test 3 Moy 100% [0] T ,83 [0] T ,9 [50] 7,5 7,6 7,4 7,33 6,39 [50] ,7 2,53 [100] ,89 [100] ,9 0 [200] ,4 56,58 [200] ,9 12,66 [400] ,16 85,19 [400] ,9 0 (T- (T[C]/T)* Mol 16 Test 1 Test 2 Test 3 Moy [C]/T)*100% Mol 6 Test 1 Test 2 Test 3 Moy 100% [0] T ,6 [0] T ,9 [50] ,33 82,50 [50] ,9 0 [100] ,95 [100] ,9 0 [200] ,8 10,53 [200] ,9 0 [400] ,86-3,42 [400] ,9 0 86

110 Mol 17 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T-[C]/T)* 100% Mol 7 Test 1 Test 2 Test 3 Moy (T[C]/T)* 100% [0] T [0] T ,26 [50] ,00 [50] ,96 7,04 [100] ,00 [100] ,4 43;66 [200] ,56 29,62 [200] ,7 36,62 [400] ,53 42,66 [400] ,3 22,54 (T-[C] / T) (T[C]/T)* Mol 18 Test 1 Test 2 Test 3 Moy *100% Mol 8 Test 1 Test 2 Test 3 Moy 100% [0] T [0] T 6,4 4.7 / 5,5 [50] ,00 [50] / 1 81,67 [100] ,00 [100] 1,5 1,2 1,4 1,37 74,95 [200] ,8 13,92 [200] 1, ,2 78,04 [400] ,13 22,41 [400] ,23 59,35 (T-[C] / T) Mol 19 Test 1 Test 2 Test 3 Moy *100% Mol 09 Test 1 Test 2 Test 3 Moy [0] T [0] T ,36 [50] ,53-126,50 [50] ,16-33,9 [100] ,4-220,00 [100] ,46-88,98 [200] 3,1 3,2 3,3 3,2-60,00 [200] ,53-7,2 [400] ,1-5,00 [400] / 3,2-35,59 (T-[C]/T)* (T-[C]/T)* Mol 20 Test 1 Test 2 Test 3 Moy 100% Mol 10 Test 1 Test 2 Test 3 Moy 100% [0] T ,9 [0] T ,8 [50] 7,9 7,9 7,9 7,9-172,41 [50] ,93-7,22 [100] ,41 [100] ,43-20,56 [200] ,93-70,00 [200] ,7 5,56 [400] 7, ,41 [400] ,2 33,33 87

111 Nous avons remarqué d après les mesures de tableau précédent que pour la croissance radiale des colonies sont stoppé dès le premier jour avec les molécules Mol 11 et Mol 13 à 50 ppm et 100 ppm avec un diamètre de 0,1 à 0,2 cm et sont un peu stoppé avec les molécules : Mol 8 à 50 ppm, 100 ppm et 200 ppm ; Mol 10 à toutes les concentrations ; Mol 11 à 400 ppm ; Mol 13 à 100 ppm, 200 ppm et 400 ppm ; Mol 15 à 400 ppm et qui développent un mycélium de 1,0 à 1,6 cm (Graphe 07 et 08). Ces colonies sont moins développées avec une croissance très faible du mycélium de 2,1 jusqu à 2,7 cm avec les molécules : Mol 7 à 100 et 200 ppm, Mol 8 à 400 ppm, Mol 9 à 200 ppm, Mol 19 à 400 ppm (Graphe 06, 07 et 08). En outre, on remarque une croissance moyenne des colonies varies entre 3,2 et 3,6 cm jusqu à 3,8 cm avec l utilisation des même molécules mais avec des concentrations différentes que précédentes tel que la Mol 7 et Mol 9 à 400 ppm ; Mol 9 et Mol 15 à 200 ppm et Mol 12 à toute les concentrations utilisées (Graphe 09 et 10). Finalement nos molécules utilisées dans ce travail n ont pas pues être efficaces dans l inhibition de notre isolats de FORL dans certains concentrations tel que Mol 11 à 200 ppm, Mol 12 à 400 ppm, Mol 15 à 50 et 100 ppm, Mol 16 à 100, 200 et 400 ppm (Graphe 08, 09 et 10) et enfin Mol 14, 17,18 et 20 à toute les concentrations (Graphe 07, 08, 09 et 10 ). Nous avons utilisé l acétone comme témoin [0] dans les vingt molécules et nous avons calculé le diamètre des colonies après dix jours de croissance, les résultats sont d écrit dans le tableau 06 et montré dans la Graphe 06. On constate que même avec le témoin il y a un effet positif sur la croissance mycélienne de notre isolat (F1). Ce que veux dire que l acétone joue un rôle positif dans l inhibition du FORL. Mol 9, Mol 10, Mol 19 et Mol 20 avec l utilisation du l acétone ont stoppé la croissance mycélienne du F1 avec un diamètre de croissance de 1,8 jusqu à 2,9 cm (Graphe 06). Grâce aux résultats précédentes, nous avons pu calculer le Taux d inhibition (Le calcul du Taux d inhibition est mentionné dans la partie matériel et méthodes), à la même concentration 50 ppm nous avons noté que le Taux d inhibition égale 97,44 % chez l isolat F1 traité avec la molécule Mol 11et 87,9 % avec la Mol 13. Après le calcul du taux d inhibition nous avons procédé à la détermination de la dose d inhibition 50% de la sensibilité de notre isolat aux vingt molécules testées, les doses d inhibition ont été calculées comme suit, pour chaque concentration, les pourcentages d'inhibition ont été transformés 88

