LE TEST D IMMUNODIFFUSION OU TEST D OUCHTERLONY : RECHERCHE D UN ANTIGÈNE VERSION «PRODUITS DE SUBSTITUTION»

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1 Fiche sujet - élève A des fins expérimentales, des lapins reçoivent par injections un antigène. Ils produisent alors des anticorps spécifiques contenus dans leur sérum et qui peuvent être mis en évidence par la méthode d Ouchterlony. On cherche à identifier l antigène injecté à un lapin. Matériel - deux petites botes de Petri contenant du gel d agar (dont une pour s exercer) ; éventuellement un gabarit de perçage ; - un tube emporte-pièce et un cure dent + une aiguille lancéolée + un marqueur (pour marquer la boîte de Petri) ; - sérum de lapin (= S) contenant des anticorps dirigés contre un antigène inconnu ; - eau distillée (= E) et 4 solutions d antigènes protéiques : pancréatine = P caséine = C hémoglobine = H albumine de sérum de bœuf (BSA) = B - un compte-goutte pour chaque produit, des gants. Remarque : les produits proposés pour la manipulation à réaliser sont des produits de substitution mimant les réactions réelles. Activités et conditions des activités Capacités et principaux critères d'évaluation Barème - Après lecture du protocole fourni, choisir la disposition des produits dans la boîte de Petri et l indiquer sur le schéma de la fiche réponse. Justifier ce choix. Appeler l examinateur pour vérifier et pour obtenir éventuellement un document de secours Adopter une démarche explicative 3 - Réaliser le protocole en utilisant les indications de la fiche technique. Appeler l examinateur pour obtenir la boîte ou la fiche de résultats 3- Représenter sur la fiche réponse les résultats de la boîte fournie en réalisant un schéma sur le modèle du précédent. Schématiser les associations moléculaires que révèle un arc de précipitation. Respecter les modèles proposés dans la fiche document. Réaliser une manipulation d après un protocole respect des étapes du protocole utilisation maîtrisée du matériel organisation et rangement de la paillasse Traduire des informations par des schémas A partir des résultats fournis, déterminer quel est l antigène injecté au lapin. Justifier votre réponse. Adopter une démarche explicative

2 Fiche technique - élève Principe de la méthode d Ouchterlony C est l immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s il n y a pas de réaction entre les deux solutions. En revanche, elle se traduit par un arc de précipitation visible à l œil nu lorsque les deux solutions réagissent. NB : le temps de réaction avec les produits véritables est de l ordre de 4h ; vous manipulez ici sur des produits de substitution mimant les réactions réelles mais permettant une lecture des résultats au bout de 40 min, permettant l évaluation de votre manipulation. Protocole technique - Creuser les puits nécessaires dans la gélose de la boîte de Petri Au fond de la boîte de Petri est coulé un gel d agar. Utiliser le gabarit ci-contre (ou celui fourni) pour répartir les puits nécessaires. S exercer avec la boîte d apprentissage pour creuser les puits avec l emporte-pièce. Utiliser le cure dent pour éliminer les disques de gélose si nécessaire.. Marquer sur la boîte de Petri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l anticorps étudié avec les différents antigènes proposés. 3. Remplir les puits Le produit prélevé dans un tube avec un compte goutte propre doit être déposé dans le puits approprié sans débordement ni bulles et sans endommager le gel d agar. S exercer avec la boîte d apprentissage et de l eau distillée. 4. Observer les résultats fournis sur fond noir et en éclairage rasant. Gabarit de perçage

3 Fiche réponse élève ETABLISSEMENT : Classe : Nom : Prénom : Schéma à compléter Modèles moléculaires pour la schématisation Antigène Anticorps A rendre à l issue de l épreuve

4 Fiche laboratoire MATERIEL NECESSAIRE - boîtes de Petri (verre ou plastique) de diamètre 5à 6cm (par élève boîtes TP et boîte résultat éventuellement remplacée par la fiche de résultats) ; - gabarit de perçage des puits : certains lycées utilisent comme gabarit de perçage des couvercles de boîtes de Petri percés de trous ; les fournir alors à l élève ; - Agar en poudre (g pour 0 boîtes) ; - eau distillée (00mL pour 0 boîtes) ; - emporte pièce (pipette ou tube en verre de diamètre 6mm) ; certains lycées utilisent des tubes munis de poires d aspiration, les fournir alors à l élève ; - aiguille lancéolée et cure-dent ; - compte-gouttes (un par produit) ; gants. Produits de substitution tous incolores (présentent le double avantage d un coût minime et d une lecture rapide du résultat) : - eau distillée mimant les solutions «E», «P», «C», «H» ; - solution de soude (Na + + OH - ) à 0. mol.l - mimant le sérum «S» ; - solution de sulfate de Zinc (Zn + + SO 4 - ) à 0. mol.l - mimant l antigène BSA «B». Un arc identique à la formation d un complexe anticorps-antigène se forme entre la soude et le sulfate de zinc au bout de 40min. Il est stable durant trois heures. L élève devra analyser un résultat fourni mais son résultat devra être contrôlé dès la fin du TP. PREPARATION DES BOITES DE GEL D AGAR Les boîtes peuvent être coulées quelques jours avant le TP : - dissoudre g d' Agar pour 00mL d'eau distillée ; porter à ébullition en remuant constamment puis arrêter le chauffage ; - laisser refroidir jusqu à pouvoir saisir le flacon sans se brûler (environ 60 C) ; - couler le gel d agar obtenu dans les boîtes de Petri, sur une épaisseur d'environ,5 mm, ce qui représente environ 4,5mL par boîte ; - laisser refroidir sur une surface horizontale ; - conserver les boîtes de Petri, au réfrigérateur, dans une boîte fermée hermétiquement et tapissée de papier absorbant humide pour réaliser une atmosphère saturée d humidité.

5 Fiche document secours élève BOITE PRESENTANT LA DISPOSITION DES PRODUITS DANS LES PUITS

6 Fiche résultats élève BOITE DE RÉSULTATS PRESENTEE SUR FOND NOIR ET ÉCLAIRAGE RASANT Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus dans les mêmes conditions expérimentales avec les produits réels : sérum de lapin immunisé et solutions antigéniques.

7 Fiche barème d'évaluation Capacités et critères d évaluation (en gras, évaluation pendant de la séance) Barème Noms des élèves - Adopter une démarche explicative - puits central avec sérum lapin ; puits périphériques contenant chacun un antigène ou l eau distillée - justification : possibilité de rencontre entre les anticorps du sérum central et tous les antigènes périphériques* * fournir un document de secours à l élève qui ne franchit pas cette étape. - Réaliser une manipulation d après un protocole - réalisation soignée des 6 puits - marquage efficace des puits sur la boîte - utilisation judicieuse du matériel : compte-goutte par produit dépôts soignés dépôt des produits conforme au marquage vérifiable lors de la manipulation et/ou au vu des résultats - organisation et rangement de la paillasse 3- Représenter une observation par un schéma - conformité avec la boîte de résultats fournie - schéma représentant un complexe antigène -anticorps ; conformité au modèle ; titre pertinent et adapté, travail soigné. 4- Adopter une démarche explicative pour répondre au problème posé - l antigène injecté au lapin est la BSA - justification : arc de précipitation entre le sérum et le puits contenant la BSA, spécificité antigène anticorps. 4 Note / 0

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