VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON LES GROUPES SANGUINS FELINS : ACTUALITES ET ETUDES D UNE POPULATION A VETAGRO SUP, CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

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1 VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n 036 LES GROUPES SANGUINS FELINS : ACTUALITES ET ETUDES D UNE POPULATION A VETAGRO SUP, CAMPUS VETERINAIRE DE LYON THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 30 septembre 2016 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par PILOD Lise Née le 25 août 1991 à Pontarlier

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3 VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n 036 LES GROUPES SANGUINS FELINS : ACTUALITES ET ETUDES D UNE POPULATION A VETAGRO SUP, CAMPUS VETERINAIRE DE LYON THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 30 septembre 2016 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par PILOD Lise Née le 25 août 1991 à Pontarlier 1

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5 LISTE DES ENSEIGNANTS DU CAMPUS VÉTÉRINAIRE DE LYON Mise à jour le 09 juin 2015 Civilité Nom Prénom Unités pédagogiques Grade M. ALOGNINOUWA Théodore UP Pathologie du bétail Professeur M. ALVES-DE-OLIVEIRA Laurent UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme ARCANGIOLI Marie-Anne UP Pathologie du bétail Maître de conférences M. ARTOIS Marc UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. BARTHELEMY Anthony UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel Mme BECKER Claire UP Pathologie du bétail Maître de conférences Mme BELLUCO Sara UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences Mme BENAMOU-SMITH Agnès UP Equine Maître de conférences M. BENOIT Etienne UP Biologie fonctionnelle Professeur M. BERNY Philippe UP Biologie fonctionnelle Professeur Mme BERTHELET Marie-Anne UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme BONNET-GARIN Jeanne-Marie UP Biologie fonctionnelle Professeur Mme BOULOCHER Caroline UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. BOURDOISEAU Gilles UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. BOURGOIN Gilles UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. BRUYERE Pierre UP Biotechnologies et pathologie de la reproduction Maître de conférences M. BUFF Samuel UP Biotechnologies et pathologie de la reproduction Maître de conférences M. BURONFOSSE Thierry UP Biologie fonctionnelle Professeur M. CACHON Thibaut UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. CADORE Jean-Luc UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Professeur Mme CALLAIT-CARDINAL Marie-Pierre UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. CAROZZO Claude UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. CHABANNE Luc UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Professeur Mme CHALVET-MONFRAY Karine UP Biologie fonctionnelle Professeur M. COMMUN Loic UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme DE BOYER DES ROCHES Alice UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme DELIGNETTE-MULLER Marie-Laure UP Biologie fonctionnelle Professeur M. DEMONT Pierre UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme DESJARDINS PESSON Isabelle UP Equine Maître de conférences Contractuel Mme DJELOUADJI Zorée UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme ESCRIOU Catherine UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences M. FAU Didier UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme FOURNEL Corinne UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Professeur M. FREYBURGER Ludovic UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. FRIKHA Mohamed-Ridha UP Pathologie du bétail Maître de conférences Mme GILOT-FROMONT Emmanuelle UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. GONTHIER Alain UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme GRAIN Françoise UP Gestion des élevages Professeur M. GRANCHER Denis UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme GREZEL Delphine UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. GUERIN Pierre UP Biotechnologies et pathologie de la reproduction Professeur Mme HUGONNARD Marine UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences M. JUNOT Stéphane UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. KECK Gérard UP Biologie fonctionnelle Professeur M. KODJO Angeli UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LAABERKI Maria-Halima UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. LACHERETZ Antoine UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LAMBERT Véronique UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme LATTARD Virginie UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences Mme LE GRAND Dominique UP Pathologie du bétail Professeur Mme LEBLOND Agnès UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LEFRANC-POHL Anne-Cécile UP Equine Maître de conférences M. LEPAGE Olivier UP Equine Professeur Mme LOUZIER Vanessa UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences M. MARCHAL Thierry UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Professeur M. MOUNIER Luc UP Gestion des élevages Maître de conférences M. PEPIN Michel UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. PIN Didier UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences Mme PONCE Frédérique UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences Mme PORTIER Karine UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme POUZOT-NEVORET Céline UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme PROUILLAC Caroline UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences Mme REMY Denise UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme RENE MARTELLET Magalie UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences stagiaire M. ROGER Thierry UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur M. SABATIER Philippe UP Biologie fonctionnelle Professeur M. SAWAYA Serge UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. SCHRAMME Serge UP Equine Professeur associé Mme SEGARD Emilie UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel Mme SERGENTET Delphine UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme SONET Juliette UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel M. THIEBAULT Jean-Jacques UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences M. TORTEREAU Antonin UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences stagiaire M. VIGUIER Eric UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme VIRIEUX-WATRELOT Dorothée UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences Contractuel M. ZENNER Lionel UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur 3

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7 REMERCIEMENTS A Monsieur le Professeur Bernard Allaouchiche, De la faculté de Médecine de Lyon, Pour nous avoir fait l honneur d accepter la présidence de ce jury de thèse, Pour votre disponibilité et votre amabilité, Mes hommages respectueux. A Monsieur le Professeur Luc Chabanne, De Vetagro Sup, Campus vétérinaire de Lyon Pour son aide et ses conseils tout au long de ce travail. Qu il trouve ici l expression de mon admiration et de mon plus profond respect. A Monsieur le Maître de conférence Ludovic Freyburger, De Vetagro Sup, Campus vétérinaire de Lyon, Qui a aimablement accepté de faire partie de mon jury de thèse, Sincères remerciements. A Madame le Docteur Isabelle Goy Thollot, De Vetagro Sup, Campus vétérinaire de Lyon, Pour m avoir proposé ce projet, Pour l engagement et la confiance qu elle a su m accorder, Qu elle trouve ici l expression de ma sincère gratitude. A Monsieur le Docteur Bertrand Canard, Pour sa disponibilité, son soutien et ses précieux conseils tout au long de ce travail. Qu il trouve ici l expression de mon admiration et de mon plus profond respect. A la société ALVEDIA, Pour l accueil dans vos locaux et la mise à disposition du matériel nécessaire à la réalisation de mon projet. Sincères remerciements. A toute l équipe du SIAMU, Pour l enthousiame, l investissement et l aide précieuse apportée lors des prélèvements sanguins. Sincères remerciements. 5

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9 TABLE DES MATIERES TABLE DES ANNEXES TABLE DES FIGURES TABLE DES TABLEAUX Liste des abréviations INTRODUCTION Partie bibliographique : Connaissances actuelles sur les groupes sanguins félins, techniques de groupage et applications I. Définition des groupes sanguins A. Définition générale B. Historique des groupes sanguins chez le chat II. Caractéristiques du système AB A. Génétique du système AB Mode de transmission des groupes A et B Cas du phénotype AB B. Nature biochimique / moléculaire des antigènes Constitution de la membrane érythrocytaire Protocole expérimental d identification moléculaire Profil biochimique des glycolipides membranaires a. Erythrocytes de groupe A b. Erythrocytes de groupe B c. Cas des érythrocytes de groupe AB Biosynthèse des antigènes érythrocytaires a. Cytidine monophospho-n-acetylneuraminique acide hydroxylase : enzyme de conversion b. Mutations C. Alloanticorps naturels Caractéristiques générales Caractérisation biochimique Titres sériques en anticorps a. Cas des chats de groupe B b. Cas des chats de groupe A c. Cas des chats de groupe AB

10 d. Synthèse III. METHODES DE DETERMINATION DU GROUPE SANGUIN A. Tests de groupages Tests «historiques» sur plaque ou en tube Tests rapides a. Groupage par agglutination sur carte b. Groupage par agglutination en gel c. Typage par immuno-chromatographie B. Test de compatibilité : Cross-match Définition a. Cross-match majeur b. Cross-match mineur Pertinence du cross-match C. Le back-typing D. Erreurs de groupage E. Test génétique IV. EPIDEMIOLOGIE DES GROUPES SANGUINS A. Répartition en fonction du lieu géographique B. Répartition en fonction de la race V. EXISTE-T-IL UN AUTRE SYSTEME CHEZ LE CHAT? A. Travaux lyonnais B. Travaux de l Université de Pennsylvanie VI. IMPORTANCE CLINIQUE DU SYSTEME A/B/AB A. Iso-érythrolyse ou maladie hémolytique néonatale Définition Pathophysiologie Présentation clinique Diagnostic Traitement Prévention B. La Transfusion sanguine Indications de la transfusion Contre-indications Principe de la transfusion a. Collecte du sang

11 i. Choix du donneur ii. Prélèvement iii. Stockage iv. Produits sanguins disponibles b. Mise en place de la transfusion Réactions transfusionnelles a. Réactions immunologiques i. Réactions hémolytiques ii. Réactions fébriles non hémolytiques iii. Réactions allergiques b. Réactions non immunologiques c. Durée de vie des hématies post transfusionnelle Xénotransfusion Autotransfusion Partie expérimentale : Etude épidémiologique de la répartition des groupes sanguins à l école vétérinaire de Lyon et évaluation du risque I. Objectifs de l étude II. Matériel et méthode A. Animaux B. Prélèvements et conservation des échantillons sanguins C. Groupage D. Cross-match Cross-match en gel Cross-match en bandelettes E. Statistiques III. Résultats A. Groupage B. Cross-match gel Cross-match des 11 chats du groupe test entre eux, comparaison plasma frais et congelé Cross-match des plasmas congelés des 45 chats A sur les GR du groupe test Cross-match des plasmas congelés des 9 chats B et du chat AB sur les GR du groupe test C. Titrage Titrage des plasmas des chats A positifs en cross-match Titrage des plasmas des chats B

12 D. Cross-match par immunochromatographie Cross-match du plasma du chat A35 sur les GR du chat A Cross-match des plasmas B10 et B12 sur GRA2 du groupe test Cross-match des plasmas A du groupe test sur les GR du chat B IV. DISCUSSION A. Groupage, répartition des groupes B. Conséquences C. Cross match et conséquences CONCLUSION Bibliographie Annexes

13 TABLE DES ANNEXES Annexe 1 : Technique de cross-match sur tube (Davidow, 2013) Annexe 2 : Fiche de suivi transfusionnel du SIAMU Annexe 3 : Consentements éclairés Annexe 4 : Procédure lab test A+B

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15 TABLE DES FIGURES Figure 1 : Pedigrees d un abyssin (A) et d un birman (B) d après (Giger et al., 1991) Figure 2 : Action de la cytidine monophospho-n-acetylneuraminic acide hydroxylase (CMAH) Figure 3 : Schéma d une immunoglobuline Figure 4 : Répartition des chats de groupe B en fonction de leur titre en alloanticorps Figure 5 : Répartition des chats de groupe A en fonction de leur titre en allo-anticorps Figure 6 : Test de Coomb s Figure 7 : Typage sur carte par le laboratoire DMS Figure 8 : ID-Gel Test Feline A + B Typing Diamed Figure 9 : Quick test ALVEDIA Figure 10 : Rapidvet H IC du laboratoire DMS Figure 11 : Description du principe de cross-match Figure 12 : Photographie présentant la technique de prélèvement Figure 13 : Photographie de la poche pour chat développée par ALVEDIA Figure 14 : Répartition raciale de l échantillon Figure 15 : Résultats des cross-matchs des plasmas des chats du groupe test sur les globules rouges du chat A Figure 16 : Résultats des cross-matchs des plasmas des chats A11 et A35 sur les GR du chat B Figure 17 : Résultats des cross-matchs des plasmas des chats A11 et A35 sur les GR du chat A Figure 18 : Cross-matchs en gel des plasmas de chats B sur les GRA Figure 19 : Titrage du plasma des chats A35 et A Figure 20 : Titrage en gel du plasma du chat B

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17 TABLE DES TABLEAUX Tableau I : Principaux systèmes de groupes sanguins animaux d après (Chabanne et Rigal, 2003) Tableau II : Résultats d accouplement de chats d après (Giger et al., 1991) Tableau III : Lien entre le génotype et le phénotype des groupes sanguins félins Tableau IV : Résumé des caractéristiques des allo-anticorps félins Tableau V : Interprétation du génotype et résultats d après (Tasker et al., 2014) Tableau VI : Répartition géographique des groupes sanguins félins Tableau VII : Répartition des groupes sanguins en fonction de la race Tableau VIII : Génotypes, phénotypes et érythrolyse néonatale Tableau IX : Symptômes de la maladie hémolytique d après (Silvestre-Ferreira et al., 2010) 57 Tableau X : Résumé du traitement en cas de maladie hémolytique Tableau XI : Critères du donneur Tableau XII : Principales indications et conservations des différents produits sanguins Tableau XIII : Principales réaction transfusionnelles Tableau XIV : Caractéristiques des chats du groupe test Tableau XV : Résultats étude de la prévalence des groupes sanguins Tableau XVI : Calcul du risque transfusionnel dans notre étude Tableau XVII : Résultats des cross-matchs des 11 chats du groupe test Tableau XVIII : Résultats des cross-matchs des plasmas A sur les 11 GR du groupe test Tableau XIX : Résultats des cross-matchs utilisant le plasma des chats B Tableau XX : Titrage des plasmas A11 et A35 sur les GRB Tableau XXI : Résultats des titrages des plasmas B sur les globules rouges des chats A5 et AB Tableau XXII : Répartition des titrages en anticorps Tableau XXIII : Estimation du risque post-transfusionnel en prenant en compte le titrage des anticorps d après (Knottenbelt et al., 1999) Tableau XXIV : Résultats des cross-matchs sur bandelettes avec GRA Tableau XXV : Résultats des cross-matchs sur bandelettes des plasmas B10 et B12 sur les GRA

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19 Liste des abréviations Ac Ag CMAH EDTA GR HPTLC Ig LISS NeuAc NeuGc PBS PCR SIAMU TLC Anticorps Antigène Cytidine monophospho-n-acetylneuraminique acide hydroxylase Acide éthylène diamine tétra-acétique Globules rouges Chromatographie liquide sous haute pression Immunoglobuline Low ionic strenght saline N-acétyl-neuraminique N-glycolyl-neuraminique Phosphate Buffered Saline Réaction en chaîne par polymérase Soins intensifs anesthésie et médecine d urgence Chromatographie sur couche mince 17

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21 INTRODUCTION Ces dernières années, les animaux de compagnie ont pris une place considérable dans notre société, particulièrement le chat dont le nombre ne cesse d augmenter. En France, la population féline a progressé de plus de 11 % passant en deux ans de 11,4 à 12,7 millions (enquête FACCO/TNS SOFRES conduite à l automne 2014). Le chat est aujourd hui considéré comme partie intégrante de la famille et non plus uniquement comme un «chasseur de souris». L attachement affectif grandissant des propriétaires à leurs animaux entraîne donc une augmentation des soins apportés en qualité et en quantité. Face à cette demande croissante, la médecine vétérinaire se développe et s adapte aux particularités physiologiques des félins. Les chats sont de plus en plus médicalisés. Parallèlement à l engouement des Français pour le chat, l élevage félin se développe. Cette activité est souvent exercée par des personnes passionnées et très exigeantes en termes de soins et de connaissances vétérinaires. Ainsi, de nouvelles demandes émergent, auxquelles le vétérinaire praticien doit pouvoir répondre. Au cœur de l élevage, la néonatalogie prend toute sa place et fait partie des préoccupations des éleveurs, notamment face au risque de maladie hémolytique du nouveau-né. Pendant des années, la pratique transfusionnelle était peu standardisée et très différente entre pays. Les Anglo-Saxons ont été pionniers dans le développement de la transfusion sanguine chez le chien et le chat depuis les années Ils ont développé des techniques de groupage et des tests de compatibilité adaptés à ces espèces. Cependant, et de façon un peu surprenante, ces tests ont peu progressé ces dernières années. L augmentation des transfusions en lien avec la diversification des indications entraîne plus de prise de risque. Dans ce contexte, l étude de des groupes sanguins chez le chat et de leur prévalence revêt une importance majeure. Récemment, les procédures transfusionnelles ont été revisitées, en particulier les tests de groupage et de compatibilité. La découverte d autres groupes sanguins, le développement de réactifs utilisant des anticorps monoclonaux ont permis de développer des tests rapides à la portée de tous. Malgré cela, la recherche se cantonne encore principalement autour des systèmes considérés comme majeurs : le système DEA1 chez le chien et le système AB chez le chat. L idée qu il puisse y avoir, même en première transfusion et sur des animaux groupés, une réaction hémolytique est à peine émergente. En outre, la pratique de transfusions multiples accroît le risque de réactions et la nécessité non seulement de grouper, mais aussi de tester la compatibilité. 19

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23 Partie bibliographique : Connaissances actuelles sur les groupes sanguins félins, techniques de groupage et applications. I. Définition des groupes sanguins A. Définition générale L histoire des groupes sanguins a débuté en 1900 grâce à Karl Landsteiner, qui a découvert les groupes sanguins humains A, B, AB et O, plus tard, le système rhésus (Rh). Ces travaux ont été récompensés par le Prix Nobel de médecine en Chaque espèce animale possède, sur la membrane des hématies, des déterminants antigéniques appelés communément «groupes sanguins». Ces antigènes sont généralement des glycoprotéines ou des glycolipides et ont souvent des fonctions indépendantes de leur statut antigénique. Les groupes sanguins sont spécifiques d espèces, mais peuvent varier d un individu à l autre au sein de la même espèce. Ils sont à l origine d une réponse immunitaire lorsqu ils sont injectés à un individu d un autre groupe qui possède potentiellement des anticorps naturels dont l affinité est variable. Les anticorps correspondant peuvent être des IgG ou des IgM. Chez l homme, le système sanguin ABO est le plus important mais d autres antigènes existent également, notamment le facteur Rh. Pour les espèces animales d intérêt vétérinaire, les connaissances sont assez inégales et certaines descriptions demeurent encore relativement sommaires (Tableau I) Les groupes sanguins des animaux de rentes ont été bien étudiés du fait de leur intérêt comme marqueurs génétiques. Les furets, eux, ne semblent pas posséder différents groupes sanguins et peuvent être transfusés plusieurs fois avec différents donneurs sans développer d anticorps (Davidow, 2013). Chez le chat et le chien, le système des groupes sanguins n est que partiellement connu et fait encore l objet d études. 21

