Techniques au quotidien. Reçu le 23 février 2004 ; reçu en forme révisée le 20 avril 2004 ; accepté le 30 juin 2004

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1 Immuno-analyse & Biologie spécialisée 19 (2004) Techniques au quotidien Apport des examens sérologiques au diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde : les leçons du suivi de 270 malades pendant trois ans Serological tests are instrumental in the diagnosis of rheumatoid arthritis: lessons from a three-year follow-up of 270 patients P. Youinou a, *, Y. Renaudineau a, V. Devauchelle-Pensec b, A. Saraux b a Laboratoire d immunologie, CHU, BP 824, Brest cedex, France b Service de rhumatologie, CHU, BP 824, Brest cedex, France Reçu le 23 février 2004 ; reçu en forme révisée le 20 avril 2004 ; accepté le 30 juin 2004 Disponible sur internet le 25 septembre 2004 Résumé Le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde (PR) repose sur un faisceau d arguments. Les tests biologiques doivent donc être simples et spécifiques, surtout quand il s agit de reconnaître une PR devant une polyarthrite débutante. Dans ce cas, les anticorps les plus spécifiques sont dirigés contre des séquences citrullinées sur la filaggrine, la kératine et la fibrine et contre les peptides citrullinés et cyclisés (CCP). On dépiste des anticorps anti-ccp au début de la maladie mais la sensibilité du test est médiocre (50 %). Combiner facteur rhumatoïde (FR) et anticorps anti-ccp améliore les valeurs prédictives positives (91 %) et négatives (78 %) de la sérologie pour la PR. Des anticorps antinucléaires existent aussi chez 40 à 50 % de ces patients et il arrive qu ils reconnaissent l ADN natif ou les antigènes nucléaires solubles. Au total, associer anti-ccp et FR facilite le diagnostic de PR débutante Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract The diagnosis of rheumatoid arthritis (RA) is based on a cluster of arguments. Biological tests are, therefore, selected to be as simple as specific, notably to identify RA when facing an early arthritis. Antibodies specific for RA are directed against citrullinated sequences present in filaggrin, keratin, fibrin and cyclic citrullinated peptides (CCP). Anti-CCP antibodies appear at the onset of the disease but the sensitivity of such a test is moderate (50%). Combining rheumatoid factor (RF) with anti-ccp antibodies improves the positive (91%) and negative predictive values (78%) of serology for RA. Antinuclear antibodies also exist in 40 50% of these patients, some being specific for native DNA, others for soluble nuclear antigens. On the whole, anti-ccp antibodies associated with RF render less difficult the early diagnosis of RA Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Polyarthrite rhumatoïde ; Anticorps anti-ccp ; Facteur rhumatoïde ; Anticorps antinucléaire Keywords: Rheumatoid arthritis; Anti-CCP antibodies; Rheumatoid factor; Antinuclear antibody La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une redoutable entité, parce que sa fréquence est élevée, que son diagnostic prête à confusion et que, si on ne la prévient pas, son évolution condamne le malade à l impotence au bout de quelques * Auteur correspondant. Adresse youinou@univ-brest.fr (P. Youinou). années. Un kaléidoscope en balaie les aspects essentiels (Fig. 1) : les articulations sont déformées par des tuméfactions ; les épiphyses qui les constituent, parsemées de géodes ; les synoviales qui les encapuchonnent, bondées de lymphocytes ; et les anomalies sérologiques qui en résultent, tellement nombreuses que le laboratoire joue un rôle décisif quand il s agit d en poser le diagnostic. Il est encore plus /$ - see front matter 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi: /j.immbio

2 P. Youinou et al. / Immuno-analyse & Biologie spécialisée 19 (2004) Fig. 1. En procédant dans le sens des aiguilles d une montre à parti de midi, la polyarthrite rhumatoïde provoque une inflammation des articulations distales, creuse de géodes les épiphyses osseuses (flèches), infiltre la synoviale de lymphocytes (flèche) et suscite une efflorescence d autoanticorps. important d y consentir tous les efforts, depuis la consécration de médicaments récents, comme le méthotrexate, et l avènement de nouveaux agents, comme ceux qui s opposent au TNFa. Il est conseillé de traiter le patient le plus tôt possible, il est donc avisé d identifier son affection le plus rapidement possible. 