HSV-1/2-IgM-ELA Test PKS medac. Français 104-PKS-VPF/010416
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1 HSV1/2IgMELA Test PKS medac Français 104PKSVPF/010416
2 FABRICANT medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Theaterstraße 6 D22880 Wedel diagnostics@medac.de Tél.: ++49/4103/80060 Fax: ++49/4103/ ADRESSE DE COMMANDE auftrag@medac.de Tél.: ++49/4103/ Fax: ++49/4103/ PKSVPF/010416
3 HSV1/2IgMELA Test PKS medac Immunoessai enzymatique avec Système de Contrôle de Pipettage pour la détection des anticorps IgM anti Herpes simplex virus 1 et 2 (HSV1/2) dans le sérum et le plasma. Réf.: 104PKS DESTINE UNIQUEMENT AU DIAGNOSTIC IN VITRO INTRODUCTION Le virus herpes simplex (HSV) appartient à la famille des herpesviridae pathogènes de l homme. Il existe deux types, HSV1 et HSV2, qui partagent 85 % d homologie génétique. L enveloppe glycoprotéine G détermine la spécificité de type du virus. Une persistance latente dans l organisme pendant toute la vie après une infection primaire est typique du HSV. Des réactivations apparaissent dans environ 50 % des infections latentes et plus fréquemment chez les patients immunodéprimés. Des infections secondaires hétérologues ou homologues sont possibles. Les HSV sont communs dans le monde. En Allemagne la prévalence d anticorps anti HSV1 est plus de 90 % chez les adultes tandis que presque 15 % possèdent des anticorps anti HSV2 avec une tendance en augmentation. Le transfert du virus se fait par les muqueuses ou par contact cutané. Les infections se manifestent de manière orofaciale (HSV1) ou génitale (HSV2). La localisation spécifique du type de maladie n est pas obligatoire parce que les deux types de virus peuvent causer des infections dans les deux sites corporels. Le diagnostic d une infection primaire HSV ou d une réactivation pendant la phase symptomatique/active de la maladie est établi dans la plupart des cas par les signes cliniques ou par détection directe du pathogène. Le diagnostic de HSV en laboratoire est principalement utilisé dans les cas d exanthème d origine inconnue, la suspicion d encéphalite herpétique, d une infection généralisée de patients immunodéprimés ou de nouveauxnés et d une infection génitale pendant la grossesse. La détermination des anticorps est utilisée de préférence pour la confirmation de l immunité, de même que pour la différentiation de la phase précoce d une récidive. Le HSV1/2IgMELA Test PKS medac détecte les anticorps IgM dirigés contre le HSV1 et/ou le HSV2. Le test peut être réalisé rapidement et facilement. La capture µ et le principe ELA permettent une interprétation diagnostique hautement spécifique et sensible. 104PKSVPF/
4 PRINCIPE DU DOSAGE La plaque est recouverte d immunoglobulines antiigm humaines. Les IgM des échantillons se lient sélectivement aux anticorp fixés dans les cupules. AG AG Le complexe conjuguémacperoxidase et antigènehsv se lie aux anticorps IgM spécifiques (AG = antigène, P = peroxidase). AG AG Incubation avec le substrattmb (*). La réaction est arrêtée par l ajout d acide sulfurique. L absorption est lue dans un spectrophotomètre. Advantages du dosage Pas de réactions non spécifiques et pas de résultats faussement positifs causés par les facteurs rheumatoides. Pas de blocage des anticorps IgM en présence de hauts titres d IgG. Le Système de Contrôle de Pipettage permet de suivre visuellement chaque étape grâce aux changements de couleurs. Les microcupules sécables permettent l utilisation optimale du test. Convient pour l automatisation sur des appareils ELISA ouverts. 104PKSVPF/
5 CONTENU DE LA TROUSSE Cat. no.: 104PKS 1. MTP Microplaque: 12 x 8 puits (marqués HSM, avec support et déshydratant dans un sachet d aluminium sous vide), sécables, forme en U, recouverts d immunoglobulines de chèvre antiigm humaine, de la BSA et indicateur de ph, prêts à l emploi. 2. CONTROL Contrôle négatif: 1 flacon de 1,5 ml, sérum humain, prêt à l emploi, contient de la BSA, du phénol, du ProClin TM 300 et du sulphate de gentamycine. 3. CONTROL + Contrôle positif: 1 flacon de 1,5 ml, contenant du sérum humain, prêt à l emploi, contient du sérum foetal de veau, de la BSA, du phénol, du ProClin TM 300 et du sulphate de gentamycine. 