112 en probits (Finney 1971). Les doses de vingt molécules ont été transformées en logarithmes. Un graphique a été tracé avec les doses (log sur l'axe des abscisses et les inhibitions (probits) sur l'axe des ordonnées. L'équation de la droite de régression déterminée par les points a permis de calculer les doses correspondant à 50% d'inhibition (exprimées en logarithmes). Leurs antilogarithmes sont les CMI50 en parties par million, les résultats de la CMI50 sont exprimés en microgramme par millilitre (µg/ml). Les résultats des CMI50 des vingt molécules sur milieu PDA solide sont représentés sous forme de graphes (1, 2,3) et (3, 4,5). Tableau 09 : Détermination de la CMI50 Molécules CMI 50 Molécules CMI 50 Mol 1 4,11 Mol 11 2,83 Mol 2 15,24 Mol 12 1,64 Mol 3 31,85 Mol 13 3,58 Mol 4 - Mol 14 - Mol 5 29,58 Mol 15 2,28 Mol 6 - Mol 16 - Mol 7 3,37 Mol 17 2,76 Mol 8 0,58 Mol 18 3,67 Mol 9 - Mol 19 - Mol 10 3,11 Mol : On n a pas pus calculé CMI 50. B- Discussion : D une manière générale, toutes les molécules testées pour leur action antifongique, ont montré que pour certaines molécules à faible concentration ont stoppé la croissance mycélienne sur milieu PDA solide dès le 1 er jour. Ces résultats nous ont permis de déterminé la Concentration Inhibitrice Minimale de 50 % (CMI50), où nous avons enregistré que la CMI 50 varie entre 2,89 et 2,28 µg/ml et pour certaines substances nous n avons pas pu déterminer la CMI 50 parce que le Taux d inhibition est supérieur de 50%, mais nous avons noté pour certaines substances que la CMI 50était très faible égale 0,58µg/ml. 89

113 I % Alors que d autres travaux menés in-vitro par Capilla et al, 2001 ont évalué l activité de nouvelles substances de triazoles par la méthode de microdillution vis-à-vis de Fusarium solani et Scytalidium que la CI90 égale 0,125 µg/ml ; par contre Paphitou et al, 2002 ont montré que les triazoles ont une forte activité contre 18 souches de Fusarium solani et 4 souches de Fusarium oxysporum CMI 50>64 µg/ml. Espine, 2001 cinq souches d Aspergillus et deux souches de Fusarium CMI 50>0.8µg/ml et Greer, 2003 Aspergillus et Candida (CMI 504 µg/ml). D autres travaux de Arikan et al, 2001 ont évalué la CMI 50de triazoles entre 0,5-0,63µg/ml contre cinq souches d Aspergillus et 02 souches de Fusarium; Diekema et al, 2003, CI95 égale à 1 µ g/ml vis-à-vis d Aspergillus et Fusarium. Les études menées in vivo par Molina et al, 2000, sur nouvelles substances de triazoles contre Trypanosoma cruzi parasite responsable de la maladie Chagas. Paniagua et al, 2002 ont évalué l effet de Triazole vis-à-vis de quatre-vingts de Candida albucans, ( µg/ml) y = -37,42x + 155,9 R² = 0,181 Mol ,5 1 1,5 2 2,5 3 Log concentration Graphe 01 : Evaluation du taux d inhibition de la molécule Mol 13 sur la croissance mycélienne de l isolat F1 sur milieu solide. 90