1. Les facteurs rhumatoïdes Les facteurs rhumatoïdes (FR) sont des autoanticorps dirigés contre le Fc des IgG de l homme ou contre celui des IgG des autres espèces que l homme. Elles sont représentées ici par le lapin [6]. Les FR historiques sont des IgM pentamériques qui agglutinent les particules sur lesquelles ont été fixées les IgG qui leur servent de cibles (Fig. 2) : IgG de l homme quand c est le test du latex qui les met en évidence, IgG de lapin quand c est la réaction de Waaler-Rose. La première technique est parfois remplacée par la néphélémétrie, la seconde souvent complétée par des Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays (Elisa). Ces derniers permettent de détecter, non seulement les IgM pentamériques dotées d une activité FR, mais également les IgM monomériques, les IgG et les IgA dirigées contre les IgG de lapin. En regroupant les résultats disponibles dans la littérature ancienne (Tableau 1), on estime que des FR antihomme apparaissent dans 76 pour cent des cas de PR et les FR antilapin dans 64 pour cent des cas. Mais, la durée d évolution au terme de laquelle sont dépistés ces FR n est pas précisée. De plus, on les retrouve dans les maladies de système, en particulier dans le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS), dans les infections, notamment dans l endocardite d Osler et dans des états pathologiques variés, par exemple dans la cirrhose éthylique. Notons au passage que la spécificité des FR antilapin pour la PR est meilleure que celle des FR antihomme. Dans le contexte de la PR, les FR de classe IgG font craindre le développement d une vascularite et les FR de classe IgA dénoncent l existence d un SGS secondaire. Fig. 2. Le test du latex et la réaction de Waaler-Rose mettent en évidence des facteurs rhumatoïdes agglutinant des IgG d homme dans le premier cas, des IgG de lapin dans le second. Les Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays (Elisa) où l anticorps révélateur est conjuguée à une enzyme (E) détectent ceux qui ne sont pas agglutinants.

3 308 P. Youinou et al. / Immuno-analyse & Biologie spécialisée 19 (2004) Tableau 1 Prévalence des facteurs rhumatoïdes (pourcentage des positifs) Anti-IgG humaines Anti-IgG de lapin Polyarthrite rhumatoïde Syndrome de Gougerot-Sjögren Lupus érythémateux disséminé Maladie de Still 10 5 Endocardite d Osler Hépatite virale Viroses bénignes Cirrhose éthylique Leucémie lymphoïde chronique Asthme 17 0 Témoins normaux Les anticorps antinucléaires L étude des anticorps antinucléaires (AAN) commence évidemment par un dépistage. La technique est l immunofluorescence indirecte (IFI), non plus sur des coupes de foie ou de rein de souris ou de rat, mais sur des frottis de cellules provenant de lignées -habituellement on choisit des cellules HEp-2. Si, comme tout à l heure, on fait la moyenne de tous les résultats qui sont disponibles dans la littérature (Fig. 3), en regroupant d un côté les malades souffrant d un lupus érythémateux disséminé (LED) pour servir de témoins positifs, et les sérums normaux pour servir de témoins négatifs de l autre, on s aperçoit que la recherche d AAN est positive dans 40 à 50 pour cent des cas de PR, 50 à 75 pour cent des cas de sclérodermie systémiques (SS), 50 à 60 pour cent des cas de SGS et 24 à 74 pour cent des cas de dermatopolymyosite. L opérateur passe alors à l étape suivante : identifier les cibles de ces AAN. Il peut s agir, parmi les antigènes nucléaires insolubles, de l ADN natif des anticorps du LED. Ces anticorps sont trouvés plus volontiers par un Elisa que par le test de Farr qui est assez spécifique ou par Fig. 3. Anticorps anti-nucléaires dépistés par immunofluorescence indirecte sur des coupes de foie de rat ou sur des frottis de cellules en lignée dans le lupus érythémateux disséminé (LED), la polyarthrite rhumatoïde (PR), la sclérodermie systémique (SS), le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) et la dermatopolymysite (DM-PM). Les chiffres inscrits dans les colonnes sont les pourcentages de sérums positifs. Tableau 2 Fréquences des anticorps antiribonucléoprotéines dépistés par les techniques classiques (immunodiffusion radiale et Elisa) l examen sur Crithidia luciliae qui est peu sensible. On les rencontre chez 10 à 20 pour cent des malades présentant une PR débutante. D autres AAN se fixent sur des antigènes nucléaires solubles [1], comme les ribonucléoprotéines (RNP). Ces anticorps anti-rnp ne sont pas l apanage de la connectivite mixte (CM) comme on l a initialement pensé, puisqu on les signale également (Tableau 2) dans 39 % des cas de LED, 12 pour cent des cas de SS, cinq pour cent des cas de SGS et trois pour cent des cas de PR. Le rhumatisme inflammatoire de ces malades qui consultent pour la première fois ne peut donc être attribué ni à un LED au prétexte qu il y a des anticorps anti-adn natif, ni à une CM à cause de la présence des anticorps anti-rnp. Cela va de soi, le diagnostic de PR ne peut pas être écarté sur de tels arguments. 