24 Tableau I : Principaux systèmes de groupes sanguins animaux d après (Chabanne et Rigal, 2003) Espèce Systèmes de groupes sanguins Facteurs Nombre Nomenclature antigéniques Chien 11 DEA1 ou A, DEA3 ou B, DEA4 ou 14 C, DEA5 ou D, DEA6 ou F, DEA7 ou Tr, DEA8 ou He, J, K, L, M et N Chat 1 AB 2 Equidés 7 A, C, D, K, P, Q et U 35 Bovins 10 A, B, C, F, J, L, M, R, S, T et Z 66 Ovins 6 A, B, C, D, M et R 19 Porcins 16 A,B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, 75 N, O et P Lamas 5 AB, C, D, E et F 6 Lapin 7 Hg, Hb, Hc, He, Hh, Hq, Hu 12 B. Historique des groupes sanguins chez le chat Actuellement, un seul système principal de groupes sanguins, le système AB, est clairement défini chez le chat. En 1912, le professeur Ingebrigtsen découvre l'existence d'isoagglutinines sériques qui réagissent avec les globules rouges chez le chat. Ceci permet de mettre en évidence, pour cette espèce animale, l'existence de groupes sanguins. En 1915, Ottenburg et Thalheimer découvrent que le titre en isoagglutinines est variable au cours de l année mais reste faible et que les hémolysines sont rarement présentes. En 1950, l'anglais Homes définit le système des groupes sanguins du chat et les nomme : "EF" représentant 95 % de la population féline, "O" représentant 4 % et "F" représentant 1 %, sur 447 chats de la région de Manchester. En 1962, le professeur Eyquem définit les deux antigènes A et B. Ces antigènes sont apparentés aux groupes d'homes : "EF" étant le A et "O" le B. A Paris, la même année, on trouvait 15 % de chats B (Eyquem et al., 1962). L existence des groupes A et B est confirmée en 1981 par Auer et Bell. Le groupe AB est également identifié, on peut raisonnablement l assimiler au "F" d Homes (Barfield, Adamantos, 2011). Ces études, assez anciennes, ne sont pas la réalité d aujourd hui. Dans la deuxième partie de notre travail, nous nous intéressons à la prévalence des groupes sanguins en France et nous la comparons avec les études faites à l étranger et aux publications françaises. Aucun groupe O (avec un manque d antigène érythrocytaire) n a été décrit chez le chat. Bien que l on utilise les mêmes lettres que pour la description du système de groupe sanguin humain, il n y a aucune relation entre le système AB du chat et le système ABO humain (Hohenhaus, 2004). 22

25 II. Caractéristiques du système AB A. Génétique du système AB 1. Mode de transmission des groupes A et B En 1981, Auer et Bell, avec des études limitées à certaines races, ont proposé des hypothèses génétiques assez complexes. Les données étaient alors encore insuffisantes et le mode de transmission restait inconnu (Auer, Bell, 1981). C est près de dix ans plus tard qu une nouvelle étude reposant sur l analyse du pedigree de famille de chats groupés de différentes races est publiée (Giger et al., 1991). Pour chaque chat, la race et le genre étaient connus ainsi que les informations concernant le pédigree et le groupe sanguin des parents. Le but était de construire des pedigrees scientifiques pour visualiser les relations entre les groupes sanguins des parents et de la descendance. L étude du pedigree d une famille d Abyssin et de Birman a montré des résultats d accouplements intéressants entre différents types sanguins (Figure1). Ces accouplements sont représentatifs des autres mariages étudiés. Figure 1 : Pedigrees d un abyssin (A) et d un birman (B) d après (Giger et al., 1991) 23

26 Il apparaît que deux accouplements entre chats B donnent uniquement naissance à des chatons B. En revanche, les mariages entre chats de type A peuvent faire naître des chatons A mais également des chatons B (Tableau II). Ceci suggère que B est récessif par rapport à A. De plus, plusieurs accouplements entre chats A et chats B produisent essentiellement des chatons A, mais aussi quelques B. Selon l hypothèse où A et B sont déterminés par deux allèles A et b et que l allèle b est récessif par rapport à A, les chats A ont le génotype AA ou Ab et les chats B ont le génotype bb. Tableau II : Résultats d accouplement de chats d après (Giger et al., 1991) Accouplements Nombre d accouplements Nombre de chatons Type A Type B B B A B A A Nombre total Les nombreux croisements entre parents de phénotypes connus et l étude du phénotype de la descendance ont permis d affirmer que l allèle A est complétement dominant sur l allèle b. Les groupes sanguins félins sont des phénotypes érythrocytaires dus à deux allèles sur le même locus. Il s agit d un déterminisme monogénique autosomique. Les individus de phénotype A peuvent être homozygotes ou hétérozygotes, alors que ceux de phénotype B sont obligatoirement homozygotes. Le groupe sanguin hérité de manière récessive n est pas habituel dans les autres espèces animales ; c est souvent la codominance qui prime comme dans l espèce humaine. A ce stade de leur étude, Giger et al. n avaient cependant pas pu expliquer le mécanisme moléculaire responsable de cette complète dominance. 2. Cas du phénotype AB La proportion de chats de groupe AB est très faible (0 à 7 % selon la race et la localisation géographique) et ils sont produits uniquement par le mariage de chat AB avec d autres du même groupe ou avec des chats de type B (Giger et al., 1991). Dans cette même étude, les croisements de chats AB avec des chats A n ont donné que des chatons de type A. Le phénotype AB a été comparé au rare phénotype cis AB de l espèce humaine dans lequel les caractéristiques A et B sont héritées ensemble d un même parent. Mais ce modèle a rapidement été abandonné. D autres études génétiques de familles avec des chats AB ont montré que le phénotype AB était le résultat de l expression d un troisième allèle aᵃᵇ dominant par rapport à b et récessif par rapport à A. 24

27 En 2007, la mutation caractérisant ce troisième allèle est identifiée (Bighignoli et al., 2007) et le mode de transmission des groupes sanguins félins est alors établi avec certitude : 3 allèles pour le même gène avec A>aᵃᵇ>b (Tableau III). Tableau III : Lien entre le génotype et le phénotype des groupes sanguins félins PERE MERE CHATON Phénotype (groupe) A A Génotype des parents AA AA A Ab Ab A ou B Aaᵃᵇ Aaᵃᵇ A ou AB Phénotype (groupe) B B Génotype des parents bb bb B Phénotype (groupe) AB AB Génotype des parents aᵃᵇaᵃᵇ aᵃᵇaᵃᵇ AB aᵃᵇb aᵃᵇb AB ou B Phénotype (groupe) A B Génotype des parents AA bb A Ab bb A ou B Aaᵃᵇ bb A ou AB Phénotype (groupe) A AB Génotype des parents AA aᵃᵇaᵃᵇ A Ab aᵃᵇb AB ou AB Aaᵃᵇ aᵃᵇaᵃᵇ ou aᵃᵇb A ou AB Phénotype (groupe) AB B Génotype des parents aᵃᵇaᵃᵇ bb AB aᵃᵇb bb AB ou B 25

28 B. Nature biochimique / moléculaire des antigènes 1. Constitution de la membrane érythrocytaire La membrane plasmique et le réseau de protéines associé confèrent à l érythrocyte sa forme de disque, sa déformabilité et sa plasticité. La membrane plasmique est constituée de phospholipides, de cholestérol non estérifié, de glycoprotéines associées à des glycolipides, dont certaines portent des déterminants antigéniques de la cellule ou des résidus d acides sialiques chargés négativement. Chez le chat, les antigènes érythrocytaires A et B chez le fœtus sont détectables à partir du 38ème jour de gestation mais sont probablement présents avant cette date (Auer, Bell, 1981). Ce sont de réels antigènes érythrocytaires et non des antigènes tissulaires qui viennent se fixer secondairement aux hématies. Ils ne se retrouvent pas sur d autres cellules ou sécrétions de l organisme, comme la salive. La structure sphingolipidique qui détermine les groupes sanguins chez le chat a été identifiée comme étant un résidu d acide sialique sur une base de céramide dihexose. 2. Protocole expérimental d identification moléculaire En 1992, une étude se propose de déterminer la nature moléculaire à l origine des groupes sanguins félins (Andrews et al., 1992). Ils émettent l hypothèse que les antigènes sont déterminés par la forme des acides neuraminiques présents sur les glycolipides (spécifiquement GD3) et peut être par des glycoprotéines de la membrane érythrocytaire féline. Cette hypothèse repose sur les résultats de la chromatographie en couche mince des glycolipides d érythrocytes de chats préalablement groupés, les tests d agglutination et la spécificité de liaison avec la lectine de Triticum vulgaris. Ces résultats sont confirmés l année suivante (Griot-Wenk et al., 1993). Les glycolipides de la membrane érythrocytaire sont étudiés par chromatographie en couche mince mais également par immuno-chromatographie avec des anticorps monoclonaux MoAb R-24 (IgG de souris anti-neuac), MoAb (IgM humaine anti-neugc) et du sérum félin groupé. Les glycoprotéines de la membrane érythrocytaire sont investiguées par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium et de polyacrylamide (SDS-PAGE), immunoblotting avec lectine et western blotting en utilisant du sérum félin typé. Le sang de 391 chats est groupé avec la méthode d agglutination sur carte. L agglutination avec les anticorps monoclonaux est réalisée pour 25 de ces échantillons (10 A, 10 B et 5 AB). 26

29 Les globules rouges A sont agglutinés par MoAb uniquement, les types B par MoAb R24 uniquement alors que les types AB agglutinent avec les deux types de réactifs. La chromatographie en couche mince des glycolipides érythrocytaires montre des acides neuraminiques spécifiques sur des gangliosides contenant des dihexoses ceramides comme base. L immuno-chromatographie permet d appuyer les hypothèses émises quelques années auparavant. Les glycolipides majeurs des membranes érythrocytaires des chats de groupes A sont NeuGc-NeuGc-Galactose-Glucose-Céramide ([NeuGc]2GD3). Les glycoplipides qui caractérisent le groupe B sont NeuAc-NeuAc-Galactose-Glucose-Céramide ([NeuAc]2GD3). Le groupe AB est unique et présente [NeuGc]2GD3 et [NeuAc]2GD3 sur la même membrane. Ces résultats sont confirmés avec l utilisation de la cytométrie de flux et la chromatographie liquide sous haute pression (Griot-Wenk et al., 1993). Bien que les disialogangliosides prédominent, des mono et trisialogangliosides ont également été isolés dans cette étude. 3. Profil biochimique des glycolipides membranaires a. Erythrocytes de groupe A Les résultats indiquent que l acide N-glycolyl-neuraminique (NeuGc) est le principal déterminant des antigènes de groupe A (Furukawa et al., 1988; Andrews et al., 1992 ; Griot- Wenk et al., 1993), plus spécifiquement NeuGc-NeuGc-Galactose-Glucose-Céramide ([NeuGc]2Gd3) est le ganglioside le plus important des antigènes de groupe A. Il a été démontré que l antigène du groupe A est présent sur une protéine membranaire de 50kDa. La présence de trois autres disialogangliosides avec NeuAc en faible quantité a pu être observée chez des chats A. Les profils HPTLC en disialogangliosides des chats homozygotes par rapport aux chats hétérozygotes diffèrent légèrement par la quantité en disialogangliosides. Cette différence n a néanmoins pas pu être retrouvée avec la cytométrie de flux qui permet de quantifier la densité d antigènes sur les cellules sanguines. A [NeuGc]2GD3 = NeuGc-NeuGc-Galactose-Glucose-Céramide NeuAc-NeuGc-GD3 = NeuAc-NeuGc-Galactose-Glucose-Céramide NeuGc-NeuAc-GD3 = NeuAc-NeuGc-Galactose-Glucose-Céramide [NeuAc]2GD3 = NeuAc-NeuAc-Galactose-Glucose-Céramide [NeuGc]2disalylparagloboside = NeuGc-NeuGc-disialylparagloboside NeuAc-NeuGc-disialylparagloboside NeuGc-GM3 NeuAc-GM 27

30 b. Erythrocytes de groupe B Les érythrocytes des chats B sont caractérisés par la présence de N-acétyl-neuraminique (NeuAc) sur une protéine de 50 kda de la membrane érythrocytaire et une absence totale de détection de NeuGc (Andrews et al., 1992). Le ganglioside NeuAc-NeuAc-Galactose-Glucose-Céramide ([NeuAc]2GD3 n est présent que sur les érythrocytes portant l antigène B, de groupe B ou AB. B [NeuAc]2GD3 = NeuAc-NeuAc-Galactose-Glucose-Céramide NeuAc-GM 3 c. Cas des érythrocytes de groupe AB Les recherches indiquent que les érythrocytes de type AB ont les caractéristiques immunologiques des groupes A et B. De plus, il semble que les types AB ont une expression moins forte, c est-à-dire un nombre moins important de sites d antigènes A et B, comparé aux érythrocytes de types A ou B (comparaison semi quantitative selon la cytométrie de flux). Le nombre de sites de fixation pour la lectine de T. vulgaris et pour les anticorps anti-a ou anti-b par rapport aux érythrocytes des groupes A ou B correspondants est également moins important. Une analyse en cytométrie de flux a démontré que le site de fixation des antigènes A est bien distinct du site de fixation des antigènes B. Après utilisation d immunoglobulines de chèvre anti-igm de chats marquées à la fluorescéine, la somme des fluorescences des cellules AB incubées séparément avec des sérums anti-a ou anti-b est à peu près égale à celle des cellules incubées avec un mélange des deux types de sérum (Griot-Wenk et al., 1993). Les proportions d antigènes A et B semblent variables en fonction des cellules. Les érythrocytes de type AB ont à la fois des [NeuGc]2GD3 et [NeuAc]2GD3 en co-expression sur la même membrane. AB [NeuGc]2GD3 = NeuGc-NeuGc-Galactose-Glucose-Céramide NeuAc-NeuGc-GD3 = NeuAc-NeuGc-Galactose-Glucose-Céramide [NeuAc]2GD3 = NeuAc-NeuAc-Galactose-Glucose-Céramide NeuGc-GM3 NeuAc-GM3 28

31 4. Biosynthèse des antigènes érythrocytaires a. Cytidine monophospho-n-acetylneuraminique acide hydroxylase : enzyme de conversion Comme nous l avons décrit précédemment, les antigènes érythrocytaires sont déterminés par le type de disialogangliosides. NeuAc (seule forme présente chez les chats de groupe B) est converti en NeuGc (forme prédominante chez les chats de groupe A) lors d une réaction catalysée par une enzyme dénommée cytidine monophospho-n-acetylneuraminique acide hydroxylase (CMAH). Récemment, des auteurs ont à nouveau exploré la base génétique du système (Bighignoli et al., 2007). Dans cette étude, les mutations de la CMAH féline sont caractérisées pour évaluer leur influence sur le système AB. La mutation de la CMAH chez les chats de type B modifie le fonctionnement de l enzyme qui ne peut alors plus convertir NeuAc en NeuGc (Figure 2). NeuAc NeuGc B CMAH totalement active A CMAH inactive CMAH partiellement active AB Figure 2 : Action de la cytidine monophospho-n-acetylneuraminic acide hydroxylase (CMAH) NeuGc est présent chez de nombreux mammifères mais pas chez l Homme (Bighignoli et al., 2007). La CMAH humaine est inactive suite à une délétion au niveau de la région codante du gène mais elle est conservée et active chez des espèces primitives telles que les échinodermes. 29

32 CMAH est supposée active uniquement dans les globules rouges de type A et absente ou non fonctionnelle dans les érythrocytes de type B. Cette étude montre que la structure génétique de la CMAH féline est similaire au gène homologue dans d autres espèces. L enzyme féline de 578 acides aminés est codée par 1734 nucléotides, répartis en 14 exons. La comparaison avec la CMAH du rat et de la souris suggère que chez le chat, seulement les 6 derniers nucléotides de l exon 1 et les 72 premiers de l exon 14 sont transcrits. b. Mutations D après cette étude (Bighignoli et al., 2007), le système sanguin AB permet d expliquer que la conversion de NeuAC en NeuGc, donc de groupe B en type A, résulte de la mutation de la CMAH. Il a été décrit 6 mutations : deux en amont du codon start, une au niveau l exon 1 5 UTR et 3 mutations faux sens dans la région codante. Ces 6 mutations sont homozygotes chez les chats B conduisant à une inactivation de la CMAH et hétérozygotes chez tous les chats de type A chez qui la CMAH est totalement active. Pour le groupe AB, les mutations spécifiques n ont pas encore été identifiées. Les analyses de génome et d ADNc suggèrent que la translation de l exon 1 chez le chat en amont du codon start correspondant chez la souris, génère une protéine avec 28 acides aminés de plus chez le chat. Le décalage de la lecture par l insertion de 18 paires de bases dans l exon 1 ou un changement ont causé un dysfonctionnement de l enzyme et la production de cellules sanguines porteuses de NeuGc, qui seraient l allèle b. Une modification dans les sites d épissage et de transcription peut influencer le rare type AB. C. Alloanticorps naturels 1. Caractéristiques générales Comme pour le système sanguin humain, tous les chats de groupe A ont naturellement des alloanticorps anti-b et tous les chats de groupe B des allo-anticorps anti-a. Le terme naturel signifie qu aucune exposition préalable à du sang ou à des produits sanguins n a généré la formation de ces anticorps. La proportion de chats A avec un faible niveau d anticorps naturels anti-b varie géographiquement (Knottenbelt, Day, et al., 1999). Alors que tous les chats B semblent avoir un haut niveau d anticorps naturels anti-a, les chats de groupe AB ne possèdent, quant à eux, pas d allo-anticorps naturels anti-a et anti-b. Les allo-anticorps naturels sont le résultat d une exposition à des épitopes qui sont normalement présents dans la nature (des composants de la structure des plantes, des bactéries ou des protozoaires). Ils sont similaires ou identiques aux antigènes déterminant les groupes sanguins. 30

33 Chez l homme, par exemple, les épitopes responsables sont probablement des antigènes microbiens présents chez des bactéries intestinales. Chez le chat, l origine de ces épitopes n a pas été établie. Mais la formation d anticorps contre les antigènes que l individu ne possède pas est le résultat de l exposition à ces épitopes. Les anticorps produits vont ensuite réagir avec des antigènes similaires trouvés sur les érythrocytes étrangers. En revanche, l exposition à des épitopes semblables aux antigènes de l animal ne va pas entraîner la formation d anticorps. Ceci explique l absence d anticorps chez les chats de type AB. L absence d anticorps chez de nombreuses espèces peut être due à un manque d exposition à des épitopes correspondants. 2. Caractérisation biochimique Ces anticorps appartiennent à la famille des immunoglobulines. Cinq types avec la même base structurelle sont produits. Chaque immunoglobuline est une unité symétrique composée de 4 chaînes de polypeptides, 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères (Figure 3). Il existe deux types de chaînes légères, κ et λ et 5 types de chaînes lourdes μ, γ, α, ε et δ. La chaîne lourde détermine alors la classe de l anticorps : IgM, IgG, IgA, IgE et IgG respectivement. Les IgM sont la première classe d anticorps à être synthétisée et sécrétée dans le plasma lors d une réponse immunitaire primaire. Les IgG sont produites en grande quantité lors d une réponse immunitaire secondaire. Les allo-anticorps sanguins sont des IgM, IgG ou des IgE et peuvent entraîner des réactions d hypersensibilité aux produits sanguins. Les anticorps naturels anti-b des chats de type A sont des hémagglutinines faibles (IgM) et des hémolysines (IgM et IgG dans les mêmes proportions). Les allo-anticorps anti-a sont différents ; ce sont plutôt des hémolysines et hémagglutinines fortes appartenant majoritairement à la classe des IgM, bien qu une certaine partie de l action hémagglutinante soit associée aux IgG (Wilkerson et al., 1991). La spécificité entre un anticorps et l antigène correspondant est une réaction réversible qui obéit à une loi thermodynamique. 31