114 I % I % y = 96,68x - 170,8 R² = 0, Mol ,5 1 1,5 2 2,5 3 Log concentration Graphe 02 : Evaluation du taux d inhibition de la molécule Mol 15 sur la croissance mycélienne de l isolat F1 sur milieu solide ,5 1 1,5 2 2,5 3 Log concentration y = 3,034x + 48,24 R² = 0,001 Mol 8 Graphe 03 : Evaluation du taux d inhibition de la molécule Mol 08 sur la croissance mycélienne de l isolat F1 sur milieu solide. 91

115 I % I % y = -9,865x + 28,78 R² = 0, Mol Log concentration Graphe 04 : Evaluation du taux d inhibition de la molécule Mol 4 sur la croissance mycélienne de l isolat F1 sur milieu solide. 0-0, ,5 1 1,5 2 2,5 3 y = 1,662x - 4,832 R² = 0,223-1,5-2 Mol 3-2,5-3 Log de concentration Graphe 05 : Evaluation du taux d inhibition de la molécule Mol 3 sur la croissance mycélienne de l isolat F1 sur milieu solide ,9 7,9 7,7 7,9 7,9 7,9 6,93 6,26 5,5 5,55 4,26 2,36 1,8 5 7,83 7,6 7,9 7,9 2 2,9 [0] Graphe 06 : l effet de l acétone sur l isolat de FORL (F1) 92

116 ,9 7,9 7,9 7,7 7,9 6,3 3,96 1 7,9 7,9 7,9 7,37,33 4,53 3,16 3,3 1,93 1,33 0,16 0,7 [50] Graphe 07 : l effet des vingt molécules à 50 ppm sur l isolat de FORL (F1) ,9 7,9 7,7 7,9 7,9 7,9 2,4 1,37 4,46 1,43 0,23 3,6 1 7,9 7,9 7,9 7,9 7,9 6,2 6,4 [100] Graphe 08: l effet des vingt molécules à 100 ppm sur l isolat de FORL (F1) ,9 7,9 7,9 7,9 7,9 6,9 2,7 2,53 1,7 1,2 6,5 6,8 6,8 5,56 5,6 4,7 4,93 3,83 3,4 1,83 [200] Graphe 09 : l effet des vingt molécules à 200 ppm sur l isolat de FORL (F1) 93

117 Mol 1 Mol2 Mol 3 Mol4 Mol 5 Mol 6 Mol 7 Mol 8 Mol 9 Mol Mol Mol Mol Mol Mol Mol Mol Mol Mol Mol ,1 7,6 7,7 7,03 7,9 7,9 3,3 3,2 2,23 1,21,03 6,1 1,9 7,66 1,16 7,86 4,53 6,13 2,1 7,9 [400] Graphe 10 : l effet des vingt molécules à 400 ppm sur l isolat de FORL (F1) T [50] [100] [200] [400] Molécule 15 Figure19.A : Effet inhibiteur des molécules de triazole Mol 15 sur la croissance mycélienne de la souche F1. 94

118 T [50] [100] [200] [400] Figure19.B : Effet inhibiteur des molécules de triazole Mol 11sur la croissance mycélienne de la souche F1. T [50] [100] [200] [400] Figure19.C : Effet inhibiteur des molécules de triazole Mol 10 sur la croissance mycélienne de la souche F1. 95

119 T [50] [100] [200] [400] Figure19.C : Effet inhibiteur des molécules de triazole Mol 03 sur la croissance mycélienne de la souche F1. T [50] [100] [200] [400] Figure19.E : Effet inhibiteur des molécules de triazole Mol 08 sur la croissance mycélienne de la souche F1. 96

120 VIII- Techniques d étude du polymorphisme enzymatique : A- Résultats : 1- Les estérases : L étude des zymogrammes des cultures âgées de 10 jours et incubées sur le milieu PDA liquide nous a permis de noter des différences dans les résultats relevés. Des résultats différents et plus marqués cette fois-ci sont obtenus à partir des extraits de culture incubées sur milieu liquide. Cette étude, nous a montre que les isolats FORL se sont distingué des isolats par une bande et avec une intensité de coloration, d autre part les bandes sont épaisses et clair La planche (02). Les résultats des huit isolats ont permis la révélation de trois bandes chez les isolats de FONP et deux bandes chez les isolats de FORL. La position de deux bandes révélée est identique chez les huit isolats, de même que pour leur épaisseur et l intensité de leur couleur. 2- Les phosphatases acides : L étude des zymogrammes d estérases (Planche 01) nous permet dans ce cas aussi de signaler l absence de différence entre les isolats FORL et les isolats FONP. Les extraits de cultures des l isolat a permis la révélation d une bande présentant la même vitesse de migration, est identique pour les huit isolats (FORL et FONP). L épaisseur de la bande est intense de coloration est semblable chez les huit isolats. pour les huit isolats (FORL et FONP). L épaisseur de la bande est intense de coloration est semblable chez les huit isolats. 97