4. WB Tampon de lavage: 1 bouteille de 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, contient du ProClin TM VIRDIL Diluant pour échantillons: 1 bouteille de 110 ml, contenant PBS/ Tween/BSA, ph 7,2 7,4, prêt à l emploi, contient du ProClin TM ANTIGENDIL Diluant antigène: 1 flacon de 14 ml PBS/Tween, prêt à l emploi, contient du ProClin TM ANTIGEN Antigène: 6 flacons de 2,0 ml chacun, HSVantigène/BSA/sérum foetal de veau, lyophilisé. 8. CON Conjugué: 1 flacon de 0,35 ml, anticorps antihsv IgG, monoclonaux (souris) conjugué à HRP, prêt à l emploi, de couleur rouge, contient de la BSA, du phénol, du ProClin TM 300 et du sulphate de gentamycine. 9. TMB TMBSubstrat: 1 flacon de 10 ml, prêt à l emploi. 10. STOP Solution d arrêt: 2 flacons de 11 ml chacun, acide sulfurique 0,5 M (H 2 SO 4 ), prête à l emploi. Peut être corrosif pour les metaux. 104PKSVPF/
6 1. CONSERVATION ET STABILITE Matériel/Réactifs Etat Conservation Stabilité Trousse non ouvert C Jusqu à la date de péremption Microplaque ouvert C dans le 6 semaines sachet avec déshydratant Contrôles ouvert C 6 semaines Tampon de lavage dilué C 6 semaines Diluant pour ouvert C 6 semaines échantillons Diluant antigène ouvert C 6 semaines Conjugué ouvert C 6 semaines Mélange antigèneconjugué prêt à l emploi T ambiante 6 heures SubstratTMB ouvert C 6 semaines Solution d arrêt ouvert C Jusqu à la date de péremption Ne pas utiliser les réactifs après leur date de péremption. 2. REACTIFS ET MATERIEL NECESSAIRES MAIS NON FOURNI 2.1. Eau distillée ou désionisée Micropipettes réglables Récipients propres en verre ou plastic pour la dilution du tampon de lavage et des échantillons Dispositif de lavage des microplaques (par exemple multistepper ou laveur ELISA) Incubateur à 37 C Lecteur de microplaque avec filtres à 450 nm et nm. 3. PREPARATION DES REACTIFS Avant de démarrer la procédure de dosage, tous les composants de la trousse doivent être amenés à température ambiante. Calculer le nombre de puits nécessaire. 104PKSVPF/
7 3.1. Microplaque Le sachet d aluminium avec le déshydratant doit être soigneusement refermé, après avoir retiré les puits. La conservation et la stabilité des puits sont indiquées au point 1. Remarque: Les puits de la microplaque possèdent des reflets verts. Eventuellement apparaissent des traces de couleur vertes ou brunes dans ceuxci, ceci est dû un procédé de production et n influence pas les performances du test Tampon de lavage Mélanger un volume de tampon de lavage (10x) avec neuf volumes d eau distillée ou désionisée (ex: 50 ml de tampon de lavage (10x) avec 450 ml d eau). 10 ml de tampon dilué sont nécessaires pour huit puits. Des cristaux dans le tampon de lavage (10x) doivent être dissous en chauffant (max. 37 C) ou/et en agitant à température ambiante Mélange antigèneconjugué Reconstituer l antigène lyophilisé avec 2,0 ml de diluant pour antigène. Mélanger doucement et faire attention á ce que les particules qui adhèrent bouchon soient aussi dissoutes. Ajouter 50 µl de conjugué à 2,0 ml d antigène 60 minutes avant utilisation. Après reconstitution de l antigène et l ajout du conjugué, le mélange a une couleur rouge et est prêt à l emploi. Le mélange antigèneconjugué prêt à l emploi, peut être utilisé à temperature ambiante pendant 6 heures (voir 1.). Ne pas mélanger les réactifs spécifiques du test (microplaque, contrôles, conjugué, antigène, diluant pour antigène) de différents lots. Par contre, le diluant pour échantillons, le tampon de lavage, le TMBsubstrat et la solution d arrêt sont interchangeables dans tous les tests virologiques ELISA medac. Des réactifs d autres fabricants ne peuvent pas être utilisés. Des résultats valides et reproductibles sont uniquement obtenus en suivant strictement la notice d emploi. 104PKSVPF/