34 Figure 3 : Schéma d une immunoglobuline 3. Titres sériques en anticorps Ces dernières années, plusieurs études se sont intéressées au titrage en anticorps anti A et B chez le chat (Knottenbelt, Day, et al., 1999 ; Arikan, Akkan, 2004 ; Silvestre-Ferreira et al., Dec 11, 2004a ; Gurkan et al., 2005). L objectif de ce titrage était de pouvoir ainsi évaluer le risque de réactions transfusionnelles et de maladies hémolytiques du nouveau-né. Il s agit d établir une série de dilutions de sérums et d effectuer la réaction d agglutination avec chaque dilution. La plus haute dilution associée à une réaction positive donne le titre. Lorsque les anticorps sont encore détectés lors d une dilution à 1/32 mais plus à 1/64, alors le titre d anticorps dans ce sérum est de 32. Les chatons commencent à produire leurs propres allo-anticorps entre 5 et 7 semaines de vie et les anticorps atteignent leur maximum à 2-3 mois d âge (Giger et al., 1991). Les faibles titrages de certains chats peuvent être mis en corrélation avec l âge de l animal. 32

35 Proportion des chats a. Cas des chats de groupe B (Arikan et Akkan, 2004) (Gurkan et al., 2005) (Knottenbelt et al., 1999a) (Silvestre- Ferreira et al., Dec 11, 2004a) ,4 % 3,8 % ,9 % 3,8 % 2,5 % ,9 % 21,8 % 12,5 % ,4 % 28,2 % 7,5 % 14,3 % 32 13,3 % 26,9 % 17,5 % 28,6 % 64 11,1 % 9,0 % 27,5 % 28,6 % 128 6,7 % 3,8 % 17,5 % ,5 % ,2 % 2,6 % 14,3 % ,3 % ,0 % ,5 % - N ,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Titre en anticorps (Arikan and Akkan 2004) (Gurkan et al. 2005) (Knottenbelt et al. 1999) (Silvestre-Ferreira et al. 2004) Figure 4 : Répartition des chats de groupe B en fonction de leur titre en alloanticorps Les résultats des différentes études sont comparables et s accordent à dire que la plupart des chats B ont des titrages en alloanticorps élévés. Les chats de groupe B possèdent des anticorps anti A qui sont des hémagglutinines avec un titre entre 1/64 et 1/2048 (Figure 4). 33

36 Propprtion de chats b. Cas des chats de groupe A (Arikan et Akkan, 2004) (Gurkan et al., 2005) (Knottenbelt et al., 1999a) (Silvestre-Ferreira et al., Dec 11, 2004a) ,3 % 27,9 % 67,4 % M 33,3 % 17,6 % 27,9 % 8,1 % 2 23,3 % 31,3 % 27,9 % 15,1 % 4 26,7 % 34,4 % 11,0 % 5,8 % 8 13,3 % 4,0 % 3,3 % 2,3 % 16 3,3 % 0,4 % 0 1,2 % ,6 % 0 N ,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 M Titre en anticorps (Arikan and Akkan 2004) (Gurkan et al. 2005) (Knottenbelt et al. 1999) (Silvestre-Ferreira et al. 2004) Figure 5 : Répartition des chats de groupe A en fonction de leur titre en allo-anticorps Les anticorps anti-a sont principalement des IgM mais des IgG ont également été identifiées. Environs 35 % des chats de type A ont un faible taux d anticorps anti-b agglutinant (0 à 1/16) et 40 % ont des anticorps hémolysant avec des titres de 0 à 1/8 (Figure 5). c. Cas des chats de groupe AB Comme cela était suspecté, les différentes études ont montré que les individus de groupe AB ne possèdent pas d allo-anticorps naturels. Le sérum des chats AB ne présente pas d activité hémolysante ou agglutinante. 34

37 d. Synthèse Le Tableau IV résume les caractéristiques des allo-anticorps félins dans le système des groupes sanguins AB. Tableau IV : Résumé des caractéristiques des allo-anticorps félins Type A Type B Type AB Pourcentage d individus porteurs d alloanticorps Variable 100 % - Allo-anticorps Anti-B Anti- A 0 Titrage Faible [0-8] Elevé [8-1600] 0 Classe d Ig IgG IgM - III. METHODES DE DETERMINATION DU GROUPE SANGUIN Le groupage sanguin permet de détecter les antigènes sur les membranes des érythrocytes, alors que l épreuve de compatibilité croisée sert à déterminer s il existe des anticorps dans le plasma du donneur et/ou du receveur susceptibles de provoquer des réactions d incompatibilité. A. Tests de groupages Le groupage sanguin sérologique repose sur l identification de la présence d antigènes A ou B à la surface des globules rouges par agglutination avec des anticorps ou des lectines (Proverbio et al., 2011; Seth et al., 2011; Finck et al., 2013). Le sérum de chats de groupe B est souvent utilisé comme réactif anti-a, à cause du haut taux d allo anticorps présents chez tous les chats B ainsi que de leur fort pouvoir antigénique. Parce que les anticorps anti-b dans les sérums de chats de groupe A sont présents en quantité variable et d antigénicité moindre, ils sont remplacés par la lectine de Triticum vulgaris. Cette lectine agglutine spécifiquement les érythrocytes félins de groupe B, elle se lie avec les sialoglycoprotéines contenant NeuAc mais pas avec celles contenant NeuGc. Elle peut ainsi être utilisée comme réactif de groupage. 35

38 De nombreuses études ont eu pour but de comparer les différentes méthodes de groupages qui s offrent au clinicien mais également les méthodes de laboratoire. 1. Tests «historiques» sur plaque ou en tube Ils constituent le «gold standard» des méthodes de typage sanguin chez le chat. Que le test d agglutination soit sur plaque ou en tube, le principe est similaire au test de Coomb s direct (Figure 6). Une suspension de globules rouges lavés est incubée avec des réactifs appropriés pour la détection d une agglutination en présence des antigènes sanguins A ou B. Le contrôle négatif est effectué grâce à une solution de tampon phosphate salin (PBS). Avec le test sur microplaque, les réactifs peuvent être dilués et de multiples contrôles peuvent être effectués. Comme décrit précédemment, les réactifs standards sont la lectine de Triticum vulgaris (pour la détection de l antigène B) et du sérum de chat B (contenant des anticorps anti-a pour la détection de l antigène A). L agglutination entre les réactifs et les antigènes respectifs permet de déterminer le groupe sanguin. Sang du patient Ajout réactif du Test positif Figure 6 : Test de Coomb s Récemment, des anticorps monoclonaux spécifiques des groupes sanguins félins ont été développés et incorporés dans un test commercialisé d agglutination sur tube (Stieger et al., 2005). Ces tests exigent une certaine technicité et sont réservés à un usage en laboratoire spécialisé. 36

39 2. Tests rapides Ces tests ont été développés pour permettre aux vétérinaires de pratiquer des groupages sanguins rapidement et de façon fiable au chevet de leurs patients. a. Groupage par agglutination sur carte Principe Le premier test développé pour le vétérinaire praticien est le système en carte (RapidVet-H, DMS, Figure 7). Les cartes sont relativement simples à utiliser et donnent un résultat rapide. Ce mode de groupage a été comparé au gold standard sur microplaque et validé (Knottenbelt, et al., 1999a). La carte comporte trois zones distinctes contenant respectivement des réactifs pour la détection des groupes A et B et un auto-contrôle négatif pour vérifier qu il n existe pas d auto-agglutination des globules rouges du patient (Figure 7). Il en existe deux différents, un test avec des anticorps polyclonaux et une version plus récente avec des anticorps monoclonaux. Il est à noter que pour ce test, le réactif de détection de l antigène B est la lectine de Triticum vulgaris. Méthode Une goutte (environ 50μL) de solution de PBS est placée dans les trois puits, respectivement l autocontrôle, les puits A et B sur la carte de groupage. Une goutte de sang sur anticoagulant est ajoutée et étalée dans chaque puits. Une goutte supplémentaire de PBS est ajoutée au puits anti-a pour éviter un effet «prozone» et améliorer l agglutination. La carte est agitée et l agglutination est interprétée après une minute : - 0 : pas d agglutination ; - 1+ : petite agglutination avec globules rouges en suspension ; - 2+ : quelques larges agglutinats avec de plus petits agglutinats ; - 3+ : larges agglutinats dans une suspension claire ; - 4+ : une seule large agglutination dans une suspension claire ; Les réactions d agglutination de 2+ ou plus sont considérées comme des résultats positifs. Lorsque des agglutinations sont présentes dans le puits témoin, les globules rouges sont lavés trois fois avec une solution de PBS. Quand l auto agglutination est inférieure à 1, le typage est relancé. 37

40 Sur cette carte, l agglutination dans la zone type B indique que le chat est de groupe B. Figure 7 : Typage sur carte par le laboratoire DMS Avantages et inconvénients : Les tests d agglutination sur carte sont très abordables en terme de coût et relativement fiables. Néanmoins, les résultats peuvent parfois être difficiles à interpréter en raison de la variation en quantité et qualité des antigènes présents sur les globules rouge. L interprétation est parfois variable selon les utilisateurs. Ce test est difficilement réalisable chez les patients qui autoagglutinent. Les globules rouges doivent alors être «lavés» plusieurs fois avant de procéder au groupage. b. Groupage par agglutination en gel Principe Le gel test (ID-Gel test feline anti-a + B typing, Diamed) a également été évalué et montrait de bons résultats en comparaison avec les techniques utilisées en laboratoire. Pour cette méthode, les réactifs (lectine anti-b et sérum anti-a) sont imprégnés dans un gel qui forme une micro-colonne sur une plaque en plastique. Du sang total dilué ou des globules rouges lavés sont ajoutés par le haut de la colonne et la plaque est ensuite centrifugée. Les globules rouges passent doucement à travers le gel mais lorsqu ils sont porteurs de l antigène correspondant au réactif contenu dans la colonne, ils ne peuvent plus migrer à travers le gel et forment une bande à la surface. Quand les érythrocytes ne possèdent pas l antigène qui se lie au réactif alors ils traversent toute la colonne de gel et se retrouvent au fond (Figure 8). La rétention des globules rouges par le gel est gradée de la manière suivante : -0 : tous les globules rouges sont en bas de la colonne de gel ; -1+ : quelques globules rouges agglutinés dans la partie basse du gel mais la plupart sont en bas du gel ; -2+ : des agglutinats de globules rouges sont dispersés tout le long de la colonne de gel ; -3+ : comme pour 2+ mais avec des globules rouges à la surface du gel ; -4+ : tous les globules rouges sont restés à la surface du gel. 38

41 Une rétention de globules rouges supérieure à 2+ est considérée comme positive. Les échantillons sont lavés et le test est répété si la colonne de contrôle est positive. Agglutination Résultat positif Chat de groupe AB Sédimentation Résultat négatif pour le contrôle Figure 8 : ID-Gel Test Feline A + B Typing Diamed c. Typage par immuno-chromatographie Principe Récemment, la société ALVEDIA a mis sur le marché des réactifs prêts à l emploi qui incorporent des anticorps monoclonaux spécifiques anti-a et anti-b. Ce dispositif permet de se dispenser des cartes qui utilisent la lectine de Triticum vulgaris spécifique de l antigène B et des anticorps polyclonaux anti-a qui détectent les globules rouges A. Ce dispositif sur bandelette est associé à un anticorps anti-glycophorine de chat qui apporte un témoin positif indispensable à la réalisation d un test fiable. Avec cette technique, les taux d hématocrite très faibles ou l auto agglutination gênent beaucoup moins la lecture du groupage. De même, les agglutinations faibles sont bien détectées de sorte que les chats AB sont correctement groupés avec ce système. La bandelette absorbante équipée d un buvard à l extrémité permet d effectuer le prélèvement de sang (même directement sur le cordon ombilical à la naissance). Ainsi, il est possible de connaître très rapidement le groupe sanguin d un chaton afin de savoir si on doit le séparer de sa mère ou non. Méthode Pour le Quick test ALVEDIA (Figure 9), trois gouttes de diluant sont placées dans un puits. Une bandelette de papier absorbant est plongée dans le sang sur anticoagulant puis dans le puits contenant le diluant pour mettre en suspension les globules rouges. Une bande immunochromatographique, linéairement imprégnée en trois niveaux distincts avec des anticorps monoclonaux anti-a, anti-b et une lectine de contrôle, est ensuite placée dans la 39

42 suspension de globules rouges pendant environ 2 minutes jusqu à ce que la suspension de globules rouges (GR) diffuse jusqu en haut de la bandelette. La cartouche est ensuite placée sur un support et immédiatement interprétée : la présence d une bande rouge au niveau de la position marquée C (contrôle) doit impérativement être présente pour autoriser l interprétation. La présence d une bande rouge au niveau du marquage A montre l expression de l antigène A et la présence d une bande rouge en regard du marquage B indique l expression de l antigène B. Chat de groupe B Chat de groupe AB Chat de groupe A Figure 9 : Quick test ALVEDIA 40

43 Le RapidVet-H IC (Figure 10) est un autre test de groupage félin qui utilise l immunochromatographie, développé par le laboratoire DMS. Le test se présente sous la forme d une moitié de cercle avec trois fenêtres. Le sang est mélangé avec un diluant puis déposé au centre. Le mélange migre ensuite sur trois membranes distinctes, l une contenant des anticorps monoclonaux anti-a, une autre des anticorps monoclonaux anti-b et une dernière, le contrôle permettant l agglutination de tous les globules rouges (Cain, Suzuki, 1985 ; Koening, 2015). Comme pour le Quick Test une ligne rouge doit impérativement apparaître dans la fenêtre de contrôle pour autoriser la lecture du test. Une autre ligne rouge apparaît soit dans la fenêtre A, soit dans la B ou dans les deux à la fois selon le groupe sanguin du chat. Chat de groupe A Chat de groupe B Figure 10 : Rapidvet H IC du laboratoire DMS Avantages Ces deux tests de groupage par immunochromatographie sont simples d utilisation et d interprétation. Ils permettent le groupage d un animal qui auto-agglutine sans avoir à laver les globules rouges au préalable. 41

44 B. Test de compatibilité : Cross-match 1. Définition Le cross-match va identifier la présence d anticorps dans le sérum du receveur ou du donneur contre les antigènes des globules rouges du donneur ou du receveur respectivement ; ces anticorps étant susceptibles d être responsables d une réaction immunitaire (Tocci, Ewing, 2009 ; Tocci, 2010). Le cross-match n identifie pas toutes les incompatibilités sanguines et en particulier les incompatibilités qui pourraient exister entre des antigènes des protéines plasmatiques, des leucocytes ou des plaquettes. Le cross-match majeur recherche des anticorps dirigés contre les antigènes des GR du donneur, dans le sérum du receveur. Le cross-match mineur recherche des anticorps dirigés contre les antigènes des GR du receveur, dans le sérum du donneur (Figure 11). Le cross-match est toujours recommandé si une réaction hémolytique est notée durant une première transfusion, si plus de 4 jours s écoulent entre une première et une deuxième transfusion ou si l historique transfusionnel n est pas connu. Chez le chat, le cross-match est indispensable si le groupage sanguin AB n a pas pu être effectué. Il est vivement conseillé avant toute transfusion, même si le groupage AB a été fait, à cause de l identification d antigènes comme Mik pour lesquels il existe des anticorps naturels. En médecine humaine, le cross-match a été décrit pour la première fois en 1907 et a été modifié plusieurs fois. Historiquement, le cross-match est mis en place par une procédure manuelle qui comprend une étape de lavage et une étape d incubation. L opération est chronophage et l interprétation est opérateur dépendante. La plus grande évolution réside en l apparition de techniques rapides, en tube puis sur gel (Tocci et Ewing, 2009). D autres améliorations techniques ont été également apportées au cours des années comme l utilisation de protéines, d enzymes et d anti-globulines plus adaptées et plus spécifiques. Le gel permet aux agglutinats d être retenus dans une matrice alors que les cellules libres sont entraînées vers le fond. Ceci permet une interprétation relativement aisée de la compatibilité et les gels peuvent être conservés pour archivage et traçabilité. De plus, la méthode sur gel utilise un volume de sang moindre que le cross-match standard et peut être utilisée même si le patient auto-agglutine. Le principal inconvénient par rapport à la méthode classique reste son coût à l achat (Weltman et al., 2014). a. Cross-match majeur Le cross-match majeur évalue les réactions entre les globules rouges du donneur et les anticorps éventuellement présents dans le plasma ou le sérum du receveur. Le but de ce test est de prévenir les transfusions incompatibles qui pourraient induire des réactions hémolytiques à médiation immune. Les globules rouges du donneur sont incubés avec le sérum du receveur. Si une 42

45 réaction d agglutination ou d hémolyse est observée, alors une incompatibilité existe et le sang de ce donneur ne doit pas être utilisé pour la transfusion. En effet, tout bénéfice de la transfusion est perdu et les réactions post-transfusionnelles peuvent être sévères et menacer la vie du receveur. Si aucune réaction n apparaît, le cross-match est dit compatible et les globules rouges peuvent être utilisés. b. Cross-match mineur Le cross-match mineur permet de rechercher la compatibilité entre le plasma ou le sérum du donneur et les globules rouges du receveur. La transfusion de produits sanguins contenant du plasma (sang total, plasma frais congelé) peut potentiellement entraîner une destruction des globules rouges du receveur si le donneur possède des allo-anticorps dirigés contre les antigènes érythrocytaires du malade. Un cross-match mineur incompatible est une moindre contreindication : les réactions occasionnées sont moins graves du fait de la dilution des anticorps du donneur dans le sang du receveur. Le cross-match mineur ne s impose pas si du culot globulaire est transfusé au patient. Des cross-matchs majeur et mineur compatibles ne garantissent pas la survie des globules rouges ou l absence de risque lors de la transfusion. Les réactions retardées ou celles avec les leucocytes du donneur ou les protéines plasmatiques ne peuvent pas être évitées grâce au crossmatch. 43

46 Donneur Receveur Centrifugation, préparation d une solution de GR à 2-4 % Conservation du sérum GR donneur GR receveur Sérum receveur Sérum donneur Crossmatch Majeur Crossmatch Mineur Figure 11 : Description du principe de cross-match 44