3. Les anticorps antifilaggrine Nombre de positifs/ nombre de testés Connectivite mixte 219/ Polyarthrite rhumatoïde 11/323 3 Lupus érythémateux disséminé 205/ Sclérodermie systémique 13/ Syndrome de Gougerot-Sjögren 3/101 3 Témoins normaux 0/437 0 Pourcentage de positifs L histoire des anticorps antifilaggrine (AAF) s est déroulée pendant deux décennies. La vedette de cette saga est successivement revenue aux anticorps «antipérinucléaires» (APN), aux anticorps «antikératine» (AAK), aux AAF et aux anticorps anti-citrullinated Cyclised Proteins (CCP). En quête d un substrat commode pour dépister les AAN par IFI, des chercheurs hollandais ont prélevé des cellules buccales en grattant la face interne de la joue de leurs laborantines à l aide d un abaisse-langue. Ils se sont aperçus que beaucoup des sérums qui provenaient de malades souffrant d une PR contenaient des IgG qui se fixaient sur des granules kératohyalines entourant le noyau des cellules buccales. Ces nouveaux autoanticorps, baptisés APN, ont depuis été décrits dans 65 à 75 pour cent des cas de PR, chez cinq à dix pour cent des témoins malades et chez trois à cinq pour cent des témoins normaux. Quelques années plus tard, une équipe anglaise a remarqué, qu une partie de ces sérums reconnaissent des structures empilées sur la muqueuse de l œsophage du rat dont les coupes étaient examinées par IFI. Faute de mieux, les AAK étaient intronisés par cette caractéristique visuelle. Ces autoanticorps-là, on les relevait chez 864 des 1741 malades atteints de PR (50 pour cent), chez 57 des 1189 témoins malades (5 pour cent) et chez 12 des 859 témoins sains (1 pour cent). Ce qui leur conférait une sensibilité oscillant de 43 à 58 pour cent et une spécificité oscillant

4 P. Youinou et al. / Immuno-analyse & Biologie spécialisée 19 (2004) Fig. 4. Un anticorps monoclonal dirigé contre la profilaggrine (flèche) et conjugué à la rhodamine se fixe sur les mêmes granules kératohyalins (flèches) qu un facteur antipérinucléaire (flèches) révélé par un anticorps conjugué à la fluorescéine. de 88 à 100 pour cent, selon les séries. On a initialement pensé que ces anticorps étaient suscités par de la kératine, mais toutes les études conçues pour tester cette hypothèse ont donné des résultats négatifs. Si ce n était pas la kératine, ce ne pouvait être que l une des protéines associées à la kératine. La filaggrine en est une, qui émane de la profillagrine et, comme son nom l indique, agrège les filaments du cytosquelette dont la kératine n est qu un cas particulier. De fait (Fig. 4), les APN conjugués à la fluorescéine et les anticorps monoclonaux antiprofilaggrine conjugués à la rhodamine s attachent aux mêmes granules kératohyalins dans les cellules buccales. Bref, les uns et les autres reconnaissent la filaggrine et les autoanticorps sont des AAF. Tout le mérite de cette découverte revient à l équipe dirigée par Guy Serre à Toulouse [4]. Il s est ensuite avéré que ces autoanticorps étaient dirigés contre certaines séquences de filaggrine à la condition que leurs arginines aient été déiminées en citrullines. Bien sûr, c est par le plus grand des hasards que la molécule qui avait exposé ces séquences citrullinées aux sérums des malades était la filaggrine. Celle-ci abonde dans les cellules buccales qui desquament et à la surface de la muqueuse œsophagienne, mais il n y a pas de filaggrine dans la synoviale fût-elle rhumatoïde. Des séquences de ce type existent dans n importe quelle protéine, en particulier dans la fibrine qui infiltre la synoviale rhumatoïde. Il est intéressant que la maladie soit associée à certains des allèles de la peptidyl-arginine déiminase qui est l enzyme déiminant l arginine en citrulline (on le sait depuis la fin de 2003!) Deux versions de l Elisa mis au point à partir de peptides synthétiques [5] sont disponibles dans le commerce. Les anticorps anti-ccp sont dépistés dans 68 pour cent des cas de RP et dans deux à six pour cent des