8 4. ECHANTILLONS 4.1. Le test est à utiliser avec du sérum et du plasmaedta. Les échantillons de patients peuvent être conservés pendant 7 jours à 28 C. Un stockage à long terme doit être fait à 20 C. Des décongélations et congélations des échantillons doivent être évitées Le prétraitement des échantillons, per ex. l inactivation, n est pas nécessaire. Toutefois, il ne doit pas être contaminé par des microorganismes ni contenir des érythrocytes Le sérum ou le plasma doivent être dilués au 1:100 avec du diluant pour échantillon. 5.A. PROCEDURE DE DOSAGE 5.1. Couper le sachet d aluminium audessus du zip et extraire le nombre de puits nécessaire (voir 3.1.). Ceuxci sont prêts à l emploi et ne doivent pas être prélavés Laisser la cupule A1 vide comme blanc (voir 6.A.). Ajouter 50 μl de chaque échantillon dilué, de même que le contrôle négatif et positif, en double, dans les puits. Après pipettage des échantillons (ph neutre ou basique) les puits deviennent bleus. L absence d un changement de couleur dans l un des puits indique qu un échantillon ou un contrôle n a pas été ajouté. Si nécessaire, la microplaque peut être conservée pendant 30 minutes à t ambiante avant la suite de la procédure 5.3. Incuber la microplaque pendant 60 min ( 5 min) à 37 o C ( 1 C) dans une chambre humide ou couverte d un film pour incubation Préparer le mélange antigèneconjugué (voir 3.3.). 5.5 Après incubation laver la microplaque 3 fois avec 200 μl de tampon de lavage par puit. Vérifier que tous les puits soient remplis. Après lavage, tapoter les délicatement sur du papier absorbant. Ne pas laisser sécher les puits! Poursuivre immédiatement la procédure! 104PKSVPF/
9 5.6. Ajouter le mélange conjuguéantigène (coloré en rouge) à chaque puit (excepté A1). 50 μl du mélange antigèneconjugué doivent être pipettés si le test est réalisé manuellement. Attention: Si la procédure est réalisée sur automate, il faut distribuer 60 µl du mélange antigèneconjugué dans chaque puit, en raison de l évaporation importante dans les incubateurs. L utilisation sur les appareils automatiques a été validée pendant l évaluation du test. Néanmoins, nous recommandons de vérifier la compatibilité avec les appareils utilisés dans le laboratoire Incuber à nouveau la plaque pendant 60 min ( 5 min) à 37 (± 1 o C) dans une chambre humide ou couverte d un film pour incubation Après incubation laver la microplaque (voir 5.5.) Ajouter 50 μl de TMBsubstrat à chaque puit (y compris A1) et incuber pendant 30 min ( 2 min) à 37 C ( 1 C) dans une chambre humide ou couverte d un film pour incubation dans l obscurité. Les échantillons positifs deviennent bleus Arrêter la réaction en ajoutant 100 µl de solution d arrêt à chaque puit (également A1). Les échantillons positifs deviennent jaunes. Bien nettoyer le dessous des puits avant la lecture photométrique et vérifier l absence de bulles d air. La lecture doit être effectuée dans les 15 minutes après l ajout de la solution d arrêt. o C 104PKSVPF/
10 5.B. TABLEAU DE PROCEDURE DU TEST Contrôle négatif Contrôle positif Echantillon Blanc (A1) Contrôle négatif 50 μl Contrôle positif 50 μl Echantillon 50 μl Incuber 60 min à 37 C, laver 3x avec 200 μl de tampon de lavage Mélange antigène conjugué 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Incuber 60 min à 37 C, laver 3x avec 200 μl de tampon de lavage TMBSubstrat 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Incuber 30 min at 37 C dans l obscurité Solution d arrêt 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Lecture photométrique à 450 nm (réf nm) *) procédure manuelle/automatique(voir 5.6.) 6.A. CALCUL DES RESULTATS (VALIDITE) Lire les valeurs d absorbance à 450 nm (longueur d onde de référence nm). Soustraire la valeur DO du blanc (puit A1) de toutes les autres valeurs de DO. La valeur moyenne de DO du contrôle négatif doit être < 0,150. La valeur moyenne de DO du contrôle positif doit être > 0,450. * Valeur seuil (Cutoff) = valeur moyenne DO du contrôle négatif + 0,140 Zone grise = valeur seuil 10 % Recommencer la série si les résultats ne rencontrent pas les spécifications. 104PKSVPF/
11 6.B. INTERPRETATION DES RESULTATS/LIMITATIONS DE LA METHODE Les échantillons ayant des valeurs de DO endesssous de la limite inférieure de la zone grise sont rapportés NEGATIFS. Les échantillons ayant des valeurs de DO dans la zone grise sont rapportés DOUTEUX. Ces échantillons doivent être retestés avec un nouvel échantillon prélevé 14 jours plus tard de manière à déterminer un changement de titre. Les échantillons ayant des valeurs de DO dépassant la valeur supérieure de la zone grise sont rapportés POSITIFS. Les résultats doivent toujours être interprétés par rapport aux données cliniques, aux résultats HSV1/2IgG, HSV2IgG et aux paramètres diagnostiques complémentaires. Dans le cas d une suspicion d infection primaire HSV1/2 pendant la grossesse, il faut réaliser un diagnostic complémentaire, par exemple une PCR. Des réactions croisées, causées par des anticorps contre d autres virus herpes, ne peuvent pas être exclues dans certains cas. Des échantillons hémolytiques n influencent pas les résultats du test. 104PKSVPF/