47 2. Pertinence du cross-match Une étude rétrospective (Weltman et al., 2014) conduite entre janvier 2000 et décembre 2010 a évalué l influence du cross-match majeur sur l efficacité transfusionnelle, en mesurant les taux d hématocrite après une administration de concentré globulaire. Dans cette étude, 209 chats ont reçu 233 culots globulaires compatibles AB comme traitement d une anémie. Parmi ces 209 chats, 173 ont reçu un total de 190 transfusions sans cross-match préalable et 36 ont reçu 43 transfusions avec cross-matchs majeurs compatibles. Un total de 91 cross-matchs ont été réalisés en contrôles pré-transfusionnels pour ces 43 transfusions. Les auteurs ont conclu qu une transfusion de sang compatible AB (vérifiée par groupage) avec cross-match majeur compatible était accompagnée d une augmentation significativement plus importante de l hématocrite posttransfusionnel que des transfusions compatibles AB mais sans cross-match préalable. Des réserves sont tout de même à émettre car les cross-matchs ont été pratiqués chez des chats ayant reçu des transfusions antérieures et/ou souffrant d anémies chroniques. Leur taux d hématocrite était beaucoup plus bas. En médecine humaine, les tests pré-transfusionnels sont plus développés qu en médecine vétérinaire. Les tests de routine consistent en une identification du groupe sanguin suivie d une recherche d anticorps. Le test à l anti-globuline indirect est pratiqué en exposant le plasma ou le sérum du receveur à une solution au pouvoir antigénique connu. Il est considéré comme le test de dépistage d anticorps le plus fiable. De plus, des cross-matchs manuels sont recommandés pour la transfusion humaine si le receveur a, récemment ou par le passé, présenté des anticorps ou si les tests de dépistage ne sont pas disponibles. En conclusion, le cross-match est indiqué pour toutes les transfusions chez le chat jusqu à ce qu un test précis de dépistage des anticorps équivalent au test à l anti-globuline indirect soit disponible. Le résultat de cette étude renforce la justification du cross-match avant transfusion chez le chat (Weltman et al., 2014). C. Le back-typing Il permet de confirmer les résultats obtenus lors des groupages en mettant en évidence la présence d allo-anticorps naturels dans le sérum des chats. Le sérum est testé avec des hématies de groupe connu (Proverbio et al., 2011). La réaction d agglutination est plus intense lorsque des sérums de chats de groupe B sont testés avec des GR de groupe A que lorsque des sérums issus d individus de groupe A sont testés avec des GR de groupe B. Aucune agglutination n est observée lorsque des sérums de chats de groupe AB sont testés avec des GR de groupe A ou de groupe B. En effet, les sérums AB ne contiennent pas d anticorps. L intensité de l agglutination lors de back-typing est un critère supplémentaire pour confirmer le groupe sanguin d un animal. 45

48 D. Erreurs de groupage Si les hématies du patient agglutinent avec tous les réactifs, il faut distinguer un groupe AB d un faux positif. En effet, ceci peut se produire en cas de formation de rouleaux par pseudoagrégation ou lorsqu il existe une agglutination à froid, une coagulation par de la fibrine ou la présence d anticorps allergiques. Avec la technique par immunochromatographie, l autoagglutination n entraîne aucune migration, le test est non réalisable. Il faut alors laver les globules. Au contraire, si aucun réactif n entraîne d agglutination, on peut supposer un mauvais état de l échantillon (hémolyse, antigène soluble ou encore un taux d antigène faible chez certains chats FeLV positifs). La bande de contrôle C dans les tests par immunochromatographie permet de vérifier qu une agglutination est présente. E. Test génétique La découverte du polymorphisme de la CMAH (Bighignoli et al., 2007) lié au groupe B a permis le développement d une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) disponible commercialement. Ceci permet d identifier les génotypes AA, Ab et bb en ciblant le nucléotide G139A (SNP) qui est associé avec l allèle b. Plus récemment, une étude de l Université du Missouri met en évidence l existence d un polymorphisme rare de la CMAH, notamment un SPN C136T au niveau de l exon 2. Cette nouvelle découverte pourrait expliquer les discordances parfois rencontrées en utilisant la mutation G139A (phénotype B avec génotype Ab par exemple). D autres projets de séquençage de la CMAH sont nécessaires pour déterminer l ensemble des polymorphismes associés aux différents groupes sanguins. Ainsi, des tests plus précis basés sur la PCR pourront être développés. Une étude a étudié la concordance entre le phénotype et le génotype (Tasker et al., 2014). Tableau V : Interprétation du génotype et résultats d après (Tasker et al., 2014) Position sur la CMAH Nucléotides présents sur chaque allèle C136T G139A Génotype Nombre de chats CC GG AA 59 CC GA Ab (G139A) 38 CT GG Ab (C136T) 1 CC AA bb (G139A) 10 TC GA bb (C136T et G139A) 4 46

49 Les premiers résultats de phénotypes dans cette étude sont en accord avec le génotype dans 107 cas sur 112 (96 %). Le test de génotypage de la CMAH inclut à la fois C136T et G139A comme cible pour le pyroséquençage (Tableau V). Si le C136T n avait pas été pris en compte dans le génotypage, cela se serait traduit par cinq erreurs de génotypage, notamment le génotypage de chat bb comme Ab qui est une des conséquences de l omission de C136T. Ceci entraînerait une mauvaise prédiction du phénotype pour ces chats. Dans cette étude, pour deux des cinq chats dont le phénotype n était pas en accord avec le génotype, l hypothèse d une erreur de phénotypage (groupage) a été émise ; ils avaient été groupés B. Ces deux chats avaient en fait des génotypes correspondant à des chats de type A ou AB, et après réalisation de cross-match, ils correspondaient effectivement à des chats de type A ou AB. Les trois autres incohérences concernaient uniquement des chats considérés comme étant de phénotype B. Aucun de ces 3 chats ne montrait d incompatibilité lors de cross-match avec du sang B de référence, ce qui suggérait qu ils étaient bien de phénotype B. Ces chats avaient vraisemblablement une nouvelle mutation inconnue sur la CMAH, ce qui affectait l allèle A et produisait un vrai génotype bb et une absence d expression de la CMAH et de l activité enzymatique. D autres séquençages des exons de la CMAH ont été réalisés sans pouvoir expliquer ce phénotype B. Malgré la bonne cohérence rapportée entre le génotype et le phénotype dans cette étude, l utilisation du génotypage présente tout de même des limites ; par exemple, pour différencier un phénotype A d un AB. Mais il peut être intéressant pour les éleveurs de chats afin d identifier les porteurs de l allèle b et ainsi prévenir l apparition de maladie hémolytique. Il est aisé pour eux de collecter des écouvillons buccaux comme source d ADN pour réaliser le test génétique. 47

50 IV. EPIDEMIOLOGIE DES GROUPES SANGUINS Le type A est le plus représenté des groupes sanguins félins et la fréquence du groupe B varie en fonction de la race et de la zone géographique. Le type AB n est que rarement rencontré, avec une fréquence souvent inférieure à 1 % (Day, 2012). A. Répartition en fonction du lieu géographique De nombreuses études ont été menées depuis la découverte des groupes sanguins pour évaluer leur prévalence dans différents pays. La distribution des groupes sanguins chez les chats sans pedigree varie géographiquement d un pays à l autre et même régionalement. Aux Etats-Unis, la fréquence des groupes A ou B chez les chats domestiques varie également en fonction des régions. La fréquence du groupe A est de 98 % à l échelle du pays mais supérieure à 99 % dans le nord-est et de % sur la côte ouest (Giger et al., 1991). En Australie, pour les chats sans pedigree, le pourcentage de groupe B est élevé, atteignant 24 % à Brisbane et 36 % à Sydney (Malik et al., 2005). Dans une étude réalisée à Pékin (Zheng et al., 2011), les auteurs ont groupé, avec la méthode standard d agglutination sur tubes, 262 chats domestiques (pures races exclues, 111 chats d intérieur, 151 chats d extérieur). Ils ont trouvé 88,2 % de chats de groupe A ; 11,4 % de chats de groupe B et 0,4 % de chats de groupe AB. La fréquence du groupe B à Pékin est relativement haute et assez similaire à celle rapportée globalement en Asie. Cette étude permet d évaluer le risque d hémolyse aigüe associée à une transfusion sans groupage préalable. Dans cette étude, le risque d hémolyse était de 20,2 % si, ni le donneur, ni le receveur, n étaient groupés et ce risque se réduisait à 11,4 % si seul le donneur était groupé et qu il était du groupe A. Les chiffres présentés dans le tableau VI ne présentent que des enquêtes réalisées sur des chats domestiques (Européens) à poils longs ou à poils courts, qui n appartiennent à aucune race référencée. Aucune différence n a pu être observée en fonction de la longueur du poil. Ce panel montre que certains pays, comme la Hongrie, par exemple, ne comptent que des chats A (Bagdi et al., 2001) alors qu en Australie, Nouvelle Zélande, Grèce et Sud Est de l Angleterre, les chats B sont bien représentés. 48

51 Tableau VI : Répartition géographique des groupes sanguins félins Pays Type A (%) Type B (%) Type AB (%) Taille de l échantillon Référence Allemagne 98,7 1,1 0,2 - (Weingart et al., 2006) Angleterre (Sud-est) 67,0 31,0 2,0 105 (Forcada et al., 2007) Australie (Sydney) 73,3 26,3 0, (Malik et al., 2005) Brésil (Rio de Janeiro) 94,8 2,9 2,3 172 (Medeiros et al., 2008) Canada (Montréal) 95,2 4,4 0,5 207 (Fosset, Blais, 2014) Chine (Pékin) 88,2 11,4 0,4 262 (Zheng et al., 2011) Danemark (Copenhague) (Jensen et al., 1994) Ecosse* et nord de l Angleterre 87,6 8,0 4,4 139 (Knottenbelt, Addie, et al., 1999) Espagne (Barcelone) 94,0 5,0 1,0 100 (Ruiz de Gopegui et al., 2004) Etats Unis* 99,7 0, (Giger et al., 1991) Grèce* 78,3 20,3 1,4 207 (Mylonakis et al., 2001) Hongrie* (Bagdi et al., 2001) Italie (Milan et Pérouse) 92,3 5,1 2,6 195 (Spada et al., 2014) Nouvelle Zélande* (2 Gribbles laboratoires VP (Cattin, 2015) différents) NZVP 89,1 10,3 0,3 156 Lisbonne 97,5 2,1 0,4 515 (Marques et al., 2011) Portugal Nord du Portugal 90,3 3,8 5,9 185 (Silvestre-Ferreira et al., December 1, 2004b) Suisse* 99,6 0, (Hubler et al., 1993) Turquie* 73,1 24,6 2,3 301 (Arikan et al. 2006) (*) l étude concerne des chats à travers l ensemble du pays. Ainsi, il est impossible de préjuger du groupe sanguin d un chat en fonction de sa race, ou même de son origine. Par ailleurs, il est à relever que peu d études récentes ont été réalisées sur la prévalence en France. 49

52 B. Répartition en fonction de la race Les plus grandes variations de fréquence sont observées entre les différentes races pures, probablement comme conséquence de la sélection génétique faite par les éleveurs. En effet, la fréquence du type B peut atteindre 25 à 50 % dans certaines races telles que le Turc de Van, l Angora Turc, le Rex Cornish et le Devon Rex (Arikan et al., 2003 ; Arikan et Akkan, 2004). Au contraire, dans certaines races comme le Siamois et le Burmese, l allèle b ne semble pas exister (Forcada et al., 2007). Ces chiffres semblent être similaires à travers le monde mais peuvent varier selon les élevages qui sélectionnent certains groupes sanguins. Le tableau VII regroupe différentes études de prévalence par race. Néanmoins, les effectifs dans certains cas (7 chats au maximum pour le Persan) font que ces chiffres doivent être interprétés avec précaution et ne doivent pas être considérés comme une généralité. 50

53 Tableau VII : Répartition des groupes sanguins en fonction de la race RACE Type Type Type Nombre A % B % AB % de chats Pays Référence Australie (Barrs et al., 2009) Abyssin Australie (Malik et al., 2005) Hongrie (Bagdi et al., 2001) Angora turc 53,6 46, Turquie (Arikan et al., 2003) (Gunn-Moore et al., GB Bengal 2009) GB (Forcada et al., 2007) Burmese GB (Forcada et al., 2007) Chartreux 77,8 18,5 3,7 27 Allemagne (Weignart et al. 2006) GB (Forcada et al., 2007) Australie (Malik et al., 2005) Persan (Silvestre-Ferreira et Portugal al., December 1, 2004b) 66,6 33,3 0 - Hongrie (Bagdi et al., 2001) Ragdoll Australie (Malik et al., 2005) GB (Forcada et al., 2007) Australie (Malik et al., 2005) Siamois (Silvestre-Ferreira et Portugal al., December 1, 2004b) Hongrie (Bagdi et al., 2001) Somali Australie (Barrs et al., 2009) 71,4 23,8 4,8 21 Allemagne (Weingart et al. 2006) Turquie (Arikan et al., 2003) Turc Van (Arikan et Akkan, 42,3 57, Turquie 2004) 51

54 V. EXISTE-T-IL UN AUTRE SYSTEME CHEZ LE CHAT? La plupart des autres espèces animales possède de nombreux systèmes de groupes sanguins avec de nombreux antigènes. L homme possède plus de 100 facteurs de groupes sanguins répartis en 14 systèmes. Chez les bovins, actuellement plus de 80 facteurs et 12 systèmes sont connus. Chez le chat et chez le chien, en comparaison, un faible nombre de groupes sanguins est actuellement connu et étudié. Des incompatibilités sanguines, qui n étaient pas en relation avec le système AB, ont été suspectées lors de la réalisation de cross-match en routine ou lors de réactions d hémolyse après transfusion. A. Travaux lyonnais En 2003, le travail de thèse vétérinaire de R. Marin (Lyon, 2003) s appuyant sur les précédents travaux de G. Ferrand, qui avait constaté des réactions d agglutinations entre chats A, a cherché à démontrer de nouvelles spécificités érythrocytaires félines (Marin, 2003). L existence d un autre système chez des chats jamais transfusés et de même groupe dans le système AB, a été suspectée lorsque ces individus présentaient des agglutinations entre leurs sérums et leurs GR. Marin et al. ont nommé ce nouveau groupe «X». Les chats de même groupe dans le système AB et ne montrant pas d agglutination entre eux appartenaient au groupe «Y». Sur les 586 animaux testés, 480 (81,9 %) étaient de groupe Y et 106 (18,1 %) de groupe X. Ils ont constaté une proportion importante d individus Y (AY ou BY). De plus, les systèmes XY et AB apparaissaient comme indépendants. B. Travaux de l Université de Pennsylvanie En 2007, l équipe de U. Giger à l Université de Pennsylvanie a réalisé une étude en émettant l hypothèse de la présence d allo-anticorps naturels contre un nouvel antigène sanguin chez des chats qui n avaient jamais été transfusés auparavant (Weinstein et al., 2007). Dans cette étude, des chats donneurs de sang et non donneurs ont été évalués pour la présence d auto et d allo-anticorps en réalisant des cross-matchs majeurs et mineurs. Ces chats ont également été groupés pour le système AB félin. Les méthodes de groupage utilisées étaient les tests sur tubes standard et sur colonnes en gel. Sur les 65 chats de groupe A, 3 chats (nommés donneurs 1, 2, 3) présentaient des incompatibilités lors de cross-matchs entre leurs sérums et des érythrocytes de groupe A. Ces cross-matchs auraient normalement dû être compatibles. Parallèlement, les plasmas et les GR des donneurs 1, 2, 3 ont fait l objet de cross-matchs entre eux. Ces cross-matchs étaient tous 52

55 compatibles. Ceci indique que ces chats possédaient un allo-anticorps contre un antigène érythrocytaire et eux-mêmes ne possédaient pas cet antigène. Celui-ci a été nommé Mik car le donneur 1 s appelait Mike. Il existe ainsi des chats Mik positifs qui possèdent cet antigène et les chats Mik négatifs qui ne le possèdent pas mais qui ont des allo anticorps naturels anti-mik pouvant entraîner des réactions transfusionnelles. L antigène Mik est également exprimé sur les globules rouges de groupes B et AB. L antigénicité ainsi que le niveau d expression de Mik sont encore mal connus. De nombreuses questions restent sans réponse quant à l existence d autres antigènes que ceux du système AB : antigénicité et risque transfusionnel, mode de transmission, prévalence, distribution géographique. A l heure actuelle, la principale conséquence de la connaissance de l existence de nouveau système est de souligner l importance de la réalisation de cross-matchs. D autres systèmes sanguins félins existent probablement et restent à explorer. 53

56 VI. IMPORTANCE CLINIQUE DU SYSTEME A/B/AB A. Iso-érythrolyse ou maladie hémolytique néonatale 1. Définition La maladie hémolytique néonatale se retrouve dans différentes espèces : Homme, cheval, chien, porc et chat. Elle est caractérisée par une destruction immune de la lignée rouge chez le nouveau-né. Le premier cas de maladie hémolytique néonatale féline (ou isoérythrolyse néonatale féline) est décrit en 1985 dans une étude anglaise (Cain et Suzuki, 1985). Ce terme décrit chez des chatons, une hémolyse causée par l ingestion des allo-anticorps maternels anti-a et anti-b contenus dans le colostrum de la mère. Le type endothéliochorial du placenta félin empêche le passage transplacentaire de ces allo-anticorps maternels pendant la gestation (à la différence de l espèce humaine). Ainsi, les signes de la maladie hémolytique néonatale n apparaissent dans l espèce féline qu après la naissance. Les allo-anticorps colostraux traversent la barrière intestinale pendant les deux premiers jours post-partum (Silvestre-Ferreira et al., 2010). Ce sont plus particulièrement les allo-anticorps anti-a des mères de groupe B qui conduisent à l hémolyse chez les chatons de groupe sanguin A, car ils sont en quantité plus importante et avec une antigénicité plus forte. Les anticorps maternels anti-a de la mère sont dirigés contre les antigènes A présents à la surface des hématies du chaton : les hématies sont alors détruites massivement au niveau intravasculaire ou au niveau extravasculaire dans le foie ou la rate. Le risque de maladie hémolytique néonatale dans l espèce féline varie de 0 à 25 % selon la prévalence de l allèle. Récemment, la proportion d accouplements à risque de développer une isoérythrolyse néonatale chez des chats domestiques a été calculée à 23 % à Sidney (Malik et al., 2005) et à 18,6 % en Turquie (Arikan et al., 2006a). De même, une étude américaine chez des chats Persans et Abyssins a évalué ce risque à respectivement 14 % et 25 % (Giger et al., 1991). 2. Pathophysiologie Comme évoqué précédemment, le type de placentation endothéliochoriale dans l espèce féline ne permet pas le transfert de l immunité passive au cours de la vie fœtale. En effet, quatre barrières séparent le sang maternel du sang fœtal : l endothélium de la mère, le syncitium chorial, le mésenchyme allantoïdien et l endothélium du fœtus. Les IgG ne passent qu en très faible quantité et sont indétectables chez le chaton à la naissance (Casal et al., 1996). Les autres immunoglobulines sont trop volumineuses pour passer la barrière placentaire. En l absence de 54