cas de maladies systémiques autres que la PR. 4. En pratique Nous avons souhaité mettre ces notions à l épreuve de 1995 à 1997 en recrutant 270 nouveaux malades dont la polyarthrite ne pouvait pas encore être baptisée rhumatoïde [2]. Outre l examen clinique et le bilan radiologique dont ils ont bénéficié, toute la batterie de tests sérologiques leur a été appliquée, incluent FR, AAN, APN, AAK et anticorps anti- CCP. Les malades ont été revus tous les six mois pendant Tableau 3 Diagnostics de 270 malades ayant consulté pour la première fois pour une polyarthrite inflammatoire puis suivis tous les six mois pendant trois ans Polyarthrite rhumatoïde 98 (36 %) Spondylarthrite ankylosante 56 Chondrocalcinose articulaire 7 Syndrome de Gougerot-Sjögren 6 (41 %) Lupus érythémateux disséminé 5 Divers 37 Diagnostic non précisé 61 (23 %)

5 310 P. Youinou et al. / Immuno-analyse & Biologie spécialisée 19 (2004) Tableau 4 Performances des principaux tests biologiques pour la PR devant un rhumatisme inflammatoire débutant Sensibilité Spécificité Valeur prédictive positive Valeur prédictive négative Test du latex FR IgM par Elisa FR IgG par Elisa FR IgA par Elisa Anticorps antinucléaires Antipérinucléaires Antikératine Antin-CCP (1 er génération) trois ans et le jugement rendu par un collège de cinq rhumatologues au terme de cette évolution (Tableau 3). Que s est-il passé? Dans 36 pour cent des cas, il s agissait d une PR, mais dans les 41 autres c était un autre rhumatisme inflammatoire comme la spondylarthrite ankylosante, le SGS, le LED et la chondrocalcinose articulaire. Il restait 61 patients (23 pour cent) pour qui aucun diagnostic ne pouvait être retenu. Sur le plan sérologique (Tableau 4), les FR de classe IgM offraient une honorable sensibilité de 65 pour cent quand ils étaient détectés par un Elisa artisanal, et les anticorps anti-ccp une remarquable spécificité de 93 pour cent, alors qu ils étaient mis en évidence par un Elisa de première génération. Il faut néanmoins reconnaître que la valeur prédictive positive (les vrais positifs parmi les positifs) et la valeur prédictive négative (les vrais négatifs parmi les négatifs) de l antique test du latex frisent la perfection. Fig. 5. Sensibilité et spécificité pour la polyarthrite rhumatoïde du test de deuxième génération pour anticorps antiprotéines citrullinées et cyclisées (CCP) et du test de détection des anticorps contre la fibrine dont les arginines ont été déiminées en citrullines. Les prélèvements réalisés au moment de la première consultation ont été conservés dans une sérothèque. Cette précaution nous a permis de constater (Fig. 5) que ni l Elisa anti-ccp de deuxième génération, ni l Elisa pour anticorps antifibrine déiminée n amélioraient notablement les performances du laboratoire [3]. Sans doute faut-il souligner, en conclusion, que la clinique prévaut, même confrontée à des examens biologiques aussi raffinés, remarquer que la sérologie rhumatoïde s est considérablement diversifiée au cours de ces dernières années et signaler que le LED n a pas le monopole des AAN, même de ceux qui sont dirigés contre l ADN natif. Références [1] Arvieux J, Youinou P. Anticorps anti-sm et anti-rnp. In: Meyer O, Rouquette AM, Youinou P, editors. Autoanticorps et mladies autoimmunes. Paris: Biotem; 1999.p [2] Saraux A, Berthelot JM, Chalès G, Le Hénaff C, Thorel JB, Hoang S, et al. Ability of the American College of Rheumatology 1987 criteria to predict rheumatoid arthritis in patients with early arthritis and classification of these patients two years later. Arthritis Rheum 2001; 44: [3] Saraux A, Berthelot JM, Chalès G, Le Hénaff C, Mary JY, Thorel JB, et al. Value of laboratory tests in early prediction of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2002;47: [4] Sebbag M, Simon M, Vincent C, Masson-Bessière C, Girbal E, Durieux JJ, Serre G. The antiperinuclear factor and the so-called antikeratin antibodies are the same rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1995;95: [5] Vincent C, Nogueira L, Sebbag M, Chapuy-Regaud S, Arnaud M, Letourmeur O, et al. Detection of antibodies to deiminated recombinant rat filaggrin by enzyme-linked immunosorbent assay. Arthritis Rheum 2002;46: [6] Youinou P, Le Goff P, Saraux A. Pratique et interprétation des examens biologiques dans les maladies systémiques. In: Kahn MF, Peltier AP, Meyer O, Piette JC, editors. Maladies et syndromes systémiques. Paris: Médecine-Sciences Flammarion; 2000.p