TD de Biologie Moléculaire : Etude de la régulation de la Transferrine

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1 UE BIO12 TD2 (Transferrine) Année Corinne MAUREL-ZAFFRAN L2 SV TD de Biologie Moléculaire : Etude de la régulation de la Transferrine La figure 1 vous rappelle la régulation de l expression de la Ferritine et de la Transferrine que vous avez vue en cours. Les figures 2A et 2B montrent la structure secondaire des IRE se trouvant sur les ARNm de la Ferritine et de la Transferrine. Les figures 4 et 7 présentent les résultats d expériences qui ont contribué à la compréhension du mécanisme de régulation de la transferrine. Analyse de la figure 4 : «Gel shift assay» D après la légende de la figure 4 : 1- Enumérez les différents réactifs biologiques nécessaires pour réaliser cette expérience. On dispose de la séquence ADN du 3 UTR du gène de la TfN sous clonée dans un plasmide (figure 5) dont la carte est présentée figure 6. A partir de ce plasmide, une transcription in vitro est réalisée pour synthétiser l ARN sens et anti-sens de la séquence correspondante. 1a- Quels sont les réactifs utilisés pour la synthèse de ces ARN? 1b- Sur la figure 6B, surlignez le brin qui sera utilisé comme brin matrice par l ARN polymérase pour synthétiser l ARN anti-sens. Quelle ARN polymérase doit-on utiliser dans ce cas? 1c- Même question pour la synthèse de l ARN sens. 1d- Comment feriez vous pour obtenir la sonde ARN marquée correspondant au 85 nucléotides du 5 UTR du gène de la ferritine? 2- Expliquez en quoi consistent les expériences réalisées (piste par piste). Aidez-vous de la figure 3 qui illustre le principe de l expérience du gel retard avec de l ADN (= gel shift assay). 3- Analysez les résultats et donnez une conclusion à cette expérience. Analyse de la figure 7 : «Assessment of iron regulation» D après la légende de la figure 7 : 1- Enumérez les différents réactifs biologiques nécessaires pour réaliser cette expérience. 2- Pourquoi traite-t-on les cellules avec de l Hemin, ou avec de la desferrioxamine.? 3- Expliquez en quoi consistent les expériences réalisées. 4- Est ce que le résultat obtenu avec la construction contrôle est compatible avec ce que vous connaissez sur la régulation de la transferrine? Expliquez pourquoi? 5- Analysez les résultats obtenus avec les autres constructions et concluez. 1

2 Figure 1: Rappel sur la régulation de l expression de la Ferritine et de la Transferrine (TfR). La Ferritine est une protéine qui permet le stockage du fer dans la cellule. La Transferrine est une protéine à la surface des cellules responsable de la capture du fer. A: en présence de Fer dans la cellule IRE-BP ne se fixe pas sur ses sites IRE (Iron Response Element) B: en absence de Fer dans la cellule IRE-BP se fixe sur ses sites IRE ARNm de la Ferritine IRE+IRE-BP IRE La protéine de la Ferritine est traduite normalement, le Fer peut être stocké dans la cellule. IRE-BP bloque l initiation de la traduction. Elle empêche le balayage de la région 5 UTR par le complexe de pré-initiation => La Ferritine n est pas traduite. ARNm de la Transferrine IRE IRE+IRE-BP Dans les cellules ravitaillées en fer, IRE-BP a peu d affinité pour ses sites qui se trouvent en 3 de l ARNm. l ARNm de la transferrine est alors rapidement dégradé. Le Fer ne rentre plus dans la cellule. La fixation d IRE-BP sur ses sites en 3 permet la stabilisation de l ARNm => La transferrine est traduite et la cellule peut être ravitaillée en Fer. 2

3 Figure 2A: Structure secondaire du 3 UTR de l ARNm de la Transferrine humaine Figure 2B: Structure de l IRE de l ARNm de la Ferritine humaine G U A G C U AU AU CG UG UA C U CG CG U UA UA 5 3 3

4 Figure 3: Electrophoretic-mobility shift assay: A sample containing radiolabelled fragments of DNA is divided into two, and one half of the sample is incubated with a protein that binds to a specific DNA sequence. Samples are then analyzed by electrophoresis in a non denaturing gel so that the protein remains bound to DNA. Protein binding is detected by the slower migration of DNA-protein complexes compared to that of free DNA. Only a fraction of the DNA in the sample is actually bound to protein, so both DNA protein complexes and free DNA are detected following incubation of the DNA with protein. Figure 4: The iron regulatory region of the 3' UTR of the human TfR mrna competes with the ferritin IRE for specific binding of a cytoplasmic protein. A labeled 85 nucleotides RNA from the 5' UTR of the human ferritin containing a single IRE was incubated with cytoplasmic extract from human cells in the presence of no unlabeled competitor RNA (lane 1) or a 500-fold excess of unlabeled sense (lane 2) or antisense (lane 3) RNA corresponding to the 3 UTR of the human TfR mrna. Samples were electrophoresed in a non denaturing 4% acrylamide gel and visualized by autoradiography. The specific complex is indicated by the arrow. 4

5 Figure 5: 5

6 Figure 6A: Structure simplifiée du gène de la transferrin humaine (il contient 19 exons et sa région transcrite s étend sur plus de 35kb) 5 +1 ATG brin complémentaire du brin matrice STOP 3 3 brin matrice de l ARN Pol II 5 Figure 6B: Sous-clonage du 3 UTR du gène de la TfN dans un plasmide du type pgem-t (voir fig 5) 3 UTR TfN T7 SP6 Plasmide 6

7 Construct Regulation mrna Hm Df Protein Hm Df Controle Figure 7: Deletion analysis of the 678 nucleotides regulatory region of the transferrin (TfR) mrna. Plasmids from which various segments of the regulatory region were transfected into mouse fibroblasts. Regulation of TfR by iron was assessed by treating cells with an iron source, the hemin (Hm) or an iron chelator, the desferrioxamine (Df) overnight. mrna analysis are performed by Northern blot hybridized with a 32P-labeled human TfR cdna probe. Level of TfR protein is analyzed by westernblot. The schematic diagrams refer to the structure of the 678 nucleotides iron regulatory region within the TfR 3'UTR. The is present in all constructs. The five IREs are labeled A-E. Deleted segments have been omitted from the schematic. Construct containing the full 678 nucleotides regulatory region is noted «Controle». The TfR sequences deleted from the other plasmid constructs are named 1 to 5. 7