57 stimulation, les fœtus félins ne synthétisent pas d immunoglobulines. En revanche, des IgG et IgM sont déjà présentes dans les lymphocytes de la rate chez le chaton nouveau-né. Le colostrum seul assure l immunité passive chez le chaton (il transmet 90 % des immunoglobulines). Il représente la sécrétion accumulée par la glande mammaire lors du troisième tiers de gestation. C est la première des secrétions de la glande mammaire après la naissance. La production mammaire se modifie rapidement pour atteindre une composition de lait entre 24 et 48 heures après la mise-bas et la fin de la première semaine de lactation. Le colostrum est une riche source d immunoglobulines et de nutriments qui constitue l arsenal immunitaire principal du nouveau-né. Les immunoglobulines présentes dans le colostrum et éventuellement le lait de la mère ne peuvent être absorbées que dans les premières heures de vie du chaton (entre 12 h et 48 h selon les publications) lorsque la barrière digestive est encore perméable. Par la suite, les anticorps sont détruits lors de la digestion. Si les anticorps transmis sont dirigés contre les antigènes de surface des GR du chaton, le système réticulo-endothélial va entraîner une hémolyse intravasculaire et extravasculaire. Les symptômes sont plus ou moins importants, parfois même absents. Cela dépend de la concentration en anticorps du colostrum, de la quantité absorbée et de la qualité de son absorption. Ainsi, l expression clinique peut être variable au sein d une même portée ou entre différentes portées chez une même femelle. Les cas d iso-érythrolyse néonatale jusqu ici rapportés ne concernaient que des mères de groupe B et des chatons de groupe A ou AB. Les chats de groupe B ont un titre en anticorps anti-a plus fort, permettant d atteindre un titre dans le colostrum suffisant pour déclencher la maladie. Inversement, les titres en anticorps anti-b chez les individus de groupe A semblent être trop faibles pour aboutir à une iso-érythrolyse néonatale. Les portées à risque sont issues d accouplements de femelles de groupe B, donc de génotype B/B avec des mâles A pouvant être de génotypes AA, Aa ab, Ab ou des mâles AB (Tableau VIII). Tableau VIII : Génotypes, phénotypes et érythrolyse néonatale Mâle Génotypes, phénotypes et érythrolyse néonatale Femelle B (b/b) Phénotype A AB B Génotype ** Risque de maladie hémolytique important AA ou Aa ab ou Ab a ab a ab ou a ab b bb Ab ou a ab b ou b/b a ab b ou bb bb A** ou AB** ou B AB** ou B B 55

58 Il a également été décrit une nécrose de la queue. C est l activité agglutinante des IgM, exacerbée à faible température, qui est responsable d une agglutination des globules rouges à faible température qui obstruent les petits capillaires des extrémités et génère des lésions d ischémie et de nécrose des extrémités.. Chez les adultes, les parties du corps généralement touchées sont les oreilles, les pattes, le nez, le scrotum et le bout de la queue. Les chatons étant le plus souvent blottis contre leur mère, la seule localisation froide, et donc sensible, reste la queue. 3. Présentation clinique Les chatons peuvent montrer des signes cliniques dès l ingestion de colostrum jusqu à quelques jours après la prise colostrale. Certains meurent en quelques heures sans montrer de signes cliniques (Chabanne, 2004). Le symptôme le plus fréquemment observé et le plus précoce, est une urine rouge foncée qui indique une sévère hémoglobinurie. Les anticorps colostraux apportés entraînent une lyse des érythrocytes du nouveau-né causant anémie, protéinurie, néphropathie et coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Un ictère, des muqueuses pâles, une tachypnée, une tachycardie, un collapsus cardio-vasculaire, une acidose métabolique secondaire et une hypoglycémie due à l anorexie peuvent apparaître (Tableau IX). Les chatons survivants peuvent développer une nécrose du bout de la queue, l extrémité tombant entre trois jours et deux semaines. Les chatons de groupe A issus d une mère de groupe B naissent en bonne santé et tombent malades seulement après l absorption du colostrum, dans les premières heures de vie ou les premiers jours (Silvestre-Ferreira et al., 2010). Dans les heures qui suivent la naissance, trois évolutions sont possibles : - Evolution suraigüe : la mort n est précédée d aucun symptôme particulier, excepté un arrêt de la tétée dans les dernières heures. L autopsie ne révèle souvent aucune anomalie macroscopique. - Evolution aigüe : la mort survient après quelques jours d évolution, la tétée s arrête et une hémoglobinurie visible se développe. L autopsie peut ne révéler qu un ictère. - Evolution subaigüe : une faiblesse, une anorexie passagère, une perte de poids peuvent être les seules manifestations de l iso-érythrolyse néonatale et conduire parfois à la mort d un chaton. Le diagnostic d iso-érythrolyse néonatale peut alors n être ni envisagé, ni confirmé. Ces cas sont alors regroupés au sein de l entité fadding kitten syndrome (syndrome de dépérissement du chaton). Ces trois évolutions peuvent être observées dans une même portée ou entre différentes portées issues d une même mère. Comme décrit dans le paragraphe précédent, des différences dans l absorption du colostrum, dans le titre en IgG du sérum maternel, à l excrétion des IgG dans le colostrum maternel et la résistance du chaton pourraient être responsables de ces expressions cliniques variables. 56

59 Tableau IX : Symptômes de la maladie hémolytique d après (Silvestre-Ferreira et al., 2010) Réactions Non spécifiques Arrêt de la tétée Mort soudaine Signes cliniques Sévères Survivants Hémoglobinurie Ictère Anémie Faiblesse mort Diminution de l oxygénation Léthargie Tachycardie Tachypnée Anorexie Hypoglycémie Acidose Nécrose de la queue 4. Diagnostic Le diagnostic repose sur des signes cliniques et est conforté par le groupage sanguin de la mère et du chaton. Si le groupage n est pas possible, un test de compatibilité peut être réalisé. Quand un cross-match entre le sérum/plasma de la mère et les GR du chaton est incompatible, une isoérythrolyse néonatale doit être suspectée. Les chatons atteints de maladie hémolytique néonatale présentent un test de Coombs positif qui confirme le mécanisme immunologique de l affection. Si une maladie hémolytique est suspectée, tous les chatons doivent être groupés. A la naissance, du sang ombilical peut être utilisé pour grouper les chatons avec des tests simples comme ceux utilisant l immunochromatographie (Silvestre-Ferreira et al., 2010). 5. Traitement Le traitement doit être agressif et immédiat. Le chaton doit être séparé immédiatement de sa mère et être alimenté avec du colostrum d une autre chatte de groupe A ou AB. Si l état clinique se détériore, un traitement support des fonctions vitales (oxygène, couveuse chauffée, fluidothérapie) doit être mis en place ; une transfusion sanguine peut être nécessaire si l anémie est sévère ou s aggrave. Il est conseillé de transfuser 2 à 3 ml de GR cellules durant les trois premiers jours de vie. 57

60 Certaines précautions sont à prendre dans cette pratique transfusionnelle. Le chaton A ou AB ne possède pas encore ses propres anticorps anti-b. En revanche, dans le sang du chaton atteint de maladie hémolytique néonatale, sont présents les anticorps colostraux anti-a transmis par la mère. Une transfusion de GR de groupe A apporterait alors des GR susceptibles d être détruits par ces anticorps anti-a. Ainsi, le meilleur donneur dans cette situation est la mère, qui est de groupe B, mais dont les GR ne vont pas être détruits par des anticorps anti-b, puisque le chaton n en a pas encore. Cependant, il faut éliminer le plasma car il contient des anticorps anti-a. C est pourquoi il est recommandé de transfuser un culot globulaire avec des GR idéalement lavés. Les GR peuvent être transfusés par voie intramédullaire (avec une aiguille de 1,2 mm de diamètre (18G) implantée dans la fosse trochantérique). De cette manière, environ 90 % des érythrocytes sont dans la circulation sanguine en dix minutes. En raison de la courte durée de vie des cellules transfusées et de la destruction des cellules du chaton, l anémie peut s aggraver et une nouvelle transfusion peut être nécessaire. Le chaton commence à former ses propres anticorps anti-b rapidement après la naissance et les anticorps maternels du colostrum commencent à diminuer. Ceci explique que si une nouvelle transfusion est nécessaire après 3-4 jours post-partum, il faut utiliser du sang (idéalement culot globulaire) de groupe A (Silvestre- Ferreira et al., 2010). Tableau X : Résumé du traitement en cas de maladie hémolytique Les 4 étapes essentielles du traitement adapté de (Silvestre-Ferreira et al., 2010) 1. Séparer la mère de ses petits ; 2. Remplacer le colostrum maternel par du colostrum frais ou congelé provenant d une femelle compatible (A ou AB). En l absence de colostrum, du lait d une nourrice en lactation ou un lait maternisé peut être utilisé ; 3. Réaliser des soins de support durant les premiers jours pour faciliter au maximum la récupération du nouveau-né (O2, réchauffement, fluides, alimentation assistée ) 4. Réaliser une transfusion si une anémie sévère s installe. Utiliser les hématies (culot globulaire) idéalement lavées de la mère pour la première transfusion. Puis utiliser un donneur de groupe A si une seconde transfusion est nécessaire 3-4 jours après la première transfusion. 58

61 6. Prévention La prévention de cette maladie nécessite une sélection rigoureuse des chats pour l élevage, par un groupage sanguin systématique. Le mariage entre une femelle de groupe B et un mâle de groupe B donne une portée uniquement composée de chatons B parce que les chats B sont homozygotes. Si un accouplement entre une femelle B et un mâle A est vraiment souhaité, le meilleur moyen de prévenir la maladie est de retirer les chatons de la mère pendant 24 à 48 heures après la naissance. Le colostrum de la mère peut être remplacé par le colostrum congelé d autres mères. Points clefs de la prévention 1. Connaître le groupe sanguin des deux parents et/ou réaliser un cross-match préalable au mariage 2. Eviter les mariages femelle B/ mâle A ou retirer les femelles B de la reproduction 3. En cas d incompatibilité mâle/ femelle, retirer les chatons de la mère durant les premières heures de vie et envisager une voie de transfert d immunité passive alternative («nourrice», colostrum congelé ou sérum) B. La Transfusion sanguine La transfusion s est beaucoup développée chez le chat ces dernières années. La connaissance des groupes sanguins félins et la maîtrise des techniques de groupage permettent d en optimiser les conditions de sécurité. Si la transfusion permet de sauver des vies, elle n en comporte pas moins des risques. 1. Indications de la transfusion La principale indication pour une transfusion de sang total chez le chat est une baisse importante du nombre de globules rouges due à une hémorragie ou à une destruction rapide à médiation immune (Lanevschi et Wardrop, 2001 ; Rozanski et de Laforcade, 2004 ; Day, 2012 ; Davidow, 2013). Les causes d anémie les plus courantes chez les chats sont les hémorragies (saignements péri ou post-chirurgicaux, traumatismes, saignements gastro-intestinaux, phénomènes néoplasiques, thrombopénies primaires à médiation immune, coagulopathies), l anémie hémolytique primaire à médiation immune ou l absence d érythropoïèse. L anémie est 59

62 également présente dans certaines maladies infectieuses (FIV, FeLV, virus de la PIF) mais la transfusion est rarement réalisée sur ces patients. Dans l espèce féline, aux Etats-Unis (Castellanos et al., 2004), les principaux motifs de transfusion de sang total sont par ordre de fréquence : - une hémorragie (27 à 52 % des chats) liée la plupart du temps à un polytraumatisme (32 % des cas), moins fréquemment à une intoxication aux anticoagulants (8 %), à une rupture d hémangiosarcome ou à une hématurie liée à une affection du haut et du bas appareil urinaire. - une dysérythropoïèse (20 % des cas) consécutive à une panniculite (17,1 %), une maladie inflammatoire et/ou infectieuse telle une gastro-entérite, des abcès, une endométrite (17,1 %), une insuffisance rénale (14,3 %), une aplasie sélective de la lignée érythrocytaire (8,6 %), une hypoplasie des lignées érythrocytaire et mégacaryocytaire (8,6 %), une leucémie myéloïde (5,7%), une péritonite infectieuse (5,7 %), un lymphome intestinal (5,7 %), une infection par le FeLV ou le FIV. - une hémolyse (10 à 14 % des chats) due à une anémie hémolytique à médiation immune (46,2%), à une anémie à corps de Heinz (7,7 %), à une hypophosphatémie (15,4 %), à un lymphome (7,7 %) ou d origine indéterminée (23,1 %). - une hypoprotéinémie secondaire à une parvorirose (virus de la panleucopénie féline) dans 2,2% des cas. 2. Contre-indications Chez les animaux insuffisants cardiaques ou rénaux, la transfusion de concentré globulaire doit être préférée à la transfusion de sang total en raison du risque accru de surcharge volumique. Il est déconseillé d administrer à des animaux insuffisants hépatiques des produits sanguins conservés depuis plus de 2 semaines, du fait de l augmentation de l ammoniémie dans la poche au cours du stockage (Obrador et al., 2015). Une anémie hémolytique auto-immune ne justifie une transfusion que si les signes cliniques sont sévères et qu elle engage le pronostic vital. En effet, l anémie est due à des auto-anticorps dirigés contre les GR mais bien souvent la spécificité large de ces anticorps conduit à une incompatibilité de toute transfusion et donc à une durée de vie très limitée des hématies transfusées et une hyperstimulation du système immunitaire. De plus, l apport d hématies risque d inhiber la réponse médullaire d érythropoïèse. La transfusion sanguine est accompagnée d un risque mais, dans certains cas, elle seule permet de maintenir l animal en vie. L anémie hémolytique aiguë est cependant moins fréquente chez le chat que chez le chien. 60

63 3. Principe de la transfusion a. Collecte du sang i. Choix du donneur Les donneurs doivent être de grands chats adultes en bonne santé, n ayant jamais reçu de transfusion auparavant. Les auteurs recommandent un poids de 5 kg minimum. (Barfield et Adamantos, 2011). Ils ne doivent pas recevoir de traitements médicaux à l exception de ceux contre les endo- et ectoparasites. En effet, le traitement contre les tiques et les puces est primordial car ces parasites peuvent être les vecteurs d agents transmis au cours d une transfusion. Les donneurs doivent être à jour dans leurs vaccinations (typhus, coryza et leucose) (Goy-Thollot et Boisvineau, 2014). De préférence, sont recrutés des chats qui ne sortent pas afin de minimiser les risques de transmission de maladie mais ceci est bien souvent compliqué car il est déjà difficile de trouver des donneurs. Un bilan hématologique et biochimique doit être réalisé une fois par an pour les donneurs réguliers et avant chaque don pour les chats utilisés plus occasionnellement. Tableau XI : Critères du donneur Age Poids Santé Sexe Caractère Historique transfusionnel Traitement médical 1 à 8 ans >5kg, sans être gras Aucun signe clinique apparent, pas de diarrhée ou vomissement Mâle, femelle stérilisée, pas de femelle gestante Docile Aucun historique de transfusion Pas de traitement en cours, déparasité régulièrement Vaccinations à jour (typhus, coryza, leucose) Hématocrite >30 % Maladie infectieuse Testé FIV, FelV, Mycoplasma haemolfelis Testé contre les agents de bartonellose selon les zones géographiques (Wardrop et al., 2016) ii. Prélèvement Le volume sanguin total d un chat est d environ 66 ml/kg, 10 % de ce volume peut être prélevé sans voir apparaître d effets secondaires chez le donneur (Weingart et al., 2004). Néanmoins, des troubles ont pu être observés dans certains cas, notamment des chats souffrant de cardiomyopathie ou d insuffisance rénale non diagnostiquées auparavant. Le donneur présente 61

64 une diminution de la pression artérielle et/ou de l hématocrite par exemple. Le don de sang n est pas quelque chose d anodin et le donneur doit faire l objet d une surveillance après le prélèvement (couleur des muqueuses, fréquence cardiaque, fréquence respiratoire). Il peut parfois être nécessaire de les perfuser. Si les chats sont des donneurs réguliers (toutes les 3-4 semaines), une supplémentation en fer est conseillée. Une étude menée chez le chien montre qu un don tous les deux mois entraîne une diminution non négligeable des réserves en fer (Ferreira et al., 2014). Dans la plupart des cas, une sédation, voire souvent une anesthésie générale sont nécessaires. Il est très important que l anesthésie se fasse avec le moins de risque possible et avec un réveil rapide, sans effets secondaires, pour que les propriétaires volontaires des donneurs soient satisfaits (Goy-Thollot, 2014). En effet, c est sur cela que repose un bon programme de collecte de sang. Différents protocoles à base de kétamine, midazolam et butorphanol (KMB) par voie intraveineuse ou d inhalation de sévoflurane (induction plus rapide qu à l isoflurane) peuvent être utilisés. Une étude comparative de ces deux types de protocole (Killos et al., 2010) montre qu il n y a pas de différence significative en ce qui concerne la sévérité de l hypotension. Mais cette comparaison montre qu avec le protocole KMB, l hyperthermie apparaît fréquemment comme effet secondaire. Une collecte nécessite au minimum 3 personnes : une chargée de la contention, une de la compression veineuse et une effectuant le prélèvement. Si la structure ne dispose pas d un mélangeur, une personne homogénéise le sang avec l anticoagulant dans la poche de prélèvement. La ponction de la veine jugulaire est privilégiée. Figure 12 : Photographie présentant la technique de prélèvement Source : Siamu iii. Stockage Le but de la conservation sanguine est de fournir au patient des composés viables et fonctionnels. Ceci dépend essentiellement de la capacité à générer de l ATP à travers la glycolyse anaérobie (Day, 2012). Si le sang est administré dans la journée qui suit la collecte, une solution de citrate de sodium à 3,13 % peut être utilisée (1ml pour 9ml de sang). L utilisation d héparine présente de nombreux inconvénients : agrégation plaquettaire, 62