121 Planche 01 : profil éléctrophorétiques des Phosphatase acide Planche 02 : profil électrophorétique des Estérase 98

122 B- Discussion : Parmi les systèmes de révélation étudiés, les estérases nous ont permis de mettre en évidence des différences entre les huit isolats par contre le système phosphatase acide nous a rien ramené comme différence. Pour la comparaison des huit isolats, nous n avons utilisé qu un seul milieu pour toutes nos cultures le milieu PDA liquide. La caractérisation génétique par la technique d électrophorèse des huit isolats qu on a montre qu il y a une différance entre ces derniers par leur pois moléculaire et leur vitesse de migration, ce qui veut dire qu on a plus d une seul espèce étudié. Cette classification est basée sur un système enzymatique qui est souvent employée (Branchard, 1984; Morrison et al, 1989 ; Labdi, 1990 ; El Biari, 1995 ; Henni, 1996 ; Benfriha, 1998). Néanmoins, elle doit être suivie par des études complémentaires utilisant d'autres systèmes enzymatiques. Généralement les auteurs utilisent plus d'une dizaine de marqueurs, parmi lesquels seuls quelques-uns mettent en évidence un polymorphisme entre les souches fongiques étudiées. VIII- La compatibilité végétative : A- Résultats : VIII- 1- Isolement des mutants Nit: Le repiquage des souches de FORL sur un milieu minimum (MMC) a donné lieu à des colonies minces, rasantes et à croissance restreinte au niveau du mycélium périphérique de deus isolats qui se traduit par des secteurs résistants au chlorate (Figure 20.A). Mais d autre souches montre un mycélium aérien, condensé et cotonneux ce qui indique que ces dernier ont une forme de résistance (Figure 20.B). 99

123 VIII- 2- Obtention des mutants : Les mutants, résistants au chlorate, obtenus sont incapable d'utiliser les nitrates comme source d'azote et présentent par conséquent un mycélium fin, rasant, transparent et à croissance rapide (Figure 21.A et B). Trois types de mutants ont été obtenus à savoir le Nit1, Nit3 et le Nit M. Les trois types de mutants ont pu être caractérisés pour deus isolats sur les huit testés. Chlorate Figure 20.A : F8 sur milieu chlorate. Figure 20.B : F7 sur milieu chlorate 100

124 F F 8-Nit 1 Figure 21. Figure 21. B : F8 Nit M ET Nit 3 101

125 Tableau 10 : Identification des mutants nits par leurs croissances sur les milieux de caractérisations. Croissance des isolats sur les différents milieux de sélections Isolats Milieu chlorate Milieu nitrate Milieu nitrite Milieu hypoxantine F F F3 + r r r F F F F7 + r r r F : présence de zone de mutation (résistance au chlorate). - : Absence de zones de mutation. r : thalle ras sans mycélium aérien. VIII- 3-Test de compatibilité végétative: L appariement dans toutes les combinaisons possibles entre les Nit M et les Nit1 et/ou Nit3 des deus isolats ont été réalisés. B- Discussion : L appariement dans toutes les combinaisons possibles entre les NitM et les Nit1 et/ou Nit3 des deux isolats ont été réalisés. Les résultats obtenus montrent que tous les mutants Nit1 et/ou Nit 3 confrontés avec le Nit M des deus clones FORL ont donné des réactions négatives se traduisant par aucune formation d hétérocaryon (Figure 22). 102

126 1 Figure 22 : Résultats de complémentation entre deux mutants de FORL de clones différents sur milieu nitrate (MM). Les mutants sont végétativement incompatibles lorsqu'il n'y a pas d'appariement entre eux à savoir l'absence du mycélium hétérocaryotique. Les différents mutants Nit1 et Nit3 sont incompatible entre eux, il est de même pour le mutant NitM. Des résultats analogues ont été obtenus avec F. oxysporum f. sp. vasinfectum (Katan et al., 1988) avec F. oxysporum f.sp. melonis (Jacobson et Gordon, 1988). Ces résultats laissent penser que la compatibilité végétative peut être le moyen d'identifier une forme spécialisée de F. oxysporum par rapport à une autre ou par rapport à une forme saprophyte du sol (Tantaoui et Boisson, 1991). Dans cette étude, on ne peut pas déterminer aucun groupe de compatibilité végétative (VCG), à raison que notre isolats sont auto-imcompatibles et incompatible entre eux. Khelafi et Fergani, 1990, ont pu classer les souches pathogènes et saporphytes de Fusarium oxysporum dans 3 différents groupes de compatibilité végétative; un groupe comportant toutes les 103

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