12 7.CARACTERISTIQUES DES PERFORMANCES Les performances suivantes du dosage ont été déterminées pendant l évaluation diagnostique. 7.A. SENSIBILITE ET SPECIFICITE 468 séra (270 provenant du laboratoire du Prof. Dr. Enders et Collègues, Stuttgart, et 198 séra de donneurs de sang de Hanovre et Suhl) ont été dosés par comparaison avec les résultats nominaux pendant l évaluation diagnostique. Les résultats nominaux ont été déterminés par deux différents ELISA comme référence. Les résultats obtenus sont dans le tableau cidessous: HSV1/2IgMELA PKS medac Résultats nominaux négatif équivoque positif négatif douteux positif Spécificité = 100 % Sensibilité = 84,7 % Concordance: 98,1 % 7.B. PRECISION Echantillon Variation intraessai Echantillon Variation interessai DO SD CV (%) n moyenne SD CV n moyenne OD (%) CN 0,038 0, CN 0,050 0, FC 0,313 0, FC 0,360 0, CP 0,562 0, CP 0,705 0, N 1 0,035 0, N 6 0,033 0, N 2 0,073 0, N 7 0,098 0, N 3 0,417 0, N 8 0,505 0, N 4 0,609 0, N 9 0,734 0, N 5 1,257 0, N 10 1,365 0, CN = contrôle négatif; FC = contrôle faiblement positif (pas inclus dans le kit); CP = contrôle positif 104PKSVPF/
13 INDICATIONS GENERALES Ne pas échanger les flacons et leurs bouchons pour éviter les contaminations croisées. Les flacons des réactifs doivent être refermés immédiatement après utilisation pour éviter l évaporation et une contamination microbienne. Après emploi, les réactifs doivent être conservés comme indiqué pour garantir leur durée de vie. Après emploi, conserver tous les composants de la trousse dans leur emballage d origine, afin d éviter le mélange des réactifs concernant d autres techniques de dosage ou d autres lots (voir aussi 3.). PRECAUTIONS D EMPLOI Il faut appliquer la règlementation en vigueur en matière de sécurité et de santé. Les réactifs d origine humaine ont été dosés et trouvés négatifs en AgHBs, en anticorps antihiv1/2 et antihcv. Néanmoins, il est fortement conseillé de manipuler ces produits, ainsi que ceux d origine animale (voir contenu de la trousse), comme étant potentiellement infectieux et de les utiliser avec les précautions nécessaires. CONSEILS D ELIMINATION Les résidus de produits chimiques et des préparations sont considérés en général comme des déchets dangereux. L élimination de ce type de substances doit se faire selon la réglementation en vigueur. Il faut consulter les organismes agréés pour connaître le moyen de s en débarrasser. Date de mise à jour: PKSVPF/
14 LITTÉRATURE Ashley, R.L., Wald, A.: Genital herpes: Review of the epidemic and potential use of typespecific serology. Clin Microbiol Rev 12(1), 18 (1999) Bergström, T., Trybala, E.: Antigenic differences between HSV1 and HSV2 glycoproteins and their importance for typespecific serology. Intervirology 39, (1996) Kimberlin, D.W.: Neonatal Herpes simplex Infection. Clin Microbiol Rev 17(1), 113 (2004) Kriebs, I.M.: Understanding Herpes simplex virus: Transmission, diagnosis and considerations in pregnancy management. Midwifery Womens Health 53(3), (2008) Mertens, T., Haller, O., Klenk, H.D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten , Urban & Fischer Verlag (2004) Petersen. E.E., Doerr, H.W., Gross, G., Petzoldt, D., Weissenbacher, E.R., Wutzler, P.: Der Herpes genitalis. Dt Ärztebl 96, Heft 38, A (1999) Sauerbrei, A., Wutzler, P.: Herpes simplex and varicellazoster virus infections during pregnancy. Current concepts of prevention, diagnosis and therapy. Part 1: Herpes simplex virus infections. Med Microbiol Immunol 196(2), 8994 (2007) Wutzler, P., Sauerbrei, A., Eichhorn, U.: Virologische Diagnostik der Herpes simplexvirusenzephalitis. Mikrobiologe 9, 1115 (1999) Wutzler, P., Doerr, H.W., Färber, I., Eichhorn, U., Helbig, B., Sauerbrei, A.: Seroprevalence of herpes simplex virus type 1 and type 2 in selected German populations relevance for incidence of genital herpes. J Med Virol 61, (2000) 104PKSVPF/
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