65 inhibition de la formation de thrombine et de l activation du facteur IX. Elle n a aucune propriété conservatrice. Pour ces raisons, elle n est pas recommandée pour la collecte sanguine et le stockage. Les anticoagulants utilisés en routine chez le chat sont : - l acide citrique dextrose (ACD) ; - le citrate phosphate dextrose (CPD) ; - le citrate phosphate dextrose adénine (CPDA1). Ce dernier est la solution de choix à raison de 1,2 ml pour 8,8 ml de sang. Dans la majorité des cas, le sang des chats est collecté dans des systèmes ouverts qui sont fait de composants individuels stérilisés au moment du don (épicranienne et seringue préparées avec un anticoagulant). Actuellement, les systèmes fermés, déjà prêts, ne sont pas encore très utilisés chez le chat en Europe. La société française ALVEDIA vient de mettre au point une poche adaptée au chat (Figure 13). La différence entre les deux types de système est importante. En effet, le risque de contamination bactérienne et d erreur de manipulation est plus important dans un système ouvert, ce qui n est pas négligeable si le sang est prélevé pour ensuite être stocké. Figure 13 : Photographie de la poche pour chat développée par ALVEDIA iv. Produits sanguins disponibles Le faible volume récolté et les difficultés de séparation des composants sanguins chez le chat font que les transfusions de sang total frais sont largement les plus pratiquées en médecine féline. Dans l idéal, la transfusion devrait être pratiquée après sélection des produits sanguins les plus adaptés à l affection de l animal ce qui peut permettre d éviter certaines réactions transfusionnelles. 63

66 Les produits sanguins les plus utilisés chez le chat sont le sang total, les concentrés globulaires et le plasma frais ou congelé (Castellanos et al., 2004). Le sang total et les concentrés globulaires sont stockés au réfrigérateur à 4 C. Il est vivement conseillé de disposer d un réfrigérateur dédié pour maintenir une température constante. La durée maximale optimale de stockage conseillée est de 21 jours. Les poches sont stockées plutôt verticalement et une homogénéisation douce deux fois par semaine est recommandée pour augmenter l exposition à la solution de conservation. Le plasma frais congelé ( fresh frozen plasma ou FFP, plasma séparé des globules rouges dans les 8h après prélèvement) et le plasma frais (FP, plasma séparé plus de 8 h après) doivent être conservés à -18 C pas plus d un an pour le premier et cinq pour le deuxième. On sait que le plasma canin contient de l albumine, des globulines, des facteurs de coagulation mais aucune étude n a encore pu le démontrer pour le chat. La transfusion de plaquettes n est que rarement nécessaire en médecine féline et, si c est le cas, on utilise alors du sang total car l obtention d une solution riche en plaquettes est difficile étant donné le faible volume de sang disponible. Tableau XII : Principales indications et conservations des différents produits sanguins Produits sanguins Sang total Concentré de globule rouge Plasma frais Plasma congelé Indications Pertes sanguines importantes : anémie, déficit en plaquettes, en facteurs de coagulation, hypo protéinémie, immunodéficience hémorragie entraînant un choc hypovolémique, leucopénie Anémie Coagulopathie, CIVD, hypoprotéinémie, immunodéficience Volume et vitesse d administration ml/kg 3-6 ml/min A moduler si pathologie cardiaque 6-12 ml/kg 3-6 ml/min Fréquence Toutes les 24h Toutes les 12 à 24 h Toutes les 8 à 12h Chez le chat, peu de données sont disponibles et elles sont souvent le résultat de transposition des méthodes pratiquées chez le chien. 64

67 b. Mise en place de la transfusion Avant toute transfusion, les GR sont remis en suspension et le sang est amené à température ambiante. L administration se fait ensuite par voie intraveineuse plutôt à la veine céphalique en utilisant un cathéter de 20 G (0,9 mm de diamètre). Le but de la transfusion est d augmenter l hématocrite suffisamment pour faire disparaître les signes d anémie. Le volume sanguin à administrer peut être calculé avec l équation suivante : Volume sanguin à transfuser = volume total de sang du patient [Ht souhaité (Ht du receveur)/(ht du donneur)] Ht : hématocrite Il existe différentes formules mais aucune n a réellement montré un avantage net par rapport aux autres chez le chat (Reed et al., 2014). Le clinicien doit avant tout évaluer les signes cliniques, seuls paramètres rationnels d appréciation du suivi et de l efficacité transfusionnelle. La transfusion doit être initiée lentement à 0,25mL/kg/h en utilisant un pousse-seringue si possible. Le débit peut être augmenté progressivement si aucune réaction n est suspectée dans les min (Goy-Thollot, 2014). Le débit peut varier en fonction de la raison de la transfusion (rapide en cas de choc hémorragique, par exemple) ou de l existence d une maladie sousjacente. Dans les cas d hémorragies sévères, le sang total peut être administré avec un débit plus élevé, mais des débits supérieurs à 20mL/kg/h sont à prescrire (Barfield, Adamantos, 2011). La transfusion doit être terminée en 4 à 6 h. Une surveillance rapprochée est nécessaire pour chaque transfusion. Avant de commencer la procédure, le receveur doit être consciencieusement examiné, la fréquence cardiaque et respiratoire, la couleur des muqueuses, le temps de recoloration capillaire et la température doivent être notés, ainsi que l hématocrite et le taux en protéine totale. Quand la transfusion commence, les constantes vitales doivent être rapportées toutes les 15 min durant la première heure (Annexe 2). Les veines jugulaires doivent également être observées avec attention, une distension peut être le signe d une surcharge volumique. Une auscultation thoracique peut permettre de déceler les signes d œdème pulmonaire liés à une surcharge. 4. Réactions transfusionnelles La transfusion permet de sauver des vies mais il faut garder à l esprit qu il existe d importants risques de réactions en transfusant des produits sanguins. Les réactions sont possibles avec tous les produits sanguins. Les réactions transfusionnelles correspondent à un ensemble de modifications métaboliques et immunologiques à l origine d effets indésirables chez le receveur pendant ou après la transfusion d un produit sanguin (Chabanne et al ; Chiaramonte, 2004). Chez un chat, 1 ml de sang incompatible suffit à provoquer une réaction transfusionnelle d hémolyse aiguë chez le receveur. Cela conduit à la mort dans 30 % des cas 65

68 (Hohenhaus, 2004). En 2005, une étude regroupant 126 transfusions de globules rouges chez le chat montre 8,7 % de réactions sévères (Klaser et al., 2005). Ces réactions peuvent être aiguës ou retardées, immunologiques ou non. Les plus graves sont les réactions hémolytiques aiguës qui ont beaucoup diminué ces dernières années grâce au développement de techniques de groupage fiables, simples et accessibles. a. Réactions immunologiques Les réactions immunologiques sont celles qui apparaîssent suite à une réaction antigène anticorps (Giger et Akol, 1990 ; Weingart et al., 2004 ; Godinho-Cunha et al., 2011 ; Davidow, 2012). i. Réactions hémolytiques Ce sont des réactions d hypersensibilité de type II impliquant des IgG ou des IgM. Les anticorps du receveur se lient aux antigènes des globules rouges du donneur et entraînent une destruction de ces globules rouges. Une réaction antigènes-anticorps impliquant des IgM active le complément et peut se produire dans les 5 minutes après la transfusion (Herring, 2015). Les manifestations sont les suivantes : hémolyse intravasculaire, hypotension, fièvre, tachycardie ou bradycardie, vomissement, défécation, faiblesse, dyspnée voire arrêt cardiaque. La transfusion doit alors être arrêtée et des investigations menées. Les groupes sanguins du donneur et du receveur doivent être vérifiés et des cross-matchs effectués. Il est important de voir si le receveur n a jamais été transfusé. Il est conseillé de faire un test de Coombs au receveur et une hémoculture chez le donneur car une réaction septique peut mimer une réaction hémolytique aiguë. Des soins de supports avec fluidothérapie et oxygénothérapie doivent être mis en place rapidement. Les réactions antigènes anticorps qui n activent pas le complément peuvent entraîner l augmentation de la phagocytose des globules rouges et conduire à une hémolyse extravasculaire. Les signes sont alors moins sévères mais on peut voir apparaître un ictère, de la fièvre ou une diminution inexpliquée de l hématocrite après transfusion. L utilisation de glucocorticoïdes pour les réactions transfusionnelles est controversée et ils ne sont actuellement pas employés en médecine humaine (en effet ils diminuent la réponse inflammatoire mais ne suppriment pas la production d IgG et IgM). 66

69 ii. Réactions fébriles non hémolytiques Ce sont des réactions assez fréquentes, identifiées par une augmentation de quelques degrés de la température 1 ou 2 h après transfusion. Elles sont causées par une réaction entre les anticorps du receveur et les antigènes leucocytaires et plaquettaires du donneur. Ces réactions sont considérablement réduites, si des filtres permettant une leucoréduction sont utilisés avant le stockage du sang (McMichael et al., 2010 ; McMichael, 2012). Ces études ont été menées chez le chien, mais aucune donnée n est disponible pour le chat. iii. Réactions allergiques Ce sont des réactions d hypersensibilité de type I qui peuvent également apparaître (Herring, 2015). Ces réactions sont médiées par des IgE ou des IgG préformées liées aux mastocytes ou aux polynucléaires basophiles. b. Réactions non immunologiques La plus importante est la surcharge volumique. Les produits sanguins sont naturellement des colloïdes et entraînent une augmentation importante de volume. Des œdèmes, une détresse respiratoire et une distension de la veine jugulaire peuvent être observés. Un sepsis peut se déclarer si du sang contaminé a été transfusé. L animal présente alors de l hyperthermie, une hypotension et une diminution de la glycémie. La transfusion peut être responsable de la transmission de maladies infectieuses bactériennes (hémobartonellose), virales (FeLV, FIV, PIF) ou parasitaires (toxoplasmose). Lors d insuffisance hépatique ou d une administration trop rapide du sang, il peut se produire une intoxication au citrate. Le citrate administré se lie au calcium, ce qui entraîne une hypocalcémie qui se manifeste par de la tétanie, des tremblements, de l hypotension et une arythmie cardiaque. Elle existe aussi si la proportion anticoagulant (contenant du citrate) / volume sanguin n est pas respectée. Une hyperammoniémie peut également se développer chez les patients insuffisants hépatiques ou ceux recevant une transfusion massive. En effet, des études ont montré que l ammoniémie augmente avec le temps lors du stockage des produits sanguins humains et canins (Obrador et al., 2015). Les accidents emboliques sont rares. Ils sont la conséquence d injection d air ou de caillots, notamment si la transfusion est réalisée sans filtre. En médecine humaine, des complications et un fort taux de mortalité peuvent survenir en cas de transfusion massive. Chez l Homme, sont décrits de l hypothermie, des déséquilibres acido- 67

70 basiques et électrolytiques, une toxicité au citrate et des lésions pulmonaires associées à la transfusion (Herring, 2015). Chez le chat, une étude décrit des transfusions massives et répétées chez 27 patients (Roux et al., 2008). Une transfusion massive est définie comme l administration de 60mL/kg et plus sur 24 heures ou 30mL/kg sur 3 heures. Des transfusions sont considérées comme multiples à partir de 3 au cours d une même hospitalisation. 16 chats ont survécu alors que 11 chats sont morts. Mais aucun signe de réaction transfusionnelle aiguë n a été observé dans l étude. Un seul chat a présenté des signes de surcharge volumique et 6 une hypocalcémie sans répercussion sur l état général. Le chat semble donc mieux supporter les transfusions massives et répétées que l homme. Tableau XIII : Principales réaction transfusionnelles Types de réactions Immunologique Non-immunologique Réaction pendant la transfusion Hémolyse Réactions avec leucocytes et plaquettes Hypersensibilité de type I Surcharge volumique Hyperammoniémie Coagulopathie Désordres électrolytiques Hypothermie Intoxication au citrate Réactions différées Hémolyse extravasculaire Purpura Transmission de maladie infectieuse Surcharge en fer Accidents emboliques c. Durée de vie des hématies post transfusionnelle La survie des globules rouges après transfusion de sang incompatible a été étudiée expérimentalement. Des érythrocytes de groupe B administrés à un chat de groupe A jamais transfusé auparavant ont une demi-vie de 2 jours. La même expérience avec des globules rouges de groupe A transfusés chez un chat de groupe B montre qu ils ont une demi-vie de seulement 1,3 heure. En seulement 24 h, toutes les cellules de groupe A sont détruites. Quand des érythrocytes de groupe A sont administrés à un chat B, de sévères signes cliniques apparaissent rapidement comme de l hypotension, une bradycardie, des apnées, des 68

71 vomissements et dépression. Un test de Coombs direct peut être positif après transfusion de sang incompatible à un chat B. La mort est présente dans 30 % des cas. 5. Xénotransfusion Les premières transfusions rapportées entre différentes espèces ont été réalisées par Jean Baptiste en Il administre du sang de veau à des chiens. Puis du sang de veau et d agneau fut transféré à des hommes (Kisielewicz et Self, 2014). La pratique de la transfusion sanguine évolua alors de façon dramatique jusqu à la découverte des groupes sanguins humains en Plusieurs études mettant en jeu des transfusions de sang de chien à des chats ont été rapportées dans les années 60 (Bovens et Gruffydd-Jones, 2013), une seule plus récemment (Gowan, 2004). Aucune réaction indésirable sévère n a été observée. En effet, les chats ne possèdent pas d allo-anticorps contre les antigènes érythrocytaires canins. Cependant, les anticorps se développent en 4 à 7 jours après la première transfusion comme le montre les réactions d agglutination et les tests d hémolyse in vitro positifs. La durée de vie des globules rouges transfusés est inférieure à 4 jours. Une nouvelle transfusion avec du sang de chien 6 jours après la première entraîne un choc anaphylactique dans plus de 66 % des cas (Bovens et Gruffydd- Jones, 2013). La xénotransfusion de sang de chien au chat doit vraiment être considérée dans des cas d extrême urgence lorsqu aucune autre alternative n existe, sous réserve que le chat n ait bien évidemment jamais reçu de sang de chien auparavant. Ceci peut permettre de gagner du temps pour mettre en place un diagnostic, une chirurgie ou encore collecter des produits sanguins plus appropriés. 6. Autotransfusion La récupération et la transfusion chez un chat de son propre sang peut être pratiquée dans une situation d extrême urgence (Rozanski et de Laforcade, 2004). Cette technique peut être mise en place quand l animal présente un épanchement dans une cavité (abdominale ou thoracique), mais pas si le sang est contaminé par de l urine, des bactéries ou de la bile, par exemple. Le sang est alors collecté dans la cavité de manière stérile et transfusé au patient en utilisant un filtre adapté et en ajoutant un anticoagulant (Higgs et al., 2015). 69

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73 Partie expérimentale : Etude épidémiologique de la répartition des groupes sanguins à l école vétérinaire de Lyon et évaluation du risque I. Objectifs de l étude De nombreuses études sur la prévalence des groupes sanguins dans divers pays ont été publiées ces dernières années comme le montre le Tableau VI de la première partie. En France, les seules publications existantes sont assez anciennes ou concernent une race en particulier (Bussiere, 2009). Cette étude a pour but d évaluer la répartition actuelle des différents groupes sanguins dans une population de chats ayant fréquenté le Campus vétérinaire de VetAgro Sup. Les données doivent permettre d évaluer le risque de réaction transfusionnelle ou d anémie hémolytique du nouveau-né en l absence de groupage et ainsi montrer l importance du groupage dans l espèce féline. Avec les découvertes récentes concernant le système de groupe sanguin et le nouvel antigène Mik, il est utile de montrer l importance et la complémentarité du cross-match avec les tests de groupages (incompatibilité transfusionnelle). La répétition de cross-match sur un grand nombre d animaux a pour objectif de mieux caractériser les particularités des groupes sanguins chez le chat et d investiguer les nouvelles spécificités érythrocytaires établies/supposées dans certaines études (Marin, 2003 ; Weinstein et al., 2007). Ce travail de thèse vise à compléter les données françaises sur la répartition des groupes sanguins dans l espèce féline, à montrer l importance du groupage associé aux tests de compatibilité, pour ainsi mieux conseiller vétérinaires et éleveurs sur le sujet. II. Matériel et méthode A. Animaux Cette étude est réalisée sur des chats «tout venant», aucun chat ne faisait partie d un élevage ou d une chatterie. Leur provenance peut être séparée en deux catégories : - des chats groupés par le SIAMU comme donneur ou receveur entre 2011 et 2013 en collaboration avec la société Alvedia. Ces données sont rétrospectives. - des chats d étudiants ou du personnel de VetAgro Sup et de clients du Centre Hospitalier d Enseignement Vétérinaire (SIAMU, Clinique de Pathologie de la Reproduction, consultations diverses) présentés pour des examens de routine entre 2014 et 2016 et 71

74 prélevés avec le consentement éclairé des propriétaires. Ces derniers ont été inclus dans l étude de prévalence et certains ont également été utilisés pour la réalisation de crossmatch. Une anamnèse rigoureuse était recueillie pour dépister toute affection immunitaire pouvant entraîner des agglutinations : - Les chats utilisés dans cette étude n ont jamais été transfusés auparavant. - Aucune maladie auto-immune n était rapportée chez ces chats. La plupart de ces chats vivaient à l extérieur et sont donc exposés à divers stimulations antigéniques. Le dépistage FIV/FeLV ou la recherche de parasites sanguins n ont pas été systématiques pour les chats de notre étude. B. Prélèvements et conservation des échantillons sanguins Le sang a été prélevé par ponction jugulaire avec des aiguilles de 23 G (0,6 mm de diamètre) et des seringues de 2,5 ml. Le sang a été placé dans un tube EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) en retirant l aiguille et le bouchon pour éviter toute hémolyse pouvant fausser les résultats du groupage ou du cross-match. Les volumes des échantillons étaient compris entre 0,7 et 2,5 ml. Les tubes ont ensuite été stockés à 4 C dans le réfrigérateur du SIAMU dédié à la banque de sang. Les groupages ont été effectués, avec la technique par immunochromatographie (Alvedia ) moins d une semaine après le prélèvement. Une fois le groupage effectué, s il restait suffisamment de sang, le tube EDTA était centrifugé (1300 g pendant 10 min). Le plasma était prélevé et conservé à -20 C. Chaque tube de plasma était identifié par un numéro qui permettait de connaître à quel chat il appartenait, son groupe sanguin et le volume total de plasma congelé (de 240 μl à plus de 700 μl selon les chats). Les plasmas ainsi congelés étaient utilisés par la suite pour la réalisation de cross-match. C. Groupage Les groupages sont réalisés en laboratoire avec le LabTest A+B Feline (procédure en annexe) qui utilise la même technologie par immunochromatographie que le Quick Test A+B Feline présenté dans la partie bibliographique. Le groupage s est déroulé selon les étapes suivantes : - Prendre une ou plusieurs bandelettes selon le nombre de chats à grouper ; - Ajouter 3 gouttes de tampon dans un tube à essai ; - Pipetter 10 μl de sang total bien homogénéisé au préalable ; 72

75 - Ajouter le sang au tube rempli de tampon et mélanger doucement ; - Déposer une bandelette dans le tube pour permettre la migration ; - Attendre jusqu à ce que la migration soit complète et que la ligne de contrôle soit visible pour interpréter le résultat. D. Cross-match Des échantillons de sang sur EDTA (de moins de 7 jours conservés à 4 C) de 11 chats d étudiants volontaires et du plasma congelé de 55 autres chats (45 chats de groupe A, 9 chats de groupe B et 1 chat de groupe AB) ont été utilisés pour réaliser un grand nombre de crossmatchs. Le tableau XIII résume les caractéristiques des 11 chats dont les GR ont été utilisés pour les cross-matchs. Les chats sont nommés selon la nomenclature suivante : Xy avec X le groupe sanguin du chat et y le numéro qui l identifie. Tableau XIV : Caractéristiques des chats du groupe test Chats Caractéristiques Groupe sanguin A1 Chat mâle européen castré, 2 ans A A2 Chat mâle européen castré, 2 ans A A3 Chat femelle européen stérilisée, 3 ans A A4 Chat mâle européen castré, 1 an A A5 Chat mâle européen castré, 1,5 an A A6 A7 Chat femelle européen stérilisée, 5 ans A Chat femelle européen stérilisée, 6 ans A B1 Chat mâle européen castré, 4 ans B B2 Chat femelle européen stérilisée, 4 ans B B3 Chat mâle européen castré, 3 ans B AB1 Chat mâle européen castré, 3 ans AB 73

76 1. Cross-match en gel La technique de cross-match en gel est adaptée du protocole utilisé en médecine humaine. Elle fait appel à une carte NaCl, enzyme test and cold agglutinin développée par le laboratoire DiaMed (désormais BioRad ), composée de six micro-tubes ou colonnes remplis d un gel à base de billes calibrées d acrylamide dextran sans ajout de réactif. Le gel forme un récipient dans lequel il est possible de constituer le mélange des réactifs (Weinstein et al., 2007). Après avoir centrifugé et séparé le plasma du culot globulaire sur tube EDTA, 10 µl de globules rouges sont remis en suspension dans 1 ml de LISS (Low Ionic Strength Solution) pour réaliser une solution de globules rouges à 0,9 %. La solution de LISS est utilisée pour potentialiser les réactions entre les anticorps et les GR. Dans chaque micro-tube, 25 μl de plasma et 50μL de suspension de globules rouges sont ajoutés. Les cartes sont laissées pour incubation dix minutes à 37 C. Puis les cartes sont centrifugées durant dix minutes dans une centrifugeuse (10 min à 80 g) spécialement conçue à cet effet et développée par le laboratoire DiaMed. Le cross-match est dit négatif ou compatible lorsque tous les GR passent à travers la matrice en gel. Il est dit positif ou incompatible lorsque les GR ne parviennent pas à passer à travers le gel. Souvent les études gradent la réaction d incompatibilité de +1 à +4. Dans notre étude le degré d incompatibilité n est pas décrit, un cross-match incompatible est noté «+» et un cross-match compatible «-». Des autocontrôles, c est-à-dire des incubations de GR avec le plasma du même animal, ont été systématiquement réalisés et se sont toujours révélés négatifs. Plusieurs manipulations sont effectuées selon ce protocole : 1) Les 11 chats pour lesquels nous disposions de sang frais ont tous été soumis à un crossmatch entre eux et les réactions utilisant leur propre plasma frais et congelé ont été comparées. 2) Les plasmas congelés de 45 chats de groupe A ont été testés avec les GR des 11 chats pour lesquels du sang frais est disponible. 3) Les plasmas congelés de 9 chats de groupe B et du chat de groupe AB ont été testés sur les GR des 11 chats pour lesquels du sang frais était disponible. 4) Des titrages par cross-match utilisant des dilutions successives de plasma ont été effectués pour les chats ayant montré des réactions positives lors des étapes tests 1, 2 ou 3 : - Le titrage des plasmas des chats de groupe B a été réalisé sur les GR des chats A5 et AB1. - Les titrages des plasmas des chats A11 et A35, ont été réalisés sur les GR des chats B1 74

77 2. Cross-match en bandelettes Des cross-matchs en bandelettes avec les anti-globulines félines de différents laboratoires sont réalisés afin d optimiser la sensibilité du test et de mettre en évidence des agglutinations non révélées par la technique précédente. Cette technique a été adaptée du cross-match chien en bandelette, commercialisé par la société Alvedia (LabTest XM Canin ). Comme pour le cross-match en gel, on utilise les GR d un chat et le plasma d un autre. Dans un tube à hémolyse, on ajoute 3 gouttes de tampon de suspension et 10μL de culot globulaire. Cette suspension est complétée par 120 μl de plasma d un autre chat. Le tout est agité doucement et laissé à incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, 3 ml de PBS sont ajoutés et le tube est centrifugé 2 minutes à 1000 g. Le surnageant est rejeté et l étape de lavage est répétée deux fois de plus. Deux gouttes de tampon de migration sont ajoutées au dernier culot globulaire obtenu, le tout est agité. Le cross-match est réalisé en triplicate pour pouvoir comparer les 3 types d anti-globulines commerciales utilisées et préalablement fixée sur une bandelette vierge : - MP : anti-igg + Complément C3 feline (MP Biomedicals) - KPL : anti-igm feline (KPL) - Bethyl : anti-igm feline (Bethyl) Un contrôle négatif est réalisé pour chaque manipulation : les GR utilisés sont testés avec le plasma du chat correspondant. Après migration, l apparition d un point sur la bandelette (lieu de dépôt de l anti-globuline) est représentative d un cross-match positif dit incompatible, son absence est représentative d un cross-match négatif. E. Statistiques Des tests d indépendance, afin de vérifier que le sexe n a pas d influence sur la prévalence des groupes sanguins, et des intervalles de confiance sont réalisés lorsque les effectifs le permettent avec l outil statistique R. Le risque transfusionnel et le risque de maladie hémolytique sont évalués par les calculs de probabilité suivants : F(x) = x(1-x) avec x la proportion de chat B 75

78 Races III. Résultats A. Groupage Un total de 247 chats âgés de 6 mois à 17 ans au moment du prélèvement a pu être intégré dans notre étude. Cent dix chats ont été prélevés au cours de la réalisation de ce travail, entre janvier 2015 et mars 2016, et 137 avaientt déjà été groupés pour le SIAMU entre 2011 et 2014, qui constituent des données rétrospectives. L échantillon comptait 130 mâles et 117 femelles, 220 chats domestiques et 27 chats de races (Figure 14). Répartition raciale de l'échantillon Siamois Ragdoll Norvégien Européen Bengal Abyssin Nombre de chats Figure 14 : Répartition raciale de l échantillon La méthode de groupage utilisée a permis de mettre en évidence 210/247 chats de groupe A (85,0 %), 32/247 chats de groupe B (13,0 %) et 5/247 chats de groupe AB (2,0 %) (Tableau XV). Un intervalle de confiance est calculé pour les chats de groupe A et B mais pas pour les chats de groupe AB pour lesquels l effectif est trop faible. D après le test du khi deux d indépendance, réalisé avec le logiciel R, aucun lien entre le sexe et le groupe sanguin (p=0,66) n existe. Ce qui avait déjà été évalué dans d autres pays avec la même méthode. 76

79 Tableau XV : Résultats étude de la prévalence des groupes sanguins Mâles Femelles Total n % n % n % Intervalle de confiance Type A , , ,0 [81,6% ; 89,4%] Type B 19 14, , ,0 [8,9% ; 17,1%] Type AB 3 2,3 2 1,7 5 2,0 Total , , Risque transfusionnel Ces résultats permettent de calculer le risque transfusionnel dans notre population selon le tableau suivant : Tableau XVI : Calcul du risque transfusionnel dans notre étude Groupe sanguin du receveur Groupe sanguin du donneur Probabilité de l événement Conséquence A ou AB A ou AB (1-x)(1-y)=75,7 Aucune B B xy =1,7 Aucune A ou AB B (1-x)y= 11,3 B A ou AB x(1-y)= 11,3 Réaction transfusionnelle Réaction transfusionnelle Le risque de voir apparaître une réaction transfusionnelle (en transfusant un chat A avec du sang B et inversement) est de 22,6 %. Risque de maladie hémolytique F(x) = x(1-x) = 11,3% x proportion de chats de groupe B x-1 proportion de chats A ou AB Le risque de maladie hémolytique est de 11,3 % dans cette population de chats «tout venant». 77

80 B. Cross-match gel 1. Cross-match des 11 chats du groupe test entre eux, comparaison plasma frais et congelé Nous n avons observé aucune différence dans les résultats entre du plasma frais et du plasma congelé. Tous les chats dont le sang frais était disponible ont été testés par cross-match entre eux, ce qui nous a permis de les caractériser pour la suite de l étude. Tous les cross-matchs entre chats de même groupe se sont révélés négatifs : - Les 7 chats de groupe A sont compatibles entre eux ; - Les 3 chats de groupe B sont compatibles entre eux. Aucun plasma des chats de groupe A n a entraîné de réaction positive sur les GR des chats B ; ainsi, les 7 chats A n avaient pas d anticorps anti-b. Les plasmas des 3 chats de groupe B ont entraîné des réactions positives sur les GR des 7 chats A testés et du chat AB. Des fortes agglutinations ont été observées entre les plasmas des chats B et les GR des chats A. Le plasma du chat de groupe AB n a entraîné aucune agglutination, ni avec les GR des chats de groupe A, ni avec ceux des chats de groupe B. 78

81 Tableau XVII : Résultats des cross-matchs des 11 chats du groupe test GR GR GR GR GR GR GR GR GR GR GRA A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 B1 B2 B3 B1 PLA PLA PLA PLA PLA PLA PLA PLB PLB PLB PLA B GRA1 : globules rouges du chat A1 ; PLA1 : plasma du chat A1 Figure 15 : Résultats des cross-matchs des plasmas des chats du groupe test sur les globules rouges du chat A 1 79

82 2. Cross-match des plasmas congelés des 45 chats A sur les GR du groupe test Les plasmas congelés des 45 chats A (PLA8 à PLA52) ont été testés sur les GR des 11 chats du groupe test. Les plasmas de 43 chats étaient compatibles avec les GR des 11 chats du groupe test. Ces 43 chats ne possédaient pas d anticorps contre des GR de groupe A, B et AB. Deux plasmas seulement, PLA11 et PLA35 ont montré des incompatibilités. Le plasma PLA11 était incompatible avec les GR des 3 chats B du groupe test. Le plasma PLA35 était incompatible avec les GR des 3 chats B du groupe test, avec les GR d un chat A (GRA7) et les GR du chat AB du groupe test. Tableau XVIII : Résultats des cross-matchs des plasmas A sur les 11 GR du groupe test GRA1 GRA2 GRA3 GRA4 GRA5 GRA6 GRA7 GRB1 GRB2 GRB3 GRAB1 PLA8 à PLA10, PLA12 à PL34 et PLA36 à PLA PLA PLA Figure 16 : Résultats des cross-matchs des plasmas des chats A 11 et A 35 sur les GR du chat B 1 80

83 Figure 17 : Résultats des cross-matchs des plasmas des chats A 11 et A 35 sur les GR du chat A 7 3. Cross-match des plasmas congelés des 9 chats B et du chat AB sur les GR du groupe test Des tests de compatibilité ont été réalisés avec tous les plasmas B congelés sur les GR frais des 11 chats. Tous les cross-matchs avec des GR de groupe B se sont révélés négatifs. Les chats B de l étude étaient compatibles entre eux. Sept plasmas B sur neuf étaient incompatibles avec les GR des 7 chats A et les GR du chat AB du groupe test. Deux plasmas B congelés, PLB10 et PLB12, étaient compatibles avec les GR des 7 chats A et les GR du chat AB du groupe test. Tableau XIX : Résultats des cross-matchs utilisant le plasma des chats B Plasmas Globules rouges GRA1 GRA2 GRA3 GRA4 GRA5 GRA6 GRA7 GRB1 GRB2 GRB3 GRAB1 PLB PLB PLB PLB PLB PLB PLB PLB PLB PLAB

84 Figure 18 : Cross-matchs en gel des plasmas de chats B sur les GRA 7 C. Titrage 1. Titrage des plasmas des chats A positifs en cross-match Le plasma PLA11 et PLA35 ont été titrés avec des GRB1. Le PLA11 avait présenté des incompatibilités avec les GR des 3 chats de groupe B. Le PLA35 avait présenté des incompatibilités avec les GR des 3 chats B du groupe, du chat A7 et du chat AB1 du groupe test. Le titre du PLA11 est de 2 et celui de PLA35 de 8. Tableau XX : Titrage des plasmas A 11 et A 35 sur les GRB 1 Titrage du plasma Pur ½ 1/4 1/8 1/16 PLA PLA

85 Figure 19 : Titrage du plasma des chats A 35 et A Titrage des plasmas des chats B Les plasmas des chats B ont été titrés avec des GRA5 et GRAB1. Ces 7 plasmas avaient présentés des incompatibilités avec les GR des 7 chats A et les GR du chat AB du groupe test. Les résultats de titrage sont présentés dans le tableau ci-dessous. Tableau XXI : Résultats des titrages des plasmas B sur les globules rouges des chats A 5 et AB 1 Titrage des plasmas des chats de groupe B Pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Plasmas des chats de groupe B PLB PLB PLB PLB PLB PLB PLB PLB PLB

86 Figure 20 : Titrage en gel du plasma du chat B 8 Tableau XXII : Répartition des titrages en anticorps Nombre de chats de groupe A Titre en anticorps anti-b chez chats de groupe A Nombre de chats de groupe B Titre en anticorps anti-a chez chats de groupe B Tableau XXIII : Estimation du risque post-transfusionnel en prenant en compte le titrage des anticorps d après (Knottenbelt et al., 1999) Donneur Receveur Réactions sévères aiguës (titre en anticorps du receveur 128) Réactions aiguës (titre en anticorps du receveur = 8 à < 128) Destruction prématurée des GR (titre en anticorps du receveur <8) A B 8,3 % 8/12 = 66,7 % 3/12= 25 % AB B 8,3 % 66,7 % 25 % AB A 0 1,9 % 98,1 % B A 0 1,9 % 98,1 % A AB B AB

87 D. Cross-match par immunochromatographie 1. Cross-match du plasma du chat A35 sur les GR du chat A7 Le plasma du chat A 35 avait montré une incompatibilité avec les GR A7 en cross-match gel. Ce plasma et ces GR sont testés à nouveau avec la technique par immunochromatographie utilisant des antiglobulines félines. Tableau XXIV : Résultats des cross-matchs sur bandelettes avec GRA 7 Globules rouges A7 PLA7 (CT -) PLB1 (CT +) PLA1 PLA35 MP KPL Bethyl : aucun point n apparaît, cross-match négatif + : un point apparaît, cross-match positif Les cross-matchs des GR du chat A7 avec son propre plasma (autocontrôle) et avec le plasma PLA1 étaient compatibles sur les 3 bandelettes, comme on l avait déjà montré en gel. Les plasmas PLB1 et PLA35 sur les GRA7 entraînaient des réactions positives sur les bandelettes avec les antiglobulines anti-igm des laboratoires KPL et Bethyl. Les réactions sur les bandelettes avec l antiglobuline anti-igg étaient négatives. 85

88 Ces résultats ont montré que les anticorps mis en jeux lors de réactions positives pour le chat B1 et le chat A35 sont des IgM et non des IgG. 2. Cross-match des plasmas B10 et B12 sur GRA2 du groupe test Les plasmas des chats B10 et B12 qui n avaient pas entraîné d incompatibilité en gel sont testés en bandelettes sur les GRA2. Deux contrôles négatifs (avec le propre plasma du chat A2 et le plasma A3) et un contrôle positif (avec le plasma du chat B2 ayant réagi en gel) sont réalisés. Les contrôles négatifs n entraînent aucune réaction et le contrôle positif entraîne l apparition de spot comme attendu sur les bandelettes KPL et Bethyl mais rien sur MP. Le plasma du chat B10 a entraîné un cross-match incompatible alors que PLB12 est compatible avec les GR du chat A2. Tableau XXV : Résultats des cross-matchs sur bandelettes des plasmas B 10 et B 12 sur les GRA 7 Globules rouges A2 PLA2 (CT -) PLB2 (CT +) PLB10 PLB12 MP KPL Bethyl Cross-match des plasmas A du groupe test sur les GR du chat B3 Des cross-matchs en bandelette ont été réalisés avec les plasmas des 11 chats (A1 à A7, B1 à B3 et AB1) sur les GRB3. Les cross-matchs étaient tous compatibles sauf pour PLA3. En effet, pour ce dernier, un très léger point apparaissait, mais il était difficile de différencier une réaction positive d un bruit de fond. 86

89 IV. DISCUSSION Cette étude de la répartition des groupes sanguins chez les chats européens est à l heure actuelle celle qui concerne le plus large échantillon utilisant la technique par immunochromatographie en France. C est également la plus importante en terme de nombre de cross-matchs réalisés depuis plusieurs années dans le pays et la seule utilisant chez le chat des anti-globulines félines. A. Groupage, répartition des groupes Dans un premier temps, le but était d étudier la distribution des groupes sanguins A, B et AB au sein d une population de chats représentant des donneurs potentiels. En outre, une étude s intéressant aux chats domestiques revêtait une importance majeure car ils représentent la population féline majoritaire en France et par conséquent sont les plus susceptibles d être transfusés ou d être utilisés comme donneur. Nous avons également essayé d évaluer le risque de réactions sanguines ou de maladies hémolytiques du nouveau-né dues à des incompatibilités dans le système AB. Il est important pour une banque de sang de connaître les prévalences respectives des chats de groupe A, de groupe B et AB dans la zone géographique proche. En effet, le chat présentant des allo-anticorps naturels, des incompatibilités sanguines peuvent être à l origine de graves réactions transfusionnelles. Les tests de groupages ont montré dans une population de 247 chats une proportion de 85 % de chats de groupe A, 13 % de chats de groupe B et 2 % de chats de groupe AB. La prévalence des trois groupes est comparable à celle rapportée dans d autres études à travers le monde, avec une nette prédominance du groupe A. Les résultats de notre étude sont comparables à ceux présentés en France à Paris en 1962 avec 15 % de chats de groupe B (Eyquem et al., 1962). Ceci laisse supposer qu il n y a eu que peu d évolution dans la répartition des groupes sanguins félins en France. La prévalence du groupe B de 13 % chez les chats de la région lyonnaise était proche de celles décrites en Grèce avec 20,3 % (Mylonakis et al., 2001), à Pékin avec 11,4 % (Zheng et al., 2011), en Irlande avec 14,6% (Juvet et al., 2011). Ces chiffres étaient très supérieurs à ceux rapportés aux Etats-Unis (0,3 % (Giger et al., 1991)) ou en Hongrie (0 % (Bagdi et al., 2001)). La fréquence du groupe B en France était élevée, ce qui pourrait majorer le risque de maladie hémolytique ou de réactions transfusionnelles. Cette donnée renforce l idée que le groupage est fortement conseillé avant la mise à la reproduction et est indispensable chez le chat, même en première transfusion. Notre étude a révélé un pourcentage de chats AB de 2 %, plus important que celui rapporté dans la plupart des publications où il est en général inférieur à 1 % : Australie 0,4 % (Malik et al., 2005), Chine 0,4 % (Zheng et al., 2011), Montréal 0,5 % (Fosset, Blais, 2014) ou même considéré comme nul comme aux Etats-Unis ou en Suisse. Certaines régions comme le Sud-Est 87

90 de l Angleterre (Forcada et al., 2007), les périphéries de Rio de Janeiro (Medeiros et al., 2008) ou la Turquie (Arikan et al., 2006b) (2,3 %) ont cependant des pourcentages de chats de groupe AB très proches de celui estimé par nos travaux. Dans certaines études, le faible nombre de chats AB pourrait être imputé à la technique de groupage. En effet, depuis une vingtaine d années, les techniques de groupages sanguins ont évolué et les réactifs ont changé pour permettre une détection optimale des antigènes érythrocytaires. La lectine de Triticum vulgaris a largement été remplacée par des anticorps monoclonaux qui sont plus spécifiques (Stieger et al., 2005; Proverbio et al., 2011). Il est important de se le rappeler lors de la comparaison de nos résultats avec des données plus anciennes. La technique par immunochromatographie est relativement récente en médecine vétérinaire et a été validée par plusieurs études la comparant aux méthodes standards (Spada et al., 2015). Ces publications ont montré qu il s agissait d une méthode précise (94,8 %), avec une haute sensibilité et spécificité (Spada et al., 2015). Elle est maintenant utilisée par de nombreuses cliniques vétérinaires. Elle combine rapidité et facilité d utilisation, et est accessible à tous, ce qui représente un avantage en clientèle. La lecture est répétable et beaucoup moins subjective qu elle ne l était avec la méthode en carte, beaucoup plus délicate pour des personnes non expérimentées. Des études montrent qu avec certaines méthodes les résultats pour le groupe AB ne sont pas si fiables (Seth et al., 2011). En effet, le groupage sur carte (DMS ), la technique la plus utilisée il y a quelques années pour les carnivores domestiques, était très fiable pour identifier les groupes A et B chez le chat. Cependant certaines études ont montré que les tests de groupage en cartes pouvaient entraîner de faibles réactions avec du sang AB et conduire à une sous-estimation du groupe AB (Stieger et al., 2005; Proverbio et al., 2011; Spada et al., 2015). L immunochromatographie ou les tests en colonne de gel se sont révélés utiles pour identifier de manière plus précise les chats de groupe AB. Cependant, le nombre relativement important de chats AB identifiés dans notre travail ne peut pas uniquement être imputé à la méthode utilisée. Une étude irlandaise (Juvet et al., 2011) a groupé 137 chats domestiques et 39 chats de races pures avec la technique d immunochromatographie. Un pourcentage de chats de groupe AB de seulement 0,7 % a été mis en évidence. Pour confirmer nos résultats, certains groupages ont été réalisés plusieurs fois, surtout ceux donnant des résultats AB. Aucune autre méthode de groupage n a été utilisée en comparaison. Un faible nombre de chats de race (27 sur 247) a été inclu dans cette étude. La prévalence du groupe B n était pas très importante chez ces individus. Calculer la prévalence pour chaque race présente dans notre étude n était pas possible en raison du faible nombre de chats de même race. Deux chats de race seulement étaient de groupe B, un Persan et un Sacré de Birmanie. Ces races n ont pas fait l objet d études importantes de répartition de groupes sanguins. 88

91 B. Conséquences La connaissance de la répartition des groupes nous a permis d estimer le risque de réaction transfusionnelle ou de maladie hémolytique dans une population donnée. Risque transfusionnel Le risque calculé de transfuser un chat A avec du sang B et inversement, était de 22,6 % dans notre étude. Ceci correspondait au risque de réaliser des transfusions théoriquement incompatibles. Cependant, ce risque ne pouvait pas être déterminé avec précision sans connaître exactement le titre en anticorps des plasmas. En effet, ce titre détermine la sévérité de la réaction. Maladie hémolytique nouveau-né Le risque de maladie hémolytique a souvent été étudié chez les chats de race car l élevage en est la principale application. Le phénotype B est connu comme étant plus présent au sein de certaines races. La proportion importante de chats de groupe B en France et le fait que la stérilisation des chats ne soit pas toujours une priorité pour les propriétaires renforcent l intérêt de calculer le risque de maladie hémolytique pour des chats sans pedigree. Dans notre étude, ce risque était de 11,3 % ; il est non négligeable pour une population de chats «tout venant». Titrage et évaluation du risque transfusionnel La méthode de cross-match en gel nous a permis de réaliser des titrages des plasmas de chats de différents groupes et d affiner le calcul du risque transfusionnel (Tableau XXIII). En effet, la sévérité d une réaction est intimement liée au titre en anticorps chez le receveur (Auer, Bell, 1983). Cependant, le titre minimal pour entraîner une réaction transfusionnelle n est pas encore connu chez le chat. Les agglutinations microscopiques n étaient pas prises en compte avec la technique de cross-match en gel utilisée. Ces résultats (Tableau XXII) sont à interpréter avec précaution car le nombre de chats pour lesquels nous avons pu réaliser des titrages n était pas très important surtout pour les chats B (seulement 9). De façon surprenante et en désaccord avec les études réalisées précédemment sur le sujet (Auer et Bell, 1981), notre travail a montré que certains chats B n étaient pas incompatibles avec les chats A. Ce qui laisserait supposer que tous les chats B ne posséderaient pas d anticorps anti-a. Dans les précédentes études, aucun chat de groupe B avec un titre d agglutination inférieur à 64 n avait été décrit (Bücheler, Giger, 1993). Seulement, une étude au Royaume Uni (Knottenbelt et al., 1999), regroupant 40 chats B, rapportait que 40 % avaient des titres inférieurs à 64 et un chat avait un titre inférieur à 4. La question de la sensibilité de la méthode de cross-match peut être posée. En effet, les études précédentes ont souvent utilisé la méthode en tube, qui constitue le «gold standard» et permet l identification de micro-agglutination et d hémolyse. Cependant, cette technique qui peut paraître plus précise, en détectant ce type de réaction, est très compliquée et opérateur dépendant. 89

92 C. Cross match et conséquences La deuxième partie de l étude s intéressait aux cross-matchs dans l espèce féline. Ce test de compatibilité sanguine revêt une importance considérable et devrait être effectué de manière systématique avant une transfusion chez le chat. De nouvelles spécificités érythrocytaires ont été suspectées et mises en évidence récemment grâce au cross-match (Weinstein et al., 2007). Dans notre étude la technique de cross-match utilisée en première intention (technique en gel sans intégration d anti-globulines) était celle décrite et validée dans plusieurs publications (Weinstein et al., 2007 ; Day, 2012). De nombreux cross-matchs ont été réalisés entre des GR frais de 11 chats, composant le groupe test, et des plasmas congelés. Les réactions d agglutinations permettaient de conclure à la présence dans les plasmas testés d anticorps contre des GR donnés. Incompatibilité chez les chats de même groupe Les plasmas de chats de groupe B testés sur les GR de chats de groupe B n ont pas révélé d incompatibilité. Ce résultat est conforme à ce qui a été publié à ce jour, aucune étude n a rapporté d incompatibilité entre chats de groupe B. On pouvait anticiper des réactions entre des plasmas et des GR de chats A comme cela a été décrit dans l étude révélant le nouvel antigène Mik (Weinstein et al., 2007). Seul le plasma du chat A35 a présenté des cross-matchs positifs avec les GRA7. Il était cependant compatible avec tous les GR des autres chats A de l étude. Le chat A7 ne présentait pas de cross-match mineur ou majeur positif avec d autres chats. Une suspicion de groupage erroné a été émise pour le chat A7, il a pu être groupé A alors qu il était AB. L impossibilité de prélever à nouveau ces chats a interrompu les manipulations et n a pas pu permettre de conclusion. Anticorps anti-a chez les chats B Certains chats B n ont pas montré d incompatibilité avec les chats A ce qui n est pas en accord avec les données de précédentes études aux Etats-Unis ou en Angleterre (Giger et al., 1991 ; Knottenbelt et al., 1999). Dans ces études, tous les chats de groupe B entraînaient des agglutinations avec les GR de groupe A. Les chats B10 et B12 ne montraient pas de réaction en gel avec les GR des chats A ou du chat AB. Anticorps anti-b chez les chats A Pour les manipulations en gel, une faible proportion de chats de groupe A (seulement 2 sur 51) a montré la présence d anticorps anti-b. En effet, seuls les plasmas des chats A11 et A35 ont présenté des incompatibilités avec les GR des chats B. Au Royaume-Uni, une proportion importante de chats de groupe A (44,3 %) a montré la présence d allo-anticorps anti-b à des dilutions ½ ou plus. Aux Etats-Unis, il a été démontré qu un chat sur trois présentait des anticorps anti-b capables d entraîner des agglutinations microscopiques (Bücheler et Giger, 1993). Ce type d agglutination n était pas visible avec la méthode en gel utilisée dans notre étude. Seul le chat A35 a présenté un cross-match positif avec le chat AB1. 90

93 Utilisation d anti-globulines félines sur bandelette Face aux résultats surprenants et peu compatibles avec ceux de la littérature, certains crossmatchs ont été réitérés avec une technique immunochromatographique adaptée à partir de celle utilisée pour le cross-match chien et commercialisée en bandelette (Alvedia ). Des antiglobulines félines (anti-igg ou anti-igm) sont intégrées à ce test dans le but d améliorer la détection des incompatibilités. Le plasma du chat A35 entraînait également un cross-match positif en bandelettes avec les GR du chat A7 et des GR de groupe B. Les deux chats B (B10 et B12) n ayant pas entraîné de crossmatchs positifs en gel sont testés en bandelettes sur des GR A et le chat B10 a montré un crossmatch positif avec l antiglobuline anti-igm. La technique en bandelette utilisant des antiglobulines félines nous a permis de mettre en évidence une incompatibilité non détectée en gel. Cette expérience a également confirmé que les anticorps mis en jeux dans les incompatibilités sanguines étaient des IgM et non des IgG (Bücheler et Giger, 1993). Les deux techniques de cross-matchs utilisées dans notre étude, en gel et en bandelette, présentaient chacune des avantages et des inconvénients. Le cross-match en gel, qui est une méthode reconnue chez le chat, a semblé présenter un déficit de sensibilité dans notre étude. Une incompatibilité non détectée en gel a pu être appréciée, de manière renouvelable avec la technique en bandelette intégrant une IgM. Il serait par conséquent très intéressant de mettre en place cette deuxième technique, ce qui pourrait faire l objet d un travail ultérieur en continuité de notre thèse. Néanmoins, de nombreux problèmes se posent chez le chat avec cette méthode. Lorsque l agglutination est trop importante, par exemple entre le plasma d un chat B possédant de forts titres en anticorps anti-a et les GR d un chat A, la migration sur la bandelette est difficile. Il faudrait en pratique, pour permettre cette migration, diluer préalablement le plasma du chat B. Mais une dilution trop forte par rapport au titre en anticorps risque d entraîner une absence de migration. La lecture du cross-match en bandelette peut donc paraître un peu compliquée pour une personne non sensibilisée à ce problème. Un test est considéré comme positif si aucune migration ne se produit (agglutination au bas de la bandelette) ou si un point apparaît au centre. Il est négatif si la migration se produit, mais que le point n apparaît pas. Il faudrait au préalable s assurer que l absence de migration n est pas liée à une auto-agglutination chez le patient. Ceci et l apparition de bruit de fond démontrent la difficulté de mettre en place cette technique de cross-match chez le chat en routine. Perspectives Le simple groupage chez le chat ne suffit pas. La présence, dans cette espèce, d allo-anticorps naturels contre les antigènes d un autre groupe sanguin augmente les risques de transfusion incompatible. La découverte récente de probables nouveaux antigènes sanguins et la transfusion multiple qui se développe renforcent la nécessité de mettre en place un cross-match accessible pour l espèce féline. Cette procédure était jusqu à maintenant longue et fastidieuse, difficile d interprétation et souvent très opérateur dépendant. La mise en place d un cross-match en bandelette pour l espèce canine, accessible à tous et réalisable en moins de 30 min a été une avancée importante. Pour l espèce féline, la mise en place d un test rapide et fiable de cross- 91

94 match est plus compliquée. Nos travaux ont montré l importance de mettre en jeu des antiglobulines pour améliorer la détection des incompatibilités sanguines. On peut imaginer mettre au point une méthode de cross-match en gel, en incubant préalablement la matrice des cartes avec une anti-globuline comme celle utilisée en bandelette. Limites Dans cette étude, le choix de travailler avec des animaux de propriétaires ayant des conditions de vie non homogénéisées était volontaire. Ainsi, l échantillonnage de chats était représentatif d une population classique en clientèle, des animaux qualifiés de «tout venant». Mais ceci a été une difficulté majeure dans la réalisation de notre projet. La conservation des échantillons pour les GR ne devait pas dépasser sept jours, pour ne pas fausser les résultats. Si des manipulations étaient faites plus tard, les chats étaient à nouveau prélevés. Le manque de coopération de l espèce féline et sa petite taille rendaient parfois la répétition des prélèvements compliquée. Certaines de nos manipulations n ont pas pu être complétées ou menées à terme car les chats concernés ne pouvaient plus être à nouveau prélevés (décès, maladie, indisponibilité des propriétaires ). Tous les chats n ont pas pu être testés pour plusieurs maladies comme il est recommandé de le faire, plus particulièrement les virus FIV/ FeLV qui pourraient être responsables d une expression biaisée des antigènes sanguins. De nombreux cross-matchs ont été réalisés avec les plasmas congelés mais seulement 11 chats faisaient partie du groupe test, ce qui représentait seulement 11 échantillons de globules rouges. Tous les cross-matchs n ont pas pu être réalisés en majeur et mineur. Les incompatibilités trouvées n ont pas pu être explorées dans leur totalité. 92

95 CONCLUSION Les groupes sanguins félins ont été définis pour la première fois en 1962 par le Professeur Eyquem. Pendant de nombreuses années, le système AB semblait être le seul système existant. Récemment, la découverte de nouvelles spécificités érythrocytaires, comme l antigène Mik, laisse imaginer une complexité plus grande pouvant être à l origine d incompatibilité sanguine chez le chat. Une meilleure connaissance des groupes sanguins chez le chat, et notamment l accès à des techniques simples à réaliser par le praticien, a permis un développement important de la médecine transfusionnelle chez cette espèce dans la dernière décennie. Les tests de groupage sont en effet de plus en plus performants, notamment avec la mise au point d anticorps monoclonaux, à l image du Quick Test A+B Feline (Alvedia), méthode récente utilisant la technique d immunochromatographie, à la fois rapide dans son exécution et facilement réalisable. Cette dernière permet de s affranchir des problèmes d auto-agglutination rencontrés chez certains chats et améliore la détection du groupe AB parfois mal identifié avec d autres méthodes. L étude de la répartition des groupes sanguins chez le chat domestique, dans le cadre de notre travail de thèse, menée sur un échantillonnage français de 247 chats, en région lyonnaise est la plus grande étude française utilisant la technique d immunochromatographie. Elle a permis d avancer une estimation de 13 % pour la population de chats du groupe B. Cette proportion relativement importante entraine des risques non négligeables de réaction transfusionnelle ou de maladie hémolytique chez le chaton. Ces résultats soulignent l importance des groupages sanguins pré-transfusionnels ou avant la mise à la reproduction. La deuxième partie de notre étude concernait, les tests de compatibilité sanguine dans l espèce féline. Les crossmatchs réalisés avec la technique gel sans anti-globuline intégrée n ont pas montré d incompatibilités entre chats de même groupe. Concernant les anticorps contre les antigènes d autres groupes, seulement 2 plasmas de chats A sur 52 possédaient des anticorps anti-b. Des anticorps anti-a ont été détectés chez 11 chats B sur 13 avec cette méthode. Ces résultats ont été confirmés et affinés avec une autre technique de cross-match en bandelette intégrant une anti-globuline féline (anti-igg ou anti-igm), révélant la présence d anticorps anti A chez un chat B pour lequel la technique en gel n avait pas détecté d agglutination. L utilisation d anti-globuline (anti-igm) semble, dans notre étude, améliorer la sensibilité du cross-match. Peu d incompatibilités entre chats de même groupe dans le système AB ont été mises en évidence au cours de notre étude. Ces incompatibilités récemment mises en évidence semblent rares mais méritent encore d être investiguées. Notre travail s est intéressé à la mise au point d un cross-match fiable, facile et rapide d utilisation en clientèle pour l espèce féline. Il soulève les interrogations quant à la présence d allo-anticorps naturels contre les antigènes d autres groupes sanguins du système AB ou d autres encore méconnus, et de fait sur la réalisation systématique de ce test, de manière complémentaire au test de groupage. 93

96 94

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103 Annexes Annexe 1 : Technique de cross-match sur tube (Davidow, 2013) 1. Prélever du sang sur tube EDTA et tube sec chez le donneur et le receveur. 2. Centrifuger et séparer le plasma et le sérum des globules rouges. Conserver le sérum dans un autre tube et jeter le plasma du tube EDTA 3. Laver les globules rouges du tube EDTA : a. Placer les GR dans un autre tube (12 75mm) et le remplir au trois quart avec une solution saline. b. Centrifuger pendant 1 minute, laisser décanter la solution et répéter 3 fois. Retirer le surnageant la dernière fois. 4. Remettre les GR en suspension pour obtenir une solution de 2 à 4% (0,2mL de sang dans 4,8mL de saline donne une solution à 4%). 5. Identifier les tubes pour les différents mélanges : a. Cross-match majeur : 2 gouttes de sérum du receveur + 1 goutte de suspension de globules rouges du donneur. b. Cross-match mineur : 1 goutte de suspension de globules rouges du receveur + 2 gouttes de sérum du donneur. c. Contrôle : 1 goutte de suspension de GR du receveur + 1 goutte de sérum du receveur. 6. Incuber 15 à 30 min à 37 C. 7. Centrifuger 15 s. 8. Interprétation : si une hémolyse ou une agglutination sont observées macroscopiquement ou microscopiquement le cross-match n est pas compatible. 101

104 Annexe 2 : Fiche de suivi transfusionnel du SIAMU Protocole transfusion Horaire Température Fréquence cardiaque Muqueuses (TRC, couleur) Fréquence respiratoire Pression artérielle Autres SIAMU Ecole Vétérinaire de